ChIP-exo

الموسوعة الحرة
سير عمل ChIP-exo

تقنية ChIP-exo هي طريقة تعتمد على ترسيب الكروماتين المناعي لتحديد مواقع ارتباط بروتين معين ( عامل نسخ ) بالجينوم . وهي تعديل لبروتوكول ChIP-seq ، حيث تُحسّن دقة تحديد مواقع الارتباط من مئات الأزواج القاعدية إلى ما يقارب زوجًا قاعديًا واحدًا. وتعتمد هذه التقنية على استخدام الإكسونوكليازات لتحليل خيوط الحمض النووي المرتبط بالبروتين في الاتجاه 5'-3' وصولًا إلى عدد قليل من النيوكليوتيدات من موقع ارتباط البروتين. ويتم تحديد نيوكليوتيدات الأطراف المعالجة بالإكسونوكلياز باستخدام مزيج من تقنيات تسلسل الحمض النووي ، والمصفوفات الدقيقة ، وتفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR) . ثم تُسقط هذه التسلسلات على الجينوم لتحديد مواقع ارتباط البروتين.

نظرية

تُستخدم تقنيات الترسيب المناعي للكروماتين (ChIP) منذ عام 1984 [ 1 ] للكشف عن تفاعلات البروتين مع الحمض النووي. وقد ظهرت العديد من التحسينات على تقنية ChIP لتحسين جودة النتائج. أحد هذه التحسينات هو تقنية ChIP-on-chip (ChIP-chip)، التي تجمع بين تقنية ChIP وتقنية المصفوفات الدقيقة. تتميز هذه التقنية بحساسية ونوعية محدودتين، خاصةً في الكائنات الحية حيث تُقيّد المصفوفات الدقيقة بوجود آلاف البروتينات في النواة، مما يؤدي إلى ارتفاع معدل النتائج الإيجابية الكاذبة. [ 2 ] ثم ظهرت تقنية ChIP-seq (ChIP-seq)، التي تجمع بين تقنية ChIP وتقنية التسلسل عالي الإنتاجية. [ 3 ] ومع ذلك، فإن الطبيعة غير المتجانسة لقطع الحمض النووي المجزأة تحدد مواقع الارتباط بدقة تصل إلى ±300 زوج قاعدي، مما يحد من النوعية. ثانيًا، يُمثل الحمض النووي الملوث مشكلة خطيرة نظرًا لأن عددًا قليلًا جدًا من المواقع الجينية يرتبط بالبروتين المستهدف، مما يجعل أي حمض نووي جينومي غير محدد مصدرًا مهمًا للضوضاء الخلفية. [ 4 ]

لمعالجة هذه المشاكل، قام ري وبو بتعديل فحص الحماية الكلاسيكي للنيوكلياز لتطوير ChIP-exo. [ 5 ] تعتمد تقنية ChIP الجديدة هذه على إكسونوكلياز لامدا الذي يقوم بتحليل الحمض النووي المزدوج غير المرتبط فقط، وفي جميع الاتجاهات من 5′ إلى 3′ .

سير العمل

رقاقة

تُربط الخلايا داخل الجسم الحي باستخدام الفورمالديهايد لربط البروتينات بالحمض النووي (DNA) بروابط تساهمية في مواقع ارتباطها الطبيعية عبر الجينوم. ثم تُجمع الخلايا وتُفتح، ويُقطع الكروماتين ويُذاب باستخدام الموجات فوق الصوتية . بعد ذلك، يُستخدم جسم مضاد لترسيب البروتين المطلوب (يمكن أن يكون تعديل الخلايا وراثيًا باستخدام علامة محددة مفيدًا للترسيب المناعي)، بالإضافة إلى الحمض النووي المرتبط. ثم تُربط محولات تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR) للحمض النووي بالأطراف، والتي تعمل كنقطة بدء لتخليق سلسلة الحمض النووي الثانية بعد هضم الإكسونوكلياز. يقوم إكسونوكلياز لامدا بهضم سلسلتي الحمض النووي المزدوجتين من الطرف 5′ حتى يتوقف الهضم عند حدود التفاعل التساهمي بين البروتين والحمض النووي. يتم تحلل معظم الحمض النووي الملوث بإضافة إكسونوكلياز ثانٍ متخصص في سلسلة مفردة. بعد عكس عملية الربط المتقاطع، تُمدد البادئات الخاصة بمحولات تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR) لتكوين حمض نووي مزدوج السلسلة، ويُربط محول ثانٍ بالنهايات 5′ لتحديد الموقع الدقيق لتوقف هضم الإكسونوكلياز. ثم تُضخّم المكتبة بواسطة تفاعل البوليميراز المتسلسل، وتُحدد النواتج بواسطة التسلسل عالي الإنتاجية . تتيح هذه الطريقة دقة تصل إلى زوج قاعدي واحد لأي موقع ارتباط بروتيني داخل أي جينوم، وهي دقة أعلى بكثير من دقة تقنيتي ChIP-chip وChIP-seq.

