نظام النقل في الجميلة النائمة

نظام ترانسبوزون " الجميلة النائمة" هو ترانسبوزون DNA اصطناعي مصمم لإدخال تسلسلات DNA محددة بدقة في كروموسومات الفقاريات بهدف إدخال سمات جديدة واكتشاف جينات جديدة ووظائفها. وهو نظام من نوع Tc1/mariner ، حيث تم إحياء الترانسبوزاز من تسلسلات متعددة غير نشطة في الأسماك.

يتكون نظام ترانسبوزون "الجميلة النائمة" من إنزيم ترانسبوزاز "الجميلة النائمة" (SB) وترانسبوزون صُمم عام 1997 لإدخال تسلسلات محددة من الحمض النووي في جينومات الفقاريات. تنتقل ترانسبوزونات الحمض النووي من موقع إلى آخر في الحمض النووي بطريقة بسيطة تشبه القص واللصق (الشكل 1). والتحويل عملية دقيقة يتم فيها استئصال جزء محدد من الحمض النووي من جزيء حمض نووي ونقله إلى موقع آخر في نفس جزيء الحمض النووي أو في جينوم مختلف . ^{[ 1 ]}

كما هو الحال مع جميع أنواع الترانسبيزات الأخرى من نوع Tc1/mariner ، يقوم ترانسبيز SB بإدخال ترانسبوزون في زوج قاعدي ثنائي النوكليوتيد TA في تسلسل الحمض النووي المُستقبِل. ^{[ 2 ]} يمكن أن يكون موقع الإدخال في مكان آخر ضمن جزيء الحمض النووي نفسه، أو في جزيء حمض نووي آخر (أو كروموسوم). في جينومات الثدييات، بما في ذلك الإنسان، يوجد ما يقارب 200 مليون موقع TA. يتضاعف موقع إدخال TA أثناء عملية دمج الترانسبوزون. يُعدّ هذا التضاعف لتسلسل TA سمة مميزة لعملية النقل، ويُستخدم لتحديد الآلية في بعض التجارب. مع ذلك، أشارت دراسة حديثة إلى أن SB يندمج أيضًا في ثنائيات النوكليوتيدات غير TA بتردد منخفض. ^{[ 3 ]} يمكن ترميز الترانسبيز إما داخل الترانسبوزون نفسه (مثل الترانسبوزون المفترض الموضح في الشكل 2)، أو يمكن توفير الترانسبيز من مصدر آخر، وفي هذه الحالة يصبح الترانسبوزون عنصرًا غير ذاتي. تُعدّ العناصر المتحركة غير المستقلة (انظر الشكل 1 على سبيل المثال) أدواتٍ جينية بالغة الأهمية، لأنها بعد إدخالها لا تستطيع الاستمرار في الاستئصال وإعادة الإدخال بشكلٍ مستقل. جميع العناصر المتحركة في الحمض النووي التي تم تحديدها في الجينوم البشري وجينومات الثدييات الأخرى هي عناصر متحركة غير مستقلة، لأنه على الرغم من احتوائها على جينات الترانسبيوزاز، إلا أن هذه الجينات غير وظيفية وغير قادرة على إنتاج الترانسبيوزاز الذي يُحرّك العنصر المتحرك.

أُطلق على جين الترانسبيوزاز المُعاد إحياؤه اسم " الجميلة النائمة (SB) "، نسبةً إلى قصة الجميلة النائمة ، لأنه "استيقظ من سبات تطوري طويل". ^{[ 4 ]} نظام الترانسبيوزاز SB اصطناعي، إذ أُعيد بناء ترانسبيوزاز SB من تسلسلات ترانسبيوزاز منقرضة (أحفورية) تنتمي إلى فئة Tc1/mariner من الترانسبيوزازات ^{[ 5 ] [ 6 ]} الموجودة في جينومات أسماك السلمونيات . ^{[ 7 ]} وكما هو الحال في البشر، حيث تُشكّل حوالي 20,000 ترانسبيوزاز من نوع Tc1/mariner غير نشطة ما يقرب من 3% من الجينوم البشري ، ^{[ 8 ] [ 9 ]} فإن جينات الترانسبيوزاز الموجودة في الأسماك ظلت غير نشطة لأكثر من 10 ملايين سنة بسبب تراكم الطفرات. استندت إعادة بناء ناقل SB إلى مفهوم وجود ناقل بدائي شبيه بـ Tc1، وهو السلف للتسلسلات الموجودة في جينومات الأسماك. على الرغم من وجود العديد من التسلسلات التي تشبه ناقلات Tc-1 في جميع جينومات الأسماك المدروسة، إلا أن جميع تسلسلات الناقل كانت غير نشطة بسبب الطفرات. وبافتراض أن الاختلافات في التسلسلات ناتجة عن طفرات مستقلة تراكمت في الناقلات المختلفة، تم افتراض وجود ناقل سلفي محتمل (الشكل 2). ^{[ 10 ]}

