التكثف النووي

تتضمن عملية التكثف النووي، والتي تُعرف أيضًا بالتكثف النووي المبرمج، ثلاث مراحل رئيسية. وهي: تمزق الغشاء النووي، وتكثيف الكروماتين، وأخيرًا، انقسام/تفتت النواة. ^{[ 4 ]} خلال هذه المراحل، يتقلص حجم الخلية، ويتعرض غشاء الخلية لعملية التبرعم، وهي عبارة عن انتفاخات غشائية على السطح الخارجي لغشاء الخلية. خلال المرحلة الأولى (تمزق الغشاء النووي)، تُستخدم عدة إنزيمات لفصل البروتينات الموجودة في الغشاء النووي. تستهدف هذه الإنزيمات، كاسبيز-3 وكاسبيز -6 ، بروتينات الغشاء النووي وتحللها، بما في ذلك NUP153 وLAP2 وB1 (وهي بروتينات تُستخدم في بنية الغشاء والنقل الجزيئي). ^{[ 4 ]} يؤدي هذا الانقسام بدوره إلى تمزق الجزء الداخلي من الغشاء، وهو عامل محفز لتكثيف الكروماتين (الحدث الثاني من التكثف النووي). ويعود ذلك إلى أن الكاسبيز-3 يقطع بروتين الأكينوس، الذي يحتوي على نطاقات ربط الحمض النووي DNA / RNA ونشاط إنزيم ATPase لبدء تكثيف الكروماتين. ^{[ 4 ]}

يُعرف التكثف النووي غير التحللي، أو التكثف النووي النخري، بتورم الخلية، يليه انفصال الغشاء النووي عن الكروماتين، ثم انهيار كليهما، وأخيرًا تمزق غشاء الخلية (موت الخلية). ^{[ 4 ]} أحد البروتينات التي تلعب دورًا هامًا في التكثف النووي النخري هو عامل حاجز التكامل الذاتي (BAF). تتمثل وظيفة BAF في تسهيل ارتباط الكروماتين بغشاء النواة، ولكن في حالة النخر، عندما يُفسفر BAF ، فإنه يبدأ انفصال الغشاء النووي عن الكروماتين المكثف. ^{[ 6 ]} ونتيجة لذلك، ينهار الغشاء النووي على الكروماتين المكثف. لذا، يُعد فسفرة BAF مؤشرًا حاسمًا للتكثف النووي النخري.

عند استخدام الصبغات والأصباغ لتحديد الخلايا المتكثفة في عينة نسيجية، يصبح التعرف على الخلية سهلاً. تستهدف هذه الصبغات أجزاء النواة والنتوءات في الخلية المتكثفة، مما يجعلها داكنة اللون (تباين ضوئي) وأكثر وضوحًا عند وضع العينة تحت المجهر الضوئي. كما يستخدم كل من المجهر الفلوري وقياس التدفق الخلوي الصبغات ( الصبغات الفلورية ) لاستهداف الحمض النووي/أجزاء النواة في الخلايا. يُحدث التلوين الفلوري تباينًا بين الحمض النووي للخلايا الطبيعية والحمض النووي للخلايا المتكثفة، نظرًا لتكثف المادة النووية في الخلايا المتكثفة.

يُعدّ الفصل الكهربائي الهلامي تقنيةً قياسيةً تُستخدم بكثرةٍ لتصوير تفتت الحمض النووي (مُشكّلاً صورةً شبيهةً بالسلم على الهلام)، وهي سمةٌ مميزةٌ للاستماتة الخلوية، وترتبط بتكثف النواة (الذي يُميّز التكثف النووي). ولذلك، تُعرف هذه التقنية، عند الإشارة إلى الاستماتة الخلوية، باسم " سلم الحمض النووي ". كما يُستخدم الفصل الكهربائي الهلامي لتصوير التفتت العشوائي للحمض النووي في النخر، والذي يُشكّل لطخةً على الهلام.