التسلسل

تعتمد تقنية ChIP-exo على تسلسل القراءات القصيرة (مثل تقنية Illumina NGS). وتكون متطلبات التسلسل أقل في تقنية ChIP-exo مقارنةً بتقنيات أخرى مثل ChIP-seq، وذلك لأن انخفاض "التداخل" بشكل كبير في تقنية ChIP-exo ذات الدقة العالية يعني أن عملية أخذ عينات من شظايا الحمض النووي لبناء مكتبة الحمض النووي تكون أكثر تركيزًا على المواقع المرتبطة بالهدف (قد يختلف هذا التأثير باختلاف الأهداف). [ 6 ]

بالنسبة لبيانات التسلسل المزدوج من تحضير ChIP-exo القياسي، يُشير الطرف 5' للقراءة الأولى المُتسلسلة من شظايا الحمض النووي إلى موضع موقع الربط المتقاطع (موقع توقف هضم الإكسونوكلياز لامدا). يُحسّن التسلسل المزدوج من قابلية تحديد مواقع التسلسل وخصوصية محاذاة القراءات، خاصةً بالنسبة للجينومات الكبيرة.

البروتوكولات

ChIP-exo 1.x

يُحسّن ChIP-exo 1.x من تقنية ChIP-seq من خلال توليد بيانات ذات دقة مكانية أعلى عبر إضافة خطوة هضم باستخدام إنزيم لامدا إكسونوكلياز. تُمكّن هذه الدقة العالية من رصد تنظيم العوامل داخل المُركّب. في حين صُمّم الإصدار 1.0 في الأصل لمنصة ABI SOLiD ، يجعل ChIP-exo 1.1 التحليل متوافقًا مع منصة Illumina NGS. [ 5 ] [ 6 ]

ChIP-exo 2.x (ChIP-nexus)

تستخدم تقنية ChIP-nexus مكتبة DNA دائرية بدلاً من الخطية، وتزيد من كفاءة ربط المحولات عبر إنزيم CircLigase. مع ذلك، يتطلب هذا التحليل هضمًا إضافيًا باستخدام إنزيمات نوكلياز داخلية، وتشير البيانات المنشورة لتقنية ChIP-nexus إلى فقدان البيانات بسبب رداءة جودة الباركود. [ 7 ]

ChIP-exo 3.x

تستخدم تقنية ChIP-exo 3.x ربط المحولات بخطوة واحدة باستخدام تقنية التجزئة Tn5 . يستخدم هذا الإصدار من ChIP خطوات أقل من البروتوكولات السابقة مع الحفاظ على دقة عالية. ومع ذلك، قد تكون المكتبات الناتجة غنية بالقطع الطويلة، نظرًا لأن التجزئة بواسطة Tn5 قد تحدث بتردد أعلى لهذه القطع. [ 6 ]

ChIP-exo 4.x

يهدف ChIP-exo 4.x إلى تبسيط عملية بناء المكتبات وتجنب تحيزات مكتبة Tn5. وقد تم دمج ربط قالب الحمض النووي أحادي السلسلة في سير العمل. يُعد ChIP-exo 4.x أبسط إصدارات ChIP-exo، ولكن قد يُسبب الإصدار 4.0 بعض الإعاقات الفراغية للمُهايئ، وقد يكون الإصدار 4.1 أقل دقة. [ 6 ]

