تحديد موت الخلايا

الموسوعة الحرة

لقد تغيرت معايير تحديد موت الخلايا . ففي السابق، كان يُعرَّف موت الخلايا ويُوصَف بناءً على الشكل الخارجي . أما الآن ، فقد تحوّل التصنيف إلى الاعتماد على التعريفات الجزيئية والوراثية. هذا الوصف أكثر عمليةً وينطبق على كلٍّ من التجارب المخبرية والحيوية ، ولذا تُوصَف الآن مسارات موت الخلايا الفرعية بسلسلة من الخصائص البيوكيميائية الدقيقة والقابلة للقياس. وقد اقترحت لجنة تسمية موت الخلايا (NCCD) في عام 2009 مجموعةً من التوصيات لوصف مصطلحات موت الخلايا، لأن سوء استخدام الكلمات والمفاهيم قد يُبطئ التقدم في مجال أبحاث موت الخلايا. [ 1 ]

يُعرّف الموت تقليديًا بأنه حالة تتميز بانقطاع علامات الحياة. يحدث الموت عندما تفقد الخلية سلامة غشائها البلازمي و/أو تتحلل تمامًا، بما في ذلك نواتها، و/أو تبتلع خلية مجاورة أجزاءها داخل الجسم الحي. وينتج عن خلل وظيفي لا رجعة فيه وانهيار التنظيم الداخلي للجهاز. يتمثل دور موت الخلية في الحفاظ على استتباب الأنسجة والأعضاء ، على سبيل المثال، الفقدان الطبيعي لخلايا الجلد أو دور أكثر فاعلية يُلاحظ في الأنسجة الضامرة كالغدة الزعترية.

تموت الخلايا إما عرضيًا أو عمدًا. في الواقع ، هناك آليتان لموت الخلايا: النخر والاستماتة (تُسمى الاستماتة في اللافقاريات حذف الخلية). تخضع الخلايا المحتضرة لعملية قابلة للعكس حتى يتم تجاوز مرحلة أولى غير قابلة للعكس أو "نقطة اللاعودة".

النخر هو موت غير مبرمج للخلايا، يتضمن تغيرات مبكرة في غشاء البلازما تؤدي إلى اختلال توازن الكالسيوم والصوديوم. يُسبب هذا حُماضًا، وصدمة أسموزية، وتكتل الكروماتين، وانكماش النواة . تترافق هذه التغيرات مع فقدان الفسفرة التأكسدية ، وانخفاض إنتاج الأدينوسين ثلاثي الفوسفات (ATP)، وفقدان القدرة على الحفاظ على التوازن الداخلي. كما تحدث تغيرات في الميتوكوندريا تشمل فرط تحميل الكالسيوم وتنشيط الفوسفوليبازات ، مما يؤدي إلى إشارات انتشار عبر الغشاء، وهي مرحلة من التلف غير القابل للعكس. تتضمن المرحلة الثانوية انتفاخ الليزوزوم ، وتوسع الشبكة الإندوبلازمية، وتسرب الإنزيمات والبروتينات، وفقدان التجزئة الخلوية.

تتميز عملية الاستماتة، أو الموت الخلوي المبرمج ، بخصائص مورفولوجية مميزة وآليات كيميائية حيوية تعتمد على الطاقة. وتُعتبر مكونًا حيويًا للعديد من العمليات الحيوية، بما في ذلك تجدد الخلايا الطبيعي، والتطور السليم للجهاز المناعي ووظائفه، والضمور الناتج عن الهرمونات، والتطور الجنيني، والموت الخلوي الناجم عن المواد الكيميائية. فعلى سبيل المثال، يحدث تمايز أصابع اليدين والقدمين في الجنين البشري النامي نتيجةً لموت الخلايا المبرمج بين الأصابع، مما يؤدي إلى تكوين أصابع منفصلة.