تشمل طرق فحص تجزئة أو تكثيف الحمض النووي المختلفة فحص APO للحمض النووي أحادي السلسلة ( ssDNA ) الذي يكشف عن الحمض النووي التالف للخلايا التي تخضع للاستماتة أو النخر، وفحص TUNEL الذي يستخدم للعثور على فواصل الحمض النووي المزدوجة (DSBs) محليًا، وISEL. ^{[ 7 ]}

تقنية الوسم الموضعي (ISEL) هي تقنية لوسم الخلايا الميتة أو المبرمجة للموت. ^{[ 7 ]} تستهدف هذه التقنية على وجه التحديد الحمض النووي غير المجزأ الذي تكثف في بنية النيوكليوسوم . ^{[ 7 ]}

يكشف اختبار APO ssDNA عن الخلايا الميتة باستخدام جسم مضاد يرتبط تحديدًا بالحمض النووي أحادي السلسلة (ssDNA)، الذي يتراكم أثناء موت الخلايا المبرمج نتيجة لتفتت الحمض النووي. ^{[ 7 ]} لذا، يُعد وجود الحمض النووي أحادي السلسلة مؤشرًا على تلف الحمض النووي في الخلية الميتة. في عملية الاختبار، تُثبّت الخلايا (باستخدام الفورماميد ، على سبيل المثال )، ثم تُحضن (عند درجة حرارة محددة مسبقًا)، مما يُعرّض الحمض النووي للتفكك الحراري ويكشف عن الحمض النووي أحادي السلسلة. ^{[ 7 ]} بعد ذلك، تُحضن الخلايا مع جسم مضاد خاص بالحمض النووي أحادي السلسلة بالإضافة إلى جسم مضاد ثانوي موسوم بمادة فلورية. ^{[ 7 ]} تُستخدم كمية الفلورة كمقياس لموت الخلايا المبرمج، ويمكن قياسها كميًا باستخدام قياس التدفق الخلوي.

يُعدّ اختبار TUNEL، المعروف أيضًا باسم اختبار وسم نهايات الحمض النووي المكسورة بواسطة إنزيم ناقل ديوكسي نيوكليوتيديل الطرفي (dUTP)، تقنيةً لقياس تلف الحمض النووي وانكساره أثناء موت الخلايا المبرمج. ^{[ 7 ]} خلال موت الخلايا المبرمج، يُعرّض تفتت الحمض النووي العديد من نهايات 3'OH، التي تُوسَم بثلاثي فوسفات ديوكسي يوريدين (dUTP) المُعدَّل بواسطة تفاعل TUNEL. ^{[ 7 ]} بعد ذلك، يُمكن تحديد هذا الـ dUTP المُعدَّل باستخدام أجسام مضادة فلورية مُحدَّدة قادرة على تحديد النيوكليوتيدات المُعدَّلة ، أو باستخدام النيوكليوتيدات الموسومة نفسها. ^{[ 7 ]} يُمكن استخدام قياس التدفق الخلوي لتحديد شدة الفلورة، وبالتالي توفير مقياس لموت الخلايا المبرمج.

كما ذُكر سابقًا، تُعزز بروتينات الكاسبيز ، وهي إنزيمات بروتياز ، تكثيف الحمض النووي وتفتيته عبر سلسلة تفاعلات الكاسبيز (أو التحلل البروتيني). تشمل هذه البروتينات، على سبيل المثال، كاسبيز 9 ، وكاسبيز 6، وكاسبيز 7 ، وكاسبيز 3. تُنشط سلسلة تفاعلات الكاسبيز مباشرةً إنزيم ديوكسي ريبونيوكلياز المُنشط بالكاسبيز (CAD)، الذي يبدأ بتفتيت الحمض النووي إلى قطع أصغر، مما يؤدي إلى تكثيف الكروماتين. تشمل التقنيات الكيميائية الحيوية المستخدمة للكشف عن نشاط الكاسبيز اختبار ELISA، والاختبارات الفلورية ، والاختبارات اللونية . ^{[ 7 ]}