ChIP-exo 5.0

طُوِّر برنامج ChIP-exo 5.0 لتحسين الدقة عن طريق تقليل ظاهرة "التشوه الجانبي" الموجودة في الإصدارين 3.x و4.x. وقد تم تقليل الخطوات الإنزيمية بشكل كبير، مما أدى إلى زيادة إنتاجية المكتبة بشكل ملحوظ ورفع تركيز الإشارة إلى أقصى حد. ويُقدِّم الإصدار 5.0 ما اعتبره الباحثون الحل الأمثل لتحقيق دقة عالية مع بروتوكول مُبسَّط وقت النشر. [ 6 ]

المزايا

  • دقة عالية: أظهرت تقنية ChIP-exo قدرةً على تحديد مواقع ارتباط البروتين بدقة تصل إلى زوج قاعدي واحد. وهذا على عكس تقنية ChIP-seq التي لا تستطيع تحديد موقع ارتباط البروتين إلا بدقة تصل إلى ±300 زوج قاعدي. [ 4 ]
  • انخفاض معدل النتائج الإيجابية الخاطئة: قد يؤدي تلوث شظايا الحمض النووي غير المرتبطة بالبروتين إلى ارتفاع معدل النتائج الإيجابية والسلبية الخاطئة في تجارب ChIP. إن إضافة الإكسونوكليازات إلى العملية لا تُحسّن دقة تحديد مواقع الارتباط فحسب، بل تُزيل أيضًا الحمض النووي الملوث من المحلول قبل التسلسل. [ 4 ]
  • من المرجح أن يتم الكشف عن البروتينات التي ترتبط بشكل غير فعال بقطعة من النيوكليوتيدات بواسطة تقنية ChIP-exo. وقد أتاح ذلك، على سبيل المثال، التعرف على مواقع ارتباط عامل النسخ CTCF أكثر مما تم اكتشافه سابقًا. [ 5 ]
  • متطلبات تسلسل أقل: نظرًا للدقة العالية وانخفاض التشويش، فإن الحاجة إلى عمق تغطية تسلسل أقل عند استخدام ChIP-exo. [ 4 ]
  • معلومات عن معقدات البروتين/العوامل المساعدة: قد توفر بيانات ChIP-exo (القمم الرئيسية) معلومات حول مواقع تفاعل البروتينات على الحمض النووي. كما قد تُظهر بيانات ChIP-exo مواقع الارتباط غير المباشر للبروتينات الثانوية ("البروتينات المرتبطة") في معقد مع هدف ChIP (القمم الثانوية). يمكن أن توفر هذه البيانات أدلة على التفاعل بين البروتينات المتفاعلة. [ 8 ]

القيود

  • الأجسام المضادة: كما هو الحال مع أي طريقة تعتمد على تقنية ChIP، يلزم توفر جسم مضاد مناسب للبروتين المراد دراسته لاستخدام هذه التقنية. لذا، يجب مراعاة خصوصية الأجسام المضادة وتوافرها وقابليتها للتكرار، أو هندسة سلالات تحمل علامات محددة للمستضد. [ 9 ]
  • الربط المتقاطع: تستخدم تقنية ChIP-exo الربط المتقاطع بالفورمالديهايد، مما أثار العديد من المخاوف في مجال علم الجينوم، بما في ذلك تباين كفاءة الربط المتقاطع بشكل كبير بين البروتينات المختلفة. [ 10 ] قد تكون بعض الأهداف "غير مرئية" للأساليب القائمة على تقنية ChIP.
  • الكروماتين المغاير غير القابل للوصول: نظرًا للترابط المتشابك، فإن المناطق الأكثر كثافة في الجينوم، مثل الكروماتين المغاير، يصعب استخلاصها. [ 11 ] ونتيجة لذلك، قد يكون من الصعب ملاحظة دليل على ارتباط الهدف في هذه المناطق باستخدام تقنيات ChIP.
  • إذا احتوى مُركّب البروتين-الحمض النووي على مواقع ربط مُتعددة ضمن حدث ربط واحد، فقد يبدو الأمر كما لو أن هناك أحداث ربط مُنفصلة مُتعددة. ويرجع ذلك على الأرجح إلى تمسخ هذه البروتينات وربطها في أحد مواقع الربط المُتاحة ضمن نفس الحدث. عندئذٍ، يتوقف الإكسونوكلياز عند أحد مواقع الربط، اعتمادًا على الموقع الذي يرتبط به البروتين. [ 5 ] ولتجاوز هذه المشكلة، توجد بعض طرق تحديد القمم (مثل ChExMix) التي تأخذ في الاعتبار خصائص الربط الموضعي لتحديد هذه الخصائص المُتعددة للربط كموقع ربط واحد.

