تجزئة التدفق الميداني

يمكن استنتاج العلاقة بين مجال القوة الفاصلة وزمن الاحتفاظ من المبادئ الأساسية. لنفترض وجود مجموعتين من الجسيمات داخل قناة الفصل بالتدفق الحر. يدفع المجال المتقاطع كلا مجموعتي الجسيمات نحو جدار "التجميع" السفلي. في المقابل، تعمل حركة الانتشار الطبيعي للجسيمات، أو الحركة البراونية ، على مقاومة هذا المجال، مما ينتج عنه حركة معاكسة. عندما تصل عمليتا النقل هاتان إلى حالة التوازن، يقترب تركيز الجسيمات (c) من الدالة الأسية للارتفاع (x) فوق جدار التجميع، كما هو موضح في المعادلة ( 1 ).

${\displaystyle c=c_{0}e^{\frac {-x}{\ell }}}$

1

${\displaystyle \ell }$يمثل الارتفاع المميز لسحابة الجسيمات. ويرتبط هذا بمتوسط ​​الارتفاع الذي تصل إليه سحابة الجسيمات داخل القناة، وذلك فقط عندما تكون قيمة${\displaystyle \ell }$يختلف الأمر بالنسبة لفصل مجموعات الجسيمات. ${\displaystyle \ell }$يمكن ربط كل مكون بالقوة المطبقة على كل جسيم فردي أو بنسبة معامل الانتشار D وسرعة الانجراف U. ^{[ 13 ]}

${\displaystyle \ell ={\frac {kT}{F}}={\frac {D}{U}}}$

2

k هو ثابت بولتزمان ، وT هي درجة الحرارة المطلقة، وF هي القوة المؤثرة على جسيم واحد بواسطة مجال القوة. يوضح هذا كيف أن قيمة الارتفاع المميزة تتناسب عكسيًا مع القوة المطبقة. لذلك، فإن F تتحكم في عملية الفصل . ومن ثم، من خلال تغيير شدة المجال، يمكن التحكم في الفصل للوصول إلى المستويات المثلى.

إن سرعة V لسحابة من الجزيئات هي ببساطة متوسط ​​سرعة التوزيع الأسي المضمن في شكل تدفق مكافئ.

يمكن كتابة زمن الاحتفاظ، t _{r، على النحو التالي:}

${\displaystyle t_{r}={\frac {L}{V}}}$

3

حيث L هو طول القناة.

في تقنية الفصل بالتدفق الحر (FFF)، يُعبّر عن الاحتفاظ عادةً بنسبة الاحتفاظ، وهي زمن الفراغ t₀ ₍ ظهور متتبع غير محتفظ به) مقسومًا على زمن الاحتفاظ tr _. وبالتالي، تصبح معادلة الاحتفاظ كما يلي:

${\displaystyle R={\frac {t_{0}}{t_{r}}}=6\lambda [\operatorname {coth} ({\frac {1}{2\lambda }})-2\lambda ]}$

4

أين${\displaystyle \lambda }$يكون${\displaystyle \ell }$مقسومًا على w، وهو سُمك القناة أو ارتفاعها. استبدال kT/F بدلاً من${\displaystyle \ell }$يوضح ذلك نسبة الاحتفاظ بالنسبة للقوة العرضية المطبقة.

${\displaystyle R=6{\frac {kT}{Fw}}[\coth({\frac {Fw}{2kT}})-2{\frac {kT}{Fw}}]}$

5

لضمان التشغيل الفعال، تتجاوز قيمة سمك القناة w بكثير${\displaystyle \ell }$في هذه الحالة، يقترب الحد الموجود بين القوسين من الواحد. لذلك، يمكن تقريب المعادلة 5 على النحو التالي:

${\displaystyle R=6\lambda =6{\frac {kT}{Fw}}}$

6

وبالتالي، فإن زمن الاحتفاظ (t _r) يتناسب تقريبًا مع القوة (F). ولا يتحقق فصل نطاقي الجسيمات X وY، المُمثلين بالزيادة المحدودة ∆t _r في زمن احتفاظهما، إلا إذا كانت الزيادة في القوة ∆F بينهما كافية. ويكفي لتحقيق ذلك فرق في القوة مقداره 10⁻¹⁶ نيوتن فقط ^.