منهجية موت الخلايا

تعريفملحوظاتطرق الكشف 3-5
معايير جزيئية أو مورفولوجية لتحديد الخلايا الميتة
فقدان سلامة غشاء البلازماتحلل الغشاء البلازمي، مما أدى إلى فقدان هوية الخلية(IF) المجهر و/أو FACS لتقييم إزالة الأصباغ الحيوية، في المختبر
تفتت الخلايالقد خضعت الخلية بأكملها لتفتت كامل إلى أجسام منفصلة ( أجسام موت الخلايا المبرمج ).المجهر (IF)

تحديد كمية الأحداث ناقصة الصيغة الصبغية باستخدام تقنية FACS

( ذروة تحت G 1 )

الابتلاع بواسطة الخلايا المجاورةقامت الخلايا المجاورة بابتلاع الجثة أو أجزائها.المجهر (IF)

دراسات التموضع المشترك FACS

نقاط اللاعودة المقترحة لتحديد الخلايا المحتضرة
تنشيط هائل للكاسبازاتيبدأ برنامج الاستماتة الخلوية الكلاسيكي بواسطة الكاسبيز، ومع ذلك، في العديد من الحالات، يحدث موت مستقل عن الكاسبيز. علاوة على ذلك، تشارك الكاسبيز في عمليات أخرى غير مميتة، بما في ذلك تمايز الخلايا وتنشيطها.التلطيخ المناعي

القياس الكمي باستخدام تقنية FACS بواسطة ركائز فلورية أو أجسام مضادة محددة

تبديدلا يُعد التبديد العابر حدثًا مميتًا دائمًا، ولكن عادةً ما يسبق الفقدان المطول موت الخلايا وMMP؛القياس الكمي باستخدام تقنية الكالسئين-الكوبالت بواسطة تقنية FACS باستخدام مجسات حساسة لـ ΔΨ m
MMPتؤدي عملية نفاذية غشاء الميتوكوندريا الكاملة إلى إطلاق إنزيمات هدمية قاتلة أو منشطات لهذه الإنزيمات. ومع ذلك، قد لا تؤدي النفاذية الجزئية دائمًا إلى موت الخلية.دراسات التموضع المشترك المناعي الفلوري

التحليل المناعي بعد تجزئة المكونات الخلوية

التعرض لـ PSمن الأحداث المبكرة للاستماتة الخلوية ظهور الفوسفاتيديل سيرين على الطبقة الخارجية للغشاء البلازمي، ولكن قد يكون هذا الظهور قابلاً للعكس. كما يحدث ظهور الفوسفاتيديل سيرين أثناء تنشيط الخلايا التائية، دون حدوث موت خلوي.قياس كمية ارتباط Annexin V باستخدام تقنية FACS
التعريف العملي لموت الخلايا، وخاصة في أبحاث السرطان
فقدان القدرة على التكاثر الاستنساخيلا يمكن التمييز بين توقف دورة الخلية طويل الأمد أو غير القابل للعكس والذي يؤدي إلى موت الخلية بهذه الطريقة.اختبارات الاستنساخ الخلوي

[ 1 ]

الطريقة المورفومترية

تُعدّ الطريقة المورفومترية وسيلةً لإثبات موت الخلايا في المختبر. تُقدّم القياسات المورفومترية نتائج موت الخلايا من خلال قياس حجم ووزن وطول الأنسجة والأعضاء والكائن الحي ككل، وذلك بالمقارنة بين حالتي ما قبل وما بعد موت الخلايا. [ 2 ] وقد لاحظ أتالاه وجونسون هذه الطريقة باستخدام تحليل الجسيمات الإلكترونية لتحديد حيوية الخلايا.

التقنيات النسيجية الكيميائية والتصوير الإشعاعي الذاتي

ومن المؤشرات الأخرى لموت الخلايا التحلل المائي الحمضي، الذي يتم إطلاقه من عملية الهضم أثناء عملية البلعمة للخلايا الميتة بواسطة الخلايا البلعمية أو الخلايا المجاورة، والصبغة الحيوية هي علامة على البلعمة الثانوية.

