فحص الإنزيم

يُعد نشاط الإنزيم مقياسًا لكمية الإنزيم النشط الموجود، وبالتالي فهو يعتمد على ظروف فيزيائية مختلفة، والتي يجب تحديدها .

يتم حسابها باستخدام الصيغة التالية:

${\displaystyle \mathrm {a} =\mathrm {n} _{\text{t}}=\mathrm {r} \times \mathrm {V} }$

أين

${\displaystyle \mathrm {a} }$= نشاط الإنزيم

${\displaystyle \mathrm {n} _{\text{t}}}$= عدد مولات المادة المتفاعلة المتحولة لكل وحدة زمنية

${\displaystyle \mathrm {r} }$= معدل التفاعل

${\displaystyle \mathrm {V} }$حجم التفاعل

وحدة النظام الدولي للوحدات هي الكاتال ، حيث ^يساوي الكاتال الواحد مولًا واحدًا في الثانية، إلا أن هذه الوحدة كبيرة جدًا. أما القيمة الأكثر عملية وشيوعًا فهي وحدة الإنزيم (U) التي ^{تساوي ميكرومولًا واحدًا} في الدقيقة . وتُعادل وحدة الإنزيم الواحدة 16.67 نانوكاتال . ^{[ 1 ]} 

يشير نشاط الإنزيم، كما هو مُقاس بالكاتال، عمومًا إلى نشاط الركيزة المستهدفة الطبيعية المفترضة للإنزيم. ويمكن أيضًا التعبير عن نشاط الإنزيم كنشاط ركائز قياسية معينة، مثل الجيلاتين ، حيث يُقاس بوحدات هضم الجيلاتين (GDU)، أو بروتينات الحليب، حيث يُقاس بوحدات تخثر الحليب (MCU). وتستند وحدات GDU وMCU إلى سرعة هضم غرام واحد من الإنزيم للجيلاتين أو بروتينات الحليب، على التوالي. وتُعادل وحدة GDU واحدة تقريبًا 1.5 وحدة MCU. ^{[ 2 ]}

إن زيادة كمية الركيزة ستزيد من معدل التفاعل مع الإنزيمات، ولكن بمجرد تجاوز نقطة معينة، سيستقر معدل التفاعل لأن كمية المواقع النشطة المتاحة ظلت ثابتة.

يُعد النشاط النوعي للإنزيم وحدة قياس شائعة أخرى. وهو نشاط الإنزيم لكل ملليغرام من البروتين الكلي (معبراً عنه بوحدة ميكرومول ^{/ دقيقة/ مليغرام} ). يُعطي النشاط النوعي مقياساً لنقاء الإنزيم في الخليط. وهو عبارة عن عدد الميكرومولات من الناتج الذي يُشكّله الإنزيم خلال فترة زمنية محددة (بالدقائق) وفي ظل ظروف معينة لكل ملليغرام من البروتينات الكلية. يُساوي النشاط النوعي معدل التفاعل مضروباً في حجم التفاعل مقسوماً على كتلة البروتين الكلي. وحدة النظام الدولي للوحدات هي كاتال/كيلوغرام، ولكن الوحدة الأكثر عملية هي ميكرومول/(مليغرام*دقيقة).

النشاط النوعي هو مقياس لقدرة الإنزيم على المعالجة (قدرة الإنزيم على المعالجة)، عند تركيز ركيزة محدد (عادة ما يكون مشبعًا) ، وعادة ما يكون ثابتًا بالنسبة للإنزيم النقي.

يمكن إجراء عملية معايرة الموقع النشط للتخلص من الأخطاء الناجمة عن الاختلافات في دفعات الاستزراع و/أو طي الإنزيم بشكل خاطئ وما شابه ذلك. تُعد هذه العملية مقياسًا لكمية الإنزيم النشط، ويتم حسابها، على سبيل المثال، بمعايرة كمية المواقع النشطة الموجودة باستخدام مثبط غير قابل للانعكاس. يُعبر عن النشاط النوعي بوحدة ميكرومول/دقيقة ^/ ملغ ^من الإنزيم النشط. إذا كان الوزن الجزيئي للإنزيم معروفًا، فيمكن حساب معدل الدوران ، أو ميكرومول من الناتج في الثانية لكل ميكرومول من الإنزيم النشط، من النشاط النوعي. ويمكن تصور معدل الدوران على أنه عدد مرات قيام كل جزيء إنزيم بدورة تحفيزية في الثانية الواحدة.