تعتمد قيمة كل من F و ∆F على خصائص الجسيمات، وشدة المجال، ونوعه. وهذا ما يسمح بتنويع وتكييف التقنية. انطلاقًا من هذا المبدأ الأساسي، تطورت أشكال عديدة من تقنية الفصل بالتدفق الحر (FFF)، تختلف باختلاف طبيعة قوة الفصل المُطبقة ونطاق حجم الجزيئات المستهدفة.

من بين هذه التقنيات، كانت تقنية التدفق المتقطع (Flow FFF) أول تقنية تُطرح تجاريًا. تفصل هذه التقنية الجسيمات بناءً على حجمها، بغض النظر عن كثافتها، ويمكنها قياس الجزيئات الكبيرة في نطاق يتراوح بين 1  نانومتر و1  ميكرومتر. وبهذا، تُعدّ هذه التقنية الفرعية الأكثر تنوعًا بين تقنيات التدفق المتقطع المتاحة. يدخل التدفق العرضي في تقنية التدفق المتقطع عبر مرشح مسامي في أعلى القناة، ويخرج عبر مرشح مخرج غشائي شبه منفذ على جدار التجميع (أي الجدار السفلي). وقد استُبدل التدفق المتناظر بالتدفق غير المتناظر خلال العقدين الماضيين.

طُوِّرت تقنية الفصل بالتدفق الليفي المجوف (HF5) بواسطة لي وآخرون (1974). ^{[ 14 ]} وقد استُخدمت هذه التقنية في تحليل البروتينات والجزيئات الكبيرة الأخرى. وكانت HF5 أول تقنية فصل بالتدفق الليفي المجوف تُطوَّر عام 1974. وتكمن ميزتها في أنها توفر وحدة قناة قابلة للاستخدام لمرة واحدة، ما يُسهِّل استبدالها في التطبيقات الروتينية. ومن عيوبها محدودية خيارات مواد الأغشية، إذ لا تتوفر سوى أغشية بولي إيثر سلفون (PES). وحاليًا، لا تُستخدم HF5 على نطاق واسع، نظرًا لافتقارها إلى المرونة ومحدودية كمية العينة.

من ناحية أخرى، يتميز نظام الفصل بالتدفق غير المتماثل ( AF4 ) بوجود غشاء شبه نفاذ واحد فقط على الجدار السفلي للقناة. وبالتالي، ينشأ التدفق العرضي نتيجة خروج السائل الحامل من أسفل القناة. يوفر هذا النظام فصلًا دقيقًا للغاية ونطاق فصل واسع جدًا. غالبية أجهزة الفصل بالتدفق غير المتماثل المستخدمة حاليًا هي أنظمة AF4. وتتمثل تطبيقاتها الرئيسية في البحث والتطوير الصيدلاني للبروتينات والفيروسات والجسيمات الشبيهة بالفيروسات والجسيمات الشحمية. كما تم دمج AF4 مع كروماتوغرافيا التقارب المناعي المتجانسة لتحليل الحويصلات خارج الخلوية المشتقة من البلازما . وقد تم عزل الحويصلات المشتقة من الصفائح الدموية الموجبة لـ CD61 باستخدام قرص متجانس مضاد لـ CD61، ثم تم فصلها حسب الحجم باستخدام AF4 المقترن بالكشف عن تشتت الضوء الديناميكي متعدد الزوايا. ^{[ 15 ]} استُخدم لاحقًا نظام كروماتوغرافيا المناعة التقاربية الآلي عبر الإنترنت (AF4) لعزل وتجزئة كلٍّ من الحويصلات المشتقة من الصفائح الدموية الموجبة لـ CD61 والحويصلات الموجبة لـ CD9 إلى مجموعات فرعية بناءً على الحجم. ^{[ 16 ]} خضعت أجزاء الحويصلات خارج الخلوية الناتجة لمزيد من التحليل باستخدام مطيافية رامان والكروماتوغرافيا الغازية ثنائية الأبعاد الشاملة . ^{[ 17 ]} كما استُخدمت المجموعات الفرعية من الحويصلات خارج الخلوية المجزأة بتقنية AF4 في دراسات ميزان البلورات الكوارتزية الدقيقة لدراسة ارتباط الأجسام المضادة وICAM-1. ^{[ 18 ]}