التطبيقات

قدّم ري وبوغ تقنية ChIP-exo من خلال إجراء تحليلات على مجموعة صغيرة من عوامل النسخ: Reb1 وGal4 وPhd1 وRap1 في الخميرة، وCTCF في الإنسان. وُجدت مواقع Reb1 غالبًا في تجمعات، وكانت نسبة إشغال هذه التجمعات أعلى بنحو عشرة أضعاف من المتوقع. وُجدت مواقع ثانوية في التجمعات على بُعد حوالي 40 زوجًا قاعديًا من موقع الارتباط الأساسي. أظهرت أنماط ارتباط Gal4 تفضيلًا قويًا لثلاثة من النيوكليوتيدات الأربعة، مما يشير إلى تفاعل سلبي بين Gal4 والنيوكليوتيد المُستبعد. يتعرف Phd1 على ثلاثة أنماط مختلفة، وهو ما يفسر التقارير السابقة عن غموض نمط ارتباط Phd1. وُجد أن Rap1 يتعرف على أربعة أنماط.

تميل جينات البروتينات الريبوزومية المرتبطة بهذا البروتين إلى استخدام نمط معين ذي تسلسل توافقي أقوى . بينما تستخدم جينات أخرى في كثير من الأحيان مجموعات من أنماط توافقية أضعف، ربما لتحقيق نسبة ارتباط مماثلة. تستخدم أنماط ارتباط CTCF أربع "وحدات". يستخدم نصف مواقع ارتباط CTCF الوحدتين 1 و2، بينما يستخدم النصف الآخر مزيجًا من الوحدات الأربع. يُعتقد أن CTCF يستخدم أصابعه الزنكية للتعرف على تركيبات مختلفة من هذه الوحدات. [ 5 ]

قام ري وبوغ بتحليل بنية وتنظيم معقد ما قبل بدء النسخ (PIC) في جينومات الخميرة Saccharomyces . وباستخدام تقنية ChIP-exo، تمكنا، من بين اكتشافات أخرى، من تحديد سمات شبيهة بـ TATA بدقة في المحفزات التي تم الإبلاغ عن أنها خالية من TATA. [ 12 ]

أساليب مماثلة

بي بي-إكسو

طُوِّرت تقنية PB-exo كنسخة مخبرية من تقنية ChIP-exo (أو نسخة "-exo" من PB-seq [ 13 ] ). يُحضن الحمض النووي الجينومي العاري المنقى والمُعالج بالموجات فوق الصوتية مع عوامل منقاة ، ثم يُربط بالفورمالديهايد. بعد ذلك، يُتبع بروتوكول ChIP-exo القياسي. [ 14 ] وكما هو الحال في PB-seq، توفر PB-exo معلومات حول ارتباط العوامل الجينومية في غياب بنية الكروماتين أو شركاء ارتباط العوامل الثانوية الآخرين.

WhIP-exo

تُشابه تقنية WhIP-exo تقنية PB-exo، إلا أنه بدلاً من البروتين المستهدف المُنقّى أو بالإضافة إليه، يُحضن الحمض النووي الجينومي العاري مع مستخلص الخلية الكاملة الخام. [ 14 ] تُحلل هذه التقنية ارتباط البروتين المستهدف بالجينوم في وجود أي عوامل مساعدة محتملة. ويمكن تحسين مجموعة العوامل المساعدة المتاحة في مستخلص الخلية الكاملة من خلال تعديل الخلفية الجينية للمصدر.