بدأ بناء الترانسبوزاز بدمج أجزاء من تسلسلين غير نشطين من عناصر الترانسبوزون من سمك السلمون الأطلسي ( Salmo salar ) وتسلسل غير نشط من سمك السلمون المرقط ( Oncorhynchus mykiss )، ثم إصلاح النواقص الطفيفة في المجالات الوظيفية لإنزيم الترانسبوزاز ( الشكل 3). تم تحديد كل حمض أميني في أول ترانسبوزاز مكتمل، المسمى SB10، بواسطة " تسلسل توافقي قائم على قاعدة الأغلبية " استنادًا إلى 12 جينًا جزئيًا موجودة في ثمانية أنواع من الأسماك. تمثلت الخطوات الأولى (1-3 في الشكل 3) في استعادة بروتين كامل عن طريق ملء الفجوات في التسلسل وعكس كودونات الإنهاء التي من شأنها منع تخليق عديد الببتيد المفترض المكون من 360 حمضًا أمينيًا. تمثلت الخطوة التالية (4 في الشكل 3) في عكس الطفرات في إشارة التوطين النووي (NLS) اللازمة لاستيراد إنزيم الترانسبوزاز من السيتوبلازم ، حيث يتم تصنيعه، إلى النواة، حيث يعمل. تم استعادة الطرف الأميني للترانسبوزاز، الذي يحتوي على مواقع ارتباط الحمض النووي للتعرف على التكرارات المباشرة (DRs)، في الخطوات من 5 إلى 8. أما الخطوتان الأخيرتان فقد أعادتا بناء النطاق التحفيزي، الذي يتميز بوجود أحماض أمينية محفوظة من حمض الأسبارتيك ( D ) وحمض الجلوتاميك ( E ) بتباعد محدد ، وهي أحماض موجودة في الإنتغرازات والريكومبينازات . ^{[ 11 ]} وكانت النتيجة SB10، الذي يحتوي على جميع المواقع اللازمة لوظيفته. ^{[ 4 ]}

تم تحسين إنزيم ترانسبوزاز SB10 على مدار العقد الماضي منذ ابتكاره، وذلك بزيادة عدد التسلسلات المتوافقة مع عدد أكبر من تسلسلات ترانسبوزون Tc1 المنقرضة، واختبار توليفات مختلفة من التغييرات. ^{[ 12 ] [ 13 ] [ 14 ] [ 15 ] [ 16 ] [ 17 ]} وقد أظهرت دراسات لاحقة أن نطاق ارتباط الحمض النووي يتكون من تسلسلين مزدوجين، متماثلين مع أنماط تسلسلية موجودة في بعض عوامل النسخ. وقد سُمّي النطاقان الفرعيان المزدوجان في إنزيم ترانسبوزاز SB بـ PAI وRED. يلعب النطاق الفرعي PAI دورًا رئيسيًا في التعرف على تسلسلات DR في الترانسبوزون. يتداخل النطاق الفرعي RED مع إشارة التموضع النووي، لكن وظيفته لا تزال غير واضحة. ^{[ 18 ]} يتمتع أحدث إصدار من إنزيم ترانسبوزاز SB، وهو SB100X، بنشاط يفوق نشاط SB10 بحوالي 100 ضعف، وذلك وفقًا لنتائج اختبارات نقل جينات مقاومة المضادات الحيوية التي أُجريت على خلايا هيلا البشرية المزروعة نسيجيًا. ^{[ 16 ]} منحت الجمعية الدولية لبروتوكولات وأبحاث البيولوجيا الجزيئية والخلوية والتكنولوجيا الحيوية (ISMCBBPR) جزيء SB100X لقب جزيء العام لعام 2009 تقديراً لإمكاناته في هندسة الجينوم المستقبلية. ^{[ 19 ]}

سُمّيَ الترانسبوزون الذي يتعرف عليه إنزيم SB transposase باسم T لأنه عُزل من جينوم سمكة سلمون أخرى، هي Tanichthys albonubes . يتكون الترانسبوزون من تسلسل جيني مُحدد مُحاط بتكرارات معكوسة (IRs) تحتوي بدورها على تكرارات مباشرة قصيرة (DR) (رؤوس الأسهم المتتالية IR-DR في الشكلين 1 و2). كان تسلسل IR/DR الخاص بالترانسبوزون T الأقرب إلى التسلسل المتفق عليه للترانسبوزونات المنقرضة الشبيهة بـ Tc-1 في الأسماك. يحتوي الترانسبوزون المتفق عليه على تكرارات معكوسة بطول 231 زوجًا قاعديًا. يبلغ طول التكرارات المباشرة الداخلية 29 زوجًا قاعديًا، بينما يبلغ طول التكرارات المباشرة الخارجية 31 زوجًا قاعديًا. يُعدّ اختلاف الطول بالغ الأهمية لتحقيق أقصى معدلات نقل. ^{[ 20 ]} تم تحسين مُكوّن الترانسبوزون T الأصلي لنظام SB transposon بإجراء تغييرات طفيفة ليتوافق مع التسلسل المتفق عليه للعديد من الترانسبوزونات المنقرضة والنشطة ذات الصلة. ^{[ 20 ] [ 21 ]}