يمكن تطبيق تقنية AF4 في المذيبات المائية والعضوية، وبالتالي يمكن فصل البوليمرات العضوية باستخدامها. تتوفر تقنية الفصل بالتدفق الميداني غير المتماثل عند درجات حرارة عالية لفصل البوليمرات ذات الكتلة المولية العالية والفائقة، والتي تذوب عند درجات حرارة أعلى من 150 درجة مئوية.

تعتمد تقنية الفصل الحراري بالتدفق المنفصل (FFF)، كما يوحي اسمها، على تطبيق تدرج حراري على القناة لإنشاء قوة فصل. حيث يتم تسخين الجدار العلوي للقناة وتبريد الجدار السفلي، مما يدفع البوليمرات والجسيمات نحو الجدار البارد بفعل الانتشار الحراري. وقد طُوّرت هذه التقنية في الأصل لفصل البوليمرات الاصطناعية في المذيبات العضوية. وتتميز تقنية الفصل الحراري بالتدفق المنفصل عن غيرها من تقنيات FFF بقدرتها على فصل الجزيئات الكبيرة بناءً على كلٍ من الكتلة المولية والتركيب الكيميائي، مما يسمح بفصل أجزاء البوليمر ذات الوزن الجزيئي نفسه. واليوم، تُعد هذه التقنية مثالية لتوصيف البوليمرات والهلاميات والجسيمات النانوية.

تتمثل إحدى المزايا الرئيسية لتقنية الفصل الحراري بالتدفق المتقطع (ThFFF) في بساطة أبعاد قناة الفصل ودقتها العالية، مما يُتيح معايرة شاملة بين المختبرات والأجهزة المختلفة، لأن ثوابت معايرة ThFFF تصف بدقة نسبة معامل الانتشار الجزيئي العادي D إلى معامل الانتشار الحراري (أو الحركة الحرارية) D_{_T} ، وهما يعتمدان فقط على نوع البوليمر. ولذلك، فإن معايرة ThFFF الشاملة قابلة للتطبيق على مختلف الأجهزة والمختبرات، بينما تقتصر معايرة كروماتوغرافيا الاستبعاد الحجمي المعروفة على نوع البوليمر فقط على نفس الجهاز. ^{[ 19 ]}

تُعدّ تقنية الفصل بالخلايا الرقيقة ذات التدفق المنفصل (SPLITT) ^{[ 20 ]} تقنية تحضيرية خاصة بتقنية الفصل بالتدفق المنفصل (FFF)، تستخدم الجاذبية ^{[ 21 ]} أو الكهرباء ^{[ 22 ]} أو فروق الانتشار لفصل الجسيمات التي يزيد حجمها عن 1 ميكرومتر بشكل مستمر. يحتوي نظام SPLITT على مدخلين ومخرجين. ويتم ذلك عن طريق ضخ العينة المغمورة في سائل إلى أحد المدخلين في بداية القناة بمعدل تدفق منخفض، بينما يتم في الوقت نفسه ضخ سائل ناقل إلى المدخل الثاني بمعدل تدفق أعلى بكثير. ومن خلال التحكم في نسب معدلات تدفق تياري المدخلين وتياري المخرجين، يمكن التحكم في عملية الفصل، ويتم فصل مكونات العينة إلى جزأين مختلفين في الحجم. إن استخدام الجاذبية وحدها كقوة فصل يجعل تقنية SPLITT أقل تقنيات FFF حساسية، حيث تقتصر على الجسيمات التي يزيد حجمها عن 1  ميكرومتر.