معدل التفاعل هو تركيز المادة المتفاعلة التي تختفي (أو المنتج الناتج) لكل وحدة زمنية (مول لتر ⁻¹ ثانية ⁻¹ ).

نسبة النقاء هي 100% × (النشاط النوعي لعينة الإنزيم / النشاط النوعي للإنزيم النقي). تتميز العينة غير النقية بنشاط نوعي أقل لأن جزءًا من كتلتها ليس إنزيمًا. إذا عُرف النشاط النوعي للإنزيم النقي بنسبة 100%، فإن العينة غير النقية ستمتلك نشاطًا نوعيًا أقل، مما يسمح بحساب النقاء والحصول على نتيجة واضحة.

في التحليلات الطيفية الضوئية ، يُتابع مسار التفاعل بقياس التغير في كمية الضوء التي يمتصها محلول التحليل. إذا كان هذا الضوء ضمن نطاق الطيف المرئي، يُمكن ملاحظة تغير في لون المحلول، وتُسمى هذه التحليلات بالتحليلات اللونية . يُعد تحليل MTT ، وهو تحليل أكسدة واختزال يستخدم صبغة التترازوليوم كركيزة، مثالًا على التحليلات اللونية.

يُستخدم ضوء الأشعة فوق البنفسجية غالبًا، لأن الإنزيمين المساعدين الشائعين NADH و NADPH يمتصان ضوء الأشعة فوق البنفسجية في صورتهما المختزلة ، ولكنهما لا يمتصانه في صورتهما المؤكسدة . وبالتالي، يمكن قياس نشاط إنزيم الأكسدة والاختزال الذي يستخدم NADH كركيزة من خلال تتبع انخفاض امتصاص الأشعة فوق البنفسجية عند طول موجي 340  نانومتر أثناء استهلاكه للإنزيم المساعد. ^{[ 4 ]}

المقايسات المباشرة مقابل المقايسات المزدوجة

حتى عندما لا يُؤدي تفاعل الإنزيم إلى تغيير في امتصاص الضوء، فإنه لا يزال من الممكن استخدام قياس طيفي ضوئي للإنزيم من خلال استخدام طريقة قياس مُقترنة . في هذه الطريقة، يُستخدم ناتج أحد التفاعلات كركيزة لتفاعل آخر يسهل الكشف عنه. على سبيل المثال، يُظهر الشكل 1 طريقة القياس المُقترنة لإنزيم هيكسوكيناز ، والذي يُمكن قياسه عن طريق ربط إنتاجه لجلوكوز-6-فوسفات بإنتاج NADPH، باستخدام إنزيم نازع هيدروجين جلوكوز-6-فوسفات .

التألق هو انبعاث ضوء ذي طول موجي معين من جزيء ما بعد امتصاصه ضوءًا ذي طول موجي مختلف. تستخدم المقايسات الفلورية الفرق في تألق المادة المتفاعلة عن تألق الناتج لقياس تفاعل الإنزيم. تتميز هذه المقايسات عمومًا بحساسية أعلى بكثير من المقايسات الطيفية الضوئية، ولكنها قد تتأثر بتداخلات ناتجة عن الشوائب وعدم استقرار العديد من المركبات الفلورية عند تعرضها للضوء.

ومن الأمثلة على هذه التحليلات استخدام مرافقات الإنزيم النيوكليوتيدية NADH وNADPH. في هذه الحالة، تكون الأشكال المختزلة متألقة، بينما تكون الأشكال المؤكسدة غير متألقة. وبالتالي، يمكن تتبع تفاعلات الأكسدة بانخفاض في التألق، وتفاعلات الاختزال بزيادة فيه. ^{[ 5 ]} كما تتوفر ركائز اصطناعية تُطلق صبغة متألقة في تفاعل محفز بالإنزيم، مثل 4-ميثيل أومبيليفيريل-β-D-جالاكتوزيد لتحليل β-جالاكتوزيداز، أو 4-ميثيل أومبيليفيريل-بيوتيرات لتحليل ليباز كانديدا روغوزا . ^{[ 6 ]}