تسلسل PIP

يُعدّ PIP-seq اختبارًا دقيقًا على مستوى النوكليوتيد الواحد، يُحدّد موقع البروتينات المستهدفة المرتبطة بالحمض النووي أحادي السلسلة، وذلك بدمج تقنيات ChIP-seq وChIP-exo وبصمة برمنجنات البوتاسيوم (KMNO₄). [ 15 ] [ 16 ] تعمل معالجة البرمنجنات على أكسدة الثايمين أحادي السلسلة، وبعد ترسيب البروتين المستهدف مناعيًا مع الحمض النووي المتشابك، تعمل معالجة البيبيريدين على قطع شظايا الحمض النووي عند الثايمين المؤكسد. بعد ذلك، يتم تحضير المكتبة وتسلسلها. يُثري الترشيح المعلوماتي الحيوي للقراءات التي يكون النوكليوتيد المرجعي المباشر لها هو الثايمين ("T") الإشارة للشظايا المرتبطة بالسلسلة المفردة، ومن ثم يُمكن إجراء التحليل اللاحق.

انظر أيضاً

مراجع

  1. ↑ جيلمور، د.س.؛ ليس، ج.ت. (1983). "الكشف عن تفاعلات البروتين مع الحمض النووي في الكائنات الحية : توزيع بوليميراز الحمض النووي الريبي على جينات بكتيرية محددة" . وقائع الأكاديمية الوطنية للعلوم . 81 (14): 4275-4279 . Bibcode : 1984PNAS...81.4275G . doi : 10.1073/pnas.81.14.4275 . PMC 345570. PMID 6379641 .  
  2. ↑ ألبرت، آي؛ تي إن مافريتش؛ إل بي تومشو؛ جيه كي؛ إس جيه زانتون؛ إس سي شوستر؛ بي إف بو (2007). "الإعدادات الانتقالية والدورانية للنيوكليوسومات H2A.Z عبر جينوم الخميرة Saccharomyces cerevisiae ". مجلة Nature . 446 (7135): 572–576 . Bibcode : 2007Natur.446..572A . doi : 10.1038/nature05632 . PMID 17392789. S2CID 4416890 .  
  3. ^ رن، ب. ف روبرت . جي جي ويريك. يا أباريسيو؛ إي جي جينينغز؛ أنا سيمون. جي زيتلينجر . جي شرايبر. ن هانيت . إي كان؛ وآخرون . (2000). “موقع الجينوم على نطاق واسع ووظيفة بروتينات ربط الحمض النووي”. علوم . 290 (5500): 2306–2309 . بيب كود : 2000Sci...290.2306R . سيتيسيركس 10.1.1.123.6772 . دوى : 10.1126/science.290.5500.2306 . بميد 11125145 .   
  4. 1 2 3 4 بو، بنجامين (23 ديسمبر 2010). "طرق وأنظمة ومجموعات للكشف عن تفاعلات البروتين مع الأحماض النووية" . منشور طلب براءة اختراع في الولايات المتحدة . براءات اختراع الولايات المتحدة . تم الاطلاع عليه في 17 فبراير 2012 .
  5. 1 2 3 4 5 ري، هو سونغ؛ بي جيه بو (2011). "الكشف عن تفاعلات البروتين-الحمض النووي الشاملة على مستوى الجينوم بدقة النوكليوتيد الواحد" . الخلية . 147 ( 6): 1408-1419 . doi : 10.1016/j.cell.2011.11.013 . PMC 3243364. PMID 22153082 .  
  6. 1 2 3 4 5 روسي، ماثيو؛ ويليام كيه إم لاي؛ بي فرانكلين بو (2018). "تحليلات ChIP-exo المبسطة" . نات كوميون . 9 (1): 2842. Bibcode : 2018NatCo...9.2842R . doi : 10.1038/s41467-018-05265-7 . PMC 6054642. PMID 30030442 .  
  7. ↑ هي، كيي؛ جيف جونستون؛ جوليا زيتلينجر (2015). "تقنية ChIP-nexus تُحسّن من اكتشاف آثار ارتباط عوامل النسخ في الجسم الحي" . مجلة التكنولوجيا الحيوية الطبيعية . 33 (4): 395-401 . doi : 10.1038/nbt.3121 . PMC 4390430. PMID 25751057 .  