التقنيات النسيجية والكيميائية الخلوية

لإثبات موت الخلايا في بعض الحالات، يُستخدم صبغ حيوي للكشف عن اختلال وظائف الخلية. تعتمد هذه الطريقة على غمر نسيج حي في محلول مخفف بنسبة 1:0000 من كبريتات النيل الأزرق في محلول ملحي . يُقاس موت الخلية باستخدام هذا الصبغ بملاحظة تغير اللون أو ظهور الفلورة . عند موت الخلية، تمر النواة بمراحل تدمير، إحداها التكثف النووي (البيكنوسيس)، مما يؤدي إلى إطلاق مجموعة هيستون قاعدية ، ويحدث هذا عند حدوث تكثف غير قابل للانعكاس للكروماتين. تتم عملية البلعمة في الليزوزومات الثانوية، وتتحكم عمليتا الالتهام الذاتي والالتهام غير الذاتي في الخلية الميتة عن طريق نشاط التحلل المائي الحمضي. تُفسر هذه العملية بالكشف عن نشاط (6-3H)-ثيميدين والفوسفات الحمضي في جهاز التقطيع المبرد.

إجراء

حُقنت العينة بالثيميدين الموسوم بالتريتيوم (6-3H)، ثم تم تضحية النسيج، وإزالته بعد ساعة واحدة، وتجميده في النيتروجين السائل. بعد ذلك، قُطعت مقاطع نسيجية  بسمك 4 ميكرومتر باستخدام جهاز التقطيع المبرد، ووُضعت على شرائح زجاجية نظيفة. ثُبّتت الشرائح مع المقاطع في جهاز التقطيع المبرد، ثم غُسلت في أسيتون بارد لمدة 10 دقائق، ثم شُطفت الشرائح في محلول منظم، وحُضنت في وسط فوسفات حمضي لمدة 15 دقيقة. استُخدم فوسفات نافثول AS TR [ 3 ] كركيزة، وبارا أوزانيلين هيكسازونيوم كعامل ربط. شُطفت المقاطع جيدًا مرة أخرى بالماء المقطر، ثم غُمرت في مستحلب التصوير الإشعاعي الذاتي (I1ford L4 مخفف بنسبة 1:5). عُرضت العينات لدرجة حرارة تتراوح بين 0 و4 درجات مئوية لمدة أسبوعين إلى ثلاثة أسابيع في غرفة مظلمة. عُولجت الشريحة الفوتوغرافية، وصُبغت بصبغة الهيماتوكسيلين، ثم رُكّبت للفحص المجهري . 

نتائج

نتيجة هذه التجربة هي اللون الأحمر الناتج عن تقنية صبغة الآزو المذكورة سابقًا، وهو مؤشر على حدوث تحلل ذاتي للخلايا. كان هذا هو الهدف الرئيسي من الطريقة المورفومترية. ومن النتائج الأخرى ظهور حبيبات فضية في المستحلب الفوتوغرافي .

مناقشة

يعود هذا التغير في اللون إلى تفاعل أحمر متجانس دقيق ناتج عن نشاط الفوسفاتاز الحمضي. في الليزوزوم، توجد العديد من مؤشرات موت الخلايا، مثل الهيدرولاز الحر. يؤدي دمج الثيميدين المُشعّ إلى ظهور حبيبات فضية في المستحلب الفوتوغرافي، وهو ما يحدث في نوى الخلايا. يُعد نسيج الغدة الزعترية النسيج الأمثل لهذه العملية. تركز هذه الدراسة على تغيرين يحدثان في الغدة الزعترية للفأر كمثال. التغير الأول هو نسبة الخلايا الميتة (التي ينتشر فيها الفوسفاتاز الحمضي)، والثاني هو الخلايا التي تدمج الثيميدين (الخلايا التي تُصنّع الحمض النووي). تمت مقارنة النتائج وفقًا لعمر الفأر. بعد قياس النسب والأعداد، تبين أن مستوى موت الخلايا في الغدة الزعترية المتراجعة قد تضاعف مقارنةً بالغدة الزعترية الشابة، وأن مستوى الثيميدين قد انخفض في الغدة الزعترية الأكبر سنًا مقارنةً بالغدة الزعترية الشابة. ولتوضيح هذه النتائج بشكل أكبر، لوحظ أن بعض الخلايا التائية تحتوي على مواقع ليزوزومية لنشاط الفوسفاتاز الحمضي. وعندما ابتلعت البلاعم الخلايا الميتة، ارتفعت مستويات الفوسفاتاز الحمضي.