على مدى العقد الماضي، طُوِّرت عناصر النقل SB كناقلات غير فيروسية لإدخال الجينات في جينومات الفقاريات، وللعلاج الجيني . يمكن أن تكون الحمولة الجينية عبارة عن كاسيت تعبير - جين مُعدَّل وعناصر مرتبطة به تُنظِّم عملية النسخ للتعبير عند المستوى المطلوب في نسيج أو أنسجة مُحدَّدة. يتمثل استخدام بديل لعناصر النقل SB في اكتشاف وظائف الجينات، وخاصة تلك المُسبِّبة للسرطان ، ^{[ 22 ] [ 23 ]} عن طريق إيصال تسلسلات الحمض النووي التي تُعطِّل التعبير عن الجينات القريبة من موقع الإدخال إلى أقصى حد. تُعرف هذه العملية باسم الطفرات الإدخالية أو الطفرات الناتجة عن عناصر النقل . عندما يتم تعطيل جين ما عن طريق إدخال عنصر نقل (أو آلية أخرى)، يُقال إن هذا الجين "مُعطَّل". وقد تم إنتاج فئران وجرذان مُعدَّلة وراثيًا باستخدام نظام SB. ^{[ 24 ] [ 25 ]} يوضح الشكل 4 هذين الاستخدامين لعناصر النقل SB.

سواءً لنقل الجينات أو تعطيلها، تجمع عناصر النقل SB بين مزايا الفيروسات والحمض النووي العاري. وقد خضعت الفيروسات لعملية انتقاء تطوري بناءً على قدرتها على إصابة الخلايا المضيفة الجديدة والتكاثر فيها. في الوقت نفسه، طورت الخلايا آليات دفاع جزيئية رئيسية لحماية نفسها من العدوى الفيروسية. بالنسبة لبعض تطبيقات هندسة الجينوم، مثل بعض أنواع العلاج الجيني، ^{[ 26 ] [ 27 ] [ 28 ]} يُعد تجنب استخدام الفيروسات أمرًا بالغ الأهمية لأسباب اجتماعية وتنظيمية. إن استخدام النواقل غير الفيروسية يتجنب العديد من آليات الدفاع التي تستخدمها الخلايا ضد النواقل، ولكن ليس جميعها.

تُستخدم البلازميدات ، وهي جزيئات الحمض النووي الدائرية الموضحة في الشكل 1، بشكل عام لنقل الجينات غير الفيروسي. ومع ذلك، توجد مشكلتان رئيسيتان في معظم طرق نقل الحمض النووي إلى كروموسومات الخلايا باستخدام البلازميدات، وهي الطريقة الأكثر شيوعًا لنقل الجينات غير الفيروسي. أولًا، يكون التعبير عن الجينات المنقولة من البلازميدات قصيرًا بسبب عدم اندماجها واستجابات الخلايا التي تُوقف التعبير. ثانيًا، يُعد امتصاص جزيئات البلازميد في الخلايا صعبًا وغير فعال. تم تصميم نظام Sleeping Beauty Transposon للتغلب على المشكلة الأولى. تقوم عناصر نقل الحمض النووي بإدخال تسلسلات محددة من الحمض النووي (الشكل 1) بشكل عشوائي تقريبًا في جينومات الخلية المضيفة، مما يزيد من مدة استمرار التعبير الجيني (حتى عبر أجيال متعددة). علاوة على ذلك، يتجنب النقل تكوين عمليات اندماج متعددة ومتتالية، والتي غالبًا ما تؤدي إلى إيقاف التعبير عن الجين المنقول. حاليًا، يُعد إدخال الجينات المنقولة في الكروموسومات باستخدام البلازميدات أقل كفاءة بكثير من استخدام الفيروسات. مع ذلك، باستخدام محفزات قوية لتنظيم التعبير عن الجين المنقول، يمكن أن يوفر توصيل العناصر المتحركة إلى عدد قليل من الخلايا مستويات مفيدة من منتجات الجينات المفرزة لحيوان كامل. ^{[ 29 ] [ 30 ]}

لعلّ أبرز التطبيقات المحتملة لعناصر Sleeping Beauty المتحركة هو العلاج الجيني البشري. ويمكن تصوّر انتشار واسع النطاق للعلاج الجيني في الدول المتقدمة والنامية على حدّ سواء، إذا ما انخفضت تكلفة نظام النقل. ولأنّ نظام Sleeping Beauty يتكون من الحمض النووي DNA فقط، فإنّ تكاليف الإنتاج والتوصيل تنخفض بشكل ملحوظ مقارنةً بالنواقل الفيروسية. وستختبر التجارب السريرية الأولى التي تستخدم عناصر Sleeping Beauty المتحركة في الخلايا التائية المعدلة وراثيًا فعالية هذا النوع من العلاج الجيني لدى المرضى المعرضين لخطر الوفاة بسبب الأورام الخبيثة المتقدمة. ^{[ 31 ]}

• نظام نقل بيجي باك