في تقنية الفصل بالطرد المركزي (FFF)، يُولَّد مجال الفصل بواسطة قوة الطرد المركزي. تأخذ القناة شكل حلقة تدور بسرعات دوران قابلة للبرمجة أثناء التشغيل. يُضخ التدفق والعينة إلى القناة ويُخضعان للطرد المركزي، مما يسمح للمشغل بفصل الجسيمات حسب كتلتها (حجمها وكثافتها). تكمن ميزة تقنية الفصل بالطرد المركزي في دقة تحديد الحجم العالية التي يمكن تحقيقها بتغيير القوة المُطبقة، حيث يتناسب حجم الجسيمات طرديًا مع مكعب كتلتها.

تكمن الميزة الفريدة لتقنية الفصل بالطرد المركزي في قدرتها على تحقيق دقة عالية عند توفر كثافة كافية للطفو. وهذا يسمح بفصل الجسيمات التي لا يتجاوز الفرق في حجمها 5%.

تتميز تقنية الفصل بالطرد المركزي (FFF) بإمكانية فصل الجسيمات والجزيئات الكبيرة بناءً على كثافة الجسيمات، وليس فقط على حجمها. في هذه الحالة، يمكن فصل جسيمين نانويين من الذهب والفضة متطابقين في الحجم إلى قمتين، وفقًا لاختلافات الكثافة بينهما.

في عمليات الفصل بتقنية AF4، تكون نسبة الكتلة إلى الزمن 1:1. بإضافة عامل الكثافة إلى تقنية الفصل بالطرد المركزي FFF، تصبح النسبة أقرب إلى نسبة الكتلة إلى الزمن مرفوعة للأس 3. ينتج عن ذلك تمييز أكبر بكثير بين القمم، مما يؤدي إلى تحسين كبير في الدقة. يُعد هذا مفيدًا بشكل خاص للمنتجات الجديدة، مثل المواد المركبة والبوليمرات المغلفة التي تحتوي على جسيمات نانوية، أي جسيمات قد لا تختلف في الحجم ولكنها تختلف في الكثافة. بهذه الطريقة، يمكن فصل جسيمين متطابقين في الحجم إلى قمتين، شريطة اختلاف كثافتهما.

يكمن قيد هذه الطريقة في الحد الأدنى لحجم الجسيمات، والذي يعتمد على كثافة العينة. وبالنسبة للعينات البيولوجية تحديداً، يتراوح هذا الحد بين 20 و50  نانومتر في القطر.

في تقنية الفصل الكهربائي بالتدفق المتقطع (FFF)، يُطبَّق تيار كهربائي عرضي (مستمر) يُولِّد مجالًا كهربائيًا. وبناءً على شحنة مكونات العينة، تتولد سرعة انجراف كهربائي ، تُعاكسها حركة الانتشار البراونية، لذا يعتمد الفصل على نسبة الحركة الكهربائية إلى الحجم. وقد كان استخدام تقنية الفصل الكهربائي بالتدفق المتقطع محدودًا، ونادرًا ما تُستخدم حاليًا. وقد طُوِّرت تعديلات أخرى، منها تقنية الفصل الكهربائي بالتدفق المتقطع الدوري، حيث يُطبَّق تيار متردد خاص . وتتيح هذه التقنية الفصل وفقًا للحركة الكهربائية. وهناك نوع آخر هو تقنية الفصل الكهربائي بالتدفق المتقطع غير المتماثل (EAF4)، حيث يُطبَّق مجال كهربائي بالإضافة إلى مجال التدفق العرضي. وتتغلب تقنية EAF4 على قصور تقنية الفصل الكهربائي بالتدفق المتقطع البحتة، التي تتميز بدقة منخفضة، وتعاني من تلوث مخرج القناة بنواتج التحليل الكهربائي والفقاعات، مما يؤثر سلبًا على إشارات الكاشف. ^{[ 23 ]}