قياس السعرات الحرارية هو قياس الحرارة المنبعثة أو الممتصة في التفاعلات الكيميائية. وتُعدّ هذه القياسات عامة جدًا، إذ تتضمن العديد من التفاعلات تغيرًا في الحرارة، وباستخدام مقياس السعرات الحرارية الدقيق، لا يلزم سوى كمية قليلة من الإنزيم أو المادة المتفاعلة. ويمكن استخدام هذه القياسات لقياس التفاعلات التي يستحيل قياسها بأي طريقة أخرى. ^{[ 7 ]}

التلألؤ الكيميائي هو انبعاث الضوء الناتج عن تفاعل كيميائي. تُنتج بعض التفاعلات الإنزيمية ضوءًا، ويمكن قياس هذا الضوء للكشف عن تكوّن الناتج. تتميز هذه الأنواع من التحليلات بحساسية عالية للغاية، إذ يمكن التقاط الضوء الناتج بواسطة فيلم فوتوغرافي على مدى أيام أو أسابيع، ولكن يصعب تحديد كميته بدقة، لأنه لا يمكن رصد كل الضوء المنبعث من التفاعل.

يُعد الكشف عن بيروكسيداز الفجل باستخدام التألق الكيميائي الإنزيمي (ECL) طريقة شائعة للكشف عن الأجسام المضادة في تقنية ويسترن بلوت . ومن الأمثلة الأخرى إنزيم لوسيفيراز ، الموجود في اليراعات، والذي يُنتج الضوء بشكل طبيعي من مادة لوسيفيرين التي يعمل عليها.

يقيس تشتت الضوء الساكن حاصل ضرب متوسط ​​الكتلة المولية وتركيز الجزيئات الكبيرة في المحلول. عند ثبات التركيز الكلي لنوع واحد أو أكثر خلال فترة القياس، تُعدّ إشارة التشتت مقياسًا مباشرًا لمتوسط ​​الكتلة المولية للمحلول، والتي تتغير مع تكوّن المعقدات أو تفككها. وبالتالي، يُحدد القياس نسبة العناصر في المعقدات، بالإضافة إلى حركيتها. تُعدّ فحوصات تشتت الضوء لحركية البروتين تقنية عامة جدًا لا تتطلب استخدام إنزيم.

تقيس تقنية الترحيل الحراري الميكروي (MST) ^{[ 8 ]} حجم وشحنة وإنتروبيا ترطيب الجزيئات/الركائز عند حالة التوازن. ^{[ 9 ]} تتغير حركة الترحيل الحراري للركيزة الموسومة بالفلورة بشكل ملحوظ عند تعديلها بواسطة إنزيم. ويمكن قياس هذا النشاط الإنزيمي بدقة زمنية عالية في الوقت الحقيقي. ^{[ 10 ]} يتميز استهلاك المواد في طريقة MST البصرية بالكامل بانخفاضه الشديد، إذ لا يتطلب الأمر سوى 5 ميكرولتر من حجم العينة و10 نانومول من تركيز الإنزيم لقياس ثوابت معدل النشاط والتثبيط الإنزيمي. وتتيح تقنية MST للمحللين قياس تعديل ركيزتين مختلفتين في آن واحد ( التحليل المتعدد ) إذا كانت كلتا الركيزتين موسومتين بفلوروفورات مختلفة. وبالتالي، يمكن إجراء تجارب تنافس الركائز.

تقيس المقايسات الإشعاعية دمج النشاط الإشعاعي في المواد المتفاعلة أو إطلاقه منها. وتُعدّ النظائر المشعة الأكثر استخدامًا في هذه المقايسات هي الكربون ^-14 ، والفوسفور ^-32 ، والكبريت ^-35 ، واليود ^-125 . ونظرًا لقدرة النظائر المشعة على وسم ذرة واحدة من المادة المتفاعلة بدقة، فإن هذه المقايسات تتميز بحساسية ودقة عاليتين. وتُستخدم بكثرة في الكيمياء الحيوية، وغالبًا ما تكون الطريقة الوحيدة لقياس تفاعل محدد في المستخلصات الخام (المخاليط المعقدة من الإنزيمات الناتجة عن تحلل الخلايا).

عادة ما يتم قياس النشاط الإشعاعي في هذه الإجراءات باستخدام عداد الوميض .