  8. ↑ يامادا، نعومي؛ ماثيو جيه روسي؛ نينا فاريل؛ بي فرانكلين بو؛ شون ماهوني (2020). "محاذاة وتحديد كمية أنماط الربط المتقاطع لـ ChIP-exo تكشف عن التنظيم المكاني لمركبات البروتين-DNA" . مجلة أبحاث الأحماض النووية . 48 (20): 11215-11226 . doi : 10.1093/nar/ gkaa618 . PMC 7672471. PMID 32747934 .  
  9. ↑ لاي، ويليام كيه إم؛ لوكا مارياني؛ جيرسون روتشيلد؛ إدوين آر سميث؛ برايان جيه فينترز؛ توماس آر بلاندا؛ براشانت كيه كونتال؛ كايلي بوكلوند؛ جوشوا مايروز؛ سارة إن دويكات؛ كاتلين ميستريتا؛ ماثيو جيه روسي؛ دانييلا جيمس؛ جيمس تي أندرسون؛ سابرينا كيه فانور؛ وانوي تشانغ؛ زيبو تشاو؛ أفاني بي شاه؛ كاثرين نوفيتزكي؛ إيلين ماكنارني؛ مايكل سي كيو؛ علي شيلاتيفارد؛ أوتيا باسو؛ مارثا إل بوليك؛ بي فرانكلين بو (2021). "فحص ChIP-exo لأجسام مضادة لعوامل النسخ من برنامج 887 Protein Capture Reagents Program في الخلايا البشرية" . Genome Res . 31 (9): 1663–1679 . doi : 10.1101/gr.275472.121 . PMC 8415381 . PMID 34426512 .  
  10. ↑ غافريلوف، أليكسي؛ سيرجي ف. رازين؛ جياكومو كافالي (2015). "الربط المتقاطع بالفورمالديهايد في الجسم الحي: حان وقت تحليل الصندوق الأسود" . مجلة علم الجينوم الوظيفي الموجز . 14 (2): 163-165 . doi : 10.1093/bfgp/elu037 . PMC 6090872. PMID 25241225 .  
  11. ↑ مانسيسيدور، أندريس ر؛ فيفيانا آي ريسكا (2022). " إمكانية الوصول إلى الكروماتين: الأساليب والآليات والرؤى البيولوجية" . نواة . 13 (1): 236-276 . doi : 10.1080/19491034.2022.2143106 . PMC 9683059. PMID 36404679 .  
  12. ↑ ري، هو سونغ؛ بي جيه بو (2012). "بنية وتنظيم معقدات ما قبل بدء الترجمة في حقيقيات النوى على مستوى الجينوم" . نيتشر . 483 ( 7389): 295-301 . Bibcode : 2012Natur.483..295R . doi : 10.1038/nature10799 . PMC 3306527. PMID 22258509 .  
  13. ↑ غويرتين، مايكل جيه؛ أندريه إل مارتينز؛ آدم سيبل؛ جون تي ليس (2012). "التنبؤ الدقيق بشدة ارتباط عوامل النسخ القابلة للتحفيز في الجسم الحي" . PLOS Genet . 8 (3) e1002610. doi : 10.1371/journal.pgen.1002610 . PMC 3315474. PMID 22479205 .  
  14. 1 2 روسي، ماثيو جيه؛ لاي، ويليام كيه إم؛ بو، بي فرانكلين (2018). "المحددات الجينومية لربط الحمض النووي المحدد بالتسلسل لعوامل تنظيمية عامة" . أبحاث الجينوم . 28 (4): 497-508 . doi : 10.1101/gr.229518.117 . PMC 5880240. PMID 29563167 .  
  15. ↑ لي، جيان؛ يينغيون ليو؛ هو سونغ ري؛ سايكات كومار ب. غوش؛ لو باي؛ ب. فرانكلين بو؛ ديفيد س. غيلمور (2013). "التنافس الحركي بين معدل الاستطالة وارتباط NELF يتحكم في التوقف القريب من المحفز" . الخلية الجزيئية . 50 (5): 711-22 . doi : 10.1016/j.molcel.2013.05.016 . PMC 3695833. PMID 23746353 .  
  16. ↑ لاي، ويليام كيه إم؛ بو، بي فرانكلين (2017). "التجانس على مستوى الجينوم لمجمعات ما قبل بدء الترجمة 'المفتوحة' لدى الإنسان" . أبحاث الجينوم . 27 (1): 15-26 . doi : 10.1101/gr.210955.116 . PMC 5204339. PMID 27927716 .