تقنية التصوير الإشعاعي الذاتي مع التلوين النسيجي

استخدم لويس تقنية التصوير الإشعاعي الذاتي لدمج الثيميدين الموسوم بالتريتيوم لحساب مؤشرات الانقسام الخلوي وتقدير مؤشرات التكثف النووي. يمكن استخدام هذه التقنية لدراسة حركية أنسجة الأورام ولها تطبيقات في المجهر الإلكتروني الماسح . [ 4 ]

المجهر الإلكتروني الماسح

استخدم هودجز وموير (1975) المجهر الإلكتروني الماسح لدراسة التصوير الإشعاعي الذاتي. وقد جُمع هذا النهج مع الطريقة الكيميائية الخلوية لإظهار الفوسفات الحمضي الحر وتحلل الخلايا . تحتوي الخلايا المحتضرة الغنية بالفوسفات الحمضي الحر على ناتج تفاعل مُبروم، وتُعطي إشارة مميزة للبروم عند إخضاعها للتحليل المجهري بالأشعة السينية . دراسات البنية الدقيقة: تحدث تغيرات شائعة في البنية الدقيقة للخلايا المحتضرة. وقد استُنتج ذلك بعد محاولات من علماء مثل كير (1972) الذي اقترح المفهوم العام للاستماتة في الفقاريات، بينما وصف شيويشل وميركر (1973) موت الخلايا المُستحث والفسيولوجي في أنسجة الفئران قبل الولادة. باستخدام الفروق في البنية الدقيقة، يُمكن التعرف على أنواع موت الخلايا والتمييز بينها، مثل موت الخلايا الناتج عن الفوسفات الحمضي وموت الخلايا.

يُعدّ الفوسفات الحمضي إنزيمًا أو مجموعة من الإنزيمات المتماثلة التي يمكن استخدامها لإثبات موت الخلايا، ويمكن ملاحظة ذلك بسهولة باستخدام المجهر الإلكتروني. يُمكن استخدام نشاط فوسفات بارا-نيتروفوينيل كعلامة جيدة لموت الخلايا. وقد استُخدمت هذه العلامة لتحديد موقع موت الخلايا أثناء التطور الجنيني، وكانت النتيجة الملحوظة هي إطلاق الفوسفات الحمضي خارج الخلية، وهو ما يُعدّ علامة على موت الخلية. تُشير العديد من التجارب إلى أن فوسفات بارا-نيتروفوينيل المُطلق خارج الخلية مرتبط بالريبوسومات وليس بالجسيمات الحالة.

تخليق الحمض النووي DNA والحمض النووي الريبي RNA والبروتين في موت الخلايا

يعني الموت الخلوي المبرمج التحكم الجيني في هذه العملية، وبالتالي يجب أن تكون الجينات المسؤولة عن تحديد الموت الخلوي في تسلسل النمو موجودة. وقد أظهر العديد من الباحثين أنه قد يكون هناك ارتفاعٌ مُنذرٌ في تخليق البروتين كمؤشرٍ تمهيدي للموت الخلوي المبرمج.

النخر

مراجع

  1. 1 2 كرومر، جي، جالوزي، إل، فاندينابيل، بي، أبرامز، جيه، النمري، إي، بايهريك، إي، … ميلينو، جي (2009). “تصنيف موت الخلايا: توصيات لجنة التسميات الخاصة بموت الخلايا 2009”. موت الخلايا وتمايزها , 16(1)، 3-11. ( http://doi.org/10.1038/cdd.2008.150 .)
  2. ↑ موسوعة بريتانيكا . (2015). "التوازن الداخلي" . تاريخ الوصول: 22 ديسمبر 2016
  3. ↑ 2016. "فوسفات نافثول AS-TR" . تم الاطلاع عليه بتاريخ 29 ديسمبر 2016.
  4. ↑ آي. ديفيز ودي سي سيجي (1984) شيخوخة الخلايا وموت الخلايا . الصفحات 5-32. مطبعة جامعة كامبريدج، نيويورك، نيويورك.