تقيس التحليلات الكروماتوغرافية تكوين المنتج بفصل خليط التفاعل إلى مكوناته باستخدام الكروماتوغرافيا . ويتم ذلك عادةً باستخدام كروماتوغرافيا السائل عالي الأداء (HPLC)، ولكن يمكن أيضًا استخدام تقنية كروماتوغرافيا الطبقة الرقيقة الأبسط . على الرغم من أن هذه الطريقة قد تتطلب كمية كبيرة من المادة، إلا أنه يمكن زيادة حساسيتها عن طريق وسم الركائز/المنتجات بعلامة مشعة أو فلورية. كما تم تحسين حساسية التحليل أيضًا عن طريق التحول إلى بروتوكولات تستخدم أجهزة كروماتوغرافية محسّنة (مثل كروماتوغرافيا السائل فائق الضغط) التي تعمل بضغط ضخ أعلى بعدة أضعاف من أجهزة HPLC (انظر: كروماتوغرافيا السائل عالي الأداء#ضغط الضخ ). ^{[ 11 ]}

لا تتحمل معظم الإنزيمات تركيزات الملح العالية للغاية، إذ تتداخل الأيونات مع الروابط الأيونية الضعيفة للبروتينات . وتكون الإنزيمات النموذجية نشطة في تركيزات ملح تتراوح بين 1 و500 ملي مولار. وكما هو معتاد ، توجد استثناءات، مثل الطحالب والبكتيريا المحبة للملوحة .

تعمل جميع الإنزيمات ضمن نطاق حراري محدد لكل كائن حي. وتؤدي الزيادة في درجة الحرارة عمومًا إلى زيادة سرعة التفاعل. إلا أن هذه الزيادة محدودة، إذ تؤدي درجات الحرارة المرتفعة إلى انخفاض حاد في سرعة التفاعل. ويعود ذلك إلى تغير بنية البروتين نتيجة لتفكك الروابط الأيونية والهيدروجينية الضعيفة التي تُثبّت البنية ثلاثية الأبعاد للموقع النشط للإنزيم. ^{[ 12 ]} تتراوح درجة الحرارة "المثلى" للإنزيمات البشرية عادةً بين 35 و40 درجة مئوية. ويبلغ متوسط ​​درجة حرارة جسم الإنسان 37 درجة مئوية. وتبدأ الإنزيمات البشرية بالتغير بسرعة عند درجات حرارة أعلى من 40 درجة مئوية. أما الإنزيمات المستخلصة من العتائق المحبة للحرارة الموجودة في الينابيع الساخنة، فتكون مستقرة حتى 100 درجة مئوية. ^{[ 13 ]} ومع ذلك، فإن فكرة وجود معدل "مثلى" لتفاعل الإنزيم مضللة، لأن المعدل المُلاحظ عند أي درجة حرارة هو نتاج معدلين: معدل التفاعل ومعدل التغير. إذا استخدمت اختبارًا لقياس النشاط لمدة ثانية واحدة، فسيعطي نشاطًا عاليًا عند درجات الحرارة العالية، ولكن إذا استخدمت اختبارًا لقياس تكوين المنتج على مدار ساعة، فسيعطيك نشاطًا منخفضًا عند درجات الحرارة هذه.    

معظم الإنزيمات حساسة لدرجة الحموضة (pH) ولها نطاقات نشاط محددة. ولكل منها درجة حموضة مثلى. يمكن لدرجة الحموضة أن توقف نشاط الإنزيم عن طريق تغيير بنيته ثلاثية الأبعاد بكسر الروابط الأيونية والهيدروجينية . تعمل معظم الإنزيمات بين درجة حموضة 6 و8؛ إلا أن إنزيم البيبسين في المعدة يعمل بكفاءة مثلى عند درجة حموضة 2، بينما يعمل إنزيم التربسين بكفاءة مثلى عند درجة حموضة 8.

تؤدي زيادة تركيز المادة المتفاعلة إلى زيادة سرعة التفاعل (نشاط الإنزيم). مع ذلك، يحد تشبع الإنزيم من سرعة التفاعل. يصل الإنزيم إلى حالة التشبع عندما تكون المواقع النشطة لجميع الجزيئات مشغولة معظم الوقت. عند نقطة التشبع، لن يتسارع التفاعل مهما زادت كمية المادة المتفاعلة المضافة، وسيصبح منحنى سرعة التفاعل ثابتًا.

تؤدي الكميات الكبيرة من الجزيئات الكبيرة في المحلول إلى تغيير معدلات وثوابت التوازن لتفاعلات الإنزيم، من خلال تأثير يسمى الازدحام الجزيئي الكبير . ^{[ 14 ]}