أوبيرون اللاكتوز

📅 آخر تحديث: ١ أغسطس ٢٠٢٦
✍️ نُشر في: ١ أغسطس ٢٠٢٦
📷 يحتوي على 11 صور
الموسوعة الحرة

يُعدّ أوبيرون اللاكتوز ( أوبيرون اللاكتوز ) أوبيرونًا ضروريًا لنقل اللاكتوز واستقلابه في بكتيريا الإشريكية القولونية (E. coli) والعديد من البكتيريا المعوية الأخرى . على الرغم من أن الجلوكوز هو المصدر الكربوني المُفضّل لمعظم البكتيريا المعوية، فإن أوبيرون اللاكتوز يسمح بهضم اللاكتوز بكفاءة عند عدم توفّر الجلوكوز، وذلك من خلال نشاط إنزيم بيتا-جالاكتوزيداز . [ 1 ] كان تنظيم جينات أوبيرون اللاكتوز أول آلية تنظيم جيني تُفهم بوضوح، ولذلك أصبح مثالًا بارزًا على تنظيم الجينات في بدائيات النوى . ولهذا السبب، يُناقش هذا الموضوع غالبًا في مقررات البيولوجيا الجزيئية والخلوية التمهيدية . استخدم فرانسوا جاكوب وجاك مونود نظام استقلاب اللاكتوز هذا لتحديد كيفية معرفة الخلية البيولوجية الإنزيم الذي يجب تصنيعه. وقد حاز عملهما على أوبيرون اللاكتوز على جائزة نوبل في علم وظائف الأعضاء عام 1965. [ 1 ]

تفتقر معظم الخلايا البكتيرية، بما فيها الإشريكية القولونية، إلى الإنترونات في جينومها. كما تفتقر إلى الغشاء النووي . ولذلك، يتم تنظيم الجينات بواسطة أوبيرون اللاكتوز على مستوى النسخ، من خلال التحكم في نسخ الحمض النووي .

الأوبيرونات البكتيرية هي نسخ متعددة الجينات قادرة على إنتاج بروتينات متعددة من نسخة mRNA واحدة . في هذه الحالة، عندما تحتاج البكتيريا إلى اللاكتوز كمصدر للسكر ، يمكن نسخ الجينات الثلاثة لأوبيرون اللاكتوز (lac) وترجمة البروتينات الناتجة عنها: lacZ و lacY و lacA . ينتج عن جين lacZ إنزيم بيتا-جالاكتوزيداز الذي يحلل اللاكتوز، وهو سكر ثنائي ، إلى جلوكوز وجالاكتوز . يشفر جين lacY بروتين بيتا-جالاكتوزيد بيرميز ، وهو بروتين غشائي يندمج في الغشاء البلازمي لتمكين نقل اللاكتوز إلى داخل الخلية. وأخيرًا، يشفر جين lacA إنزيم بيتا-جالاكتوزيد ترانس أسيتيلاز .

Layout of the lac operon.

أوبيرون اللاكتوز . أعلى: مثبط، أسفل: نشط. 1 : بوليميراز الحمض النووي الريبي، 2 : مثبط، 3 : محفز، 4 : مشغل، 5 : لاكتوز، 6 : lacZ ، 7 : lacY ، 8 : lacA .

لاحظ أن عدد أزواج القواعد في الرسم التخطيطي أعلاه ليس متناسبًا مع المقياس. في الواقع، يوجد أكثر من 5300 زوج من القواعد في أوبيرون اللاكتوز . [ 2 ]

يُعدّ إنتاج الإنزيمات في حال عدم توفر اللاكتوز أو في حال توفر مصدر طاقة أفضل كالجلوكوز تبذيراً للطاقة. يستخدم مُشغّل اللاكتوز آلية تحكم ثنائية لضمان أن تُنفق الخلية الطاقة في إنتاج الإنزيمات المُشفّرة بواسطة مُشغّل اللاكتوز عند الضرورة فقط. [ 3 ]

في غياب اللاكتوز، يقوم مثبط اللاكتوز ، المُشفَّر بواسطة جين lacI، بإيقاف إنتاج الإنزيمات وبروتينات النقل المُشفَّرة بواسطة أوبيرون اللاكتوز . [ 4 ] ويتم ذلك عن طريق تثبيط بوليميراز الحمض النووي الريبي المعتمد على الحمض النووي . هذا التثبيط ليس مثاليًا، إذ يحدث قدر ضئيل من التعبير الجيني باستمرار. يُعبَّر عن بروتين المثبط دائمًا، لكن أوبيرون اللاكتوز (أي الإنزيمات وبروتينات النقل) يكون مُثبَّطًا بشكل شبه كامل، مما يسمح بمستوى ضئيل من التعبير الأساسي. لو لم يكن الأمر كذلك، لما وُجد بروتين النقل lacY في الغشاء الخلوي؛ وبالتالي، لما كان أوبيرون اللاكتوز قادرًا على اكتشاف وجود اللاكتوز.

عند توفر اللاكتوز دون الجلوكوز، يدخل جزء من اللاكتوز إلى الخلية عبر بروتين ناقل موجود مسبقًا مُشفَّر بواسطة جين lacY. يرتبط هذا اللاكتوز بعد ذلك بالمثبط ويُعطِّله، مما يسمح بتعبير أوبيرون اللاكتوز . ثم يُصنَّع المزيد من إنزيم بيتا-جالاكتوزيد بيرميز، مما يسمح بدخول المزيد من اللاكتوز، وتستطيع الإنزيمات المُشفَّرة بواسطة جيني lacZ وlacA هضمه.

مع ذلك، في وجود الجلوكوز، وبغض النظر عن وجود اللاكتوز، سيتم تثبيط الأوبيرون. ويعود ذلك إلى أن بروتين مُنشِّط الهدم (CAP)، اللازم لإنتاج الإنزيمات، يبقى غير نشط، ويقوم إنزيم EIIA Glc بإيقاف عمل إنزيم نفاذية اللاكتوز لمنع نقل اللاكتوز إلى داخل الخلية. وتؤدي آلية التحكم المزدوجة هذه إلى الاستخدام المتسلسل للجلوكوز واللاكتوز في مرحلتين متميزتين من مراحل النمو، تُعرفان باسم مرحلة النمو الثنائي .

بناء

بنية اللاكتوز ونواتج انشطاره.

يبدو أن lacZ و lacY فقط ضروريان لمسار هدم اللاكتوز .

من حيث الأرقام، يحتوي lacI على 1100 زوج قاعدي، وlacZ على 3000 زوج قاعدي، وlacY على 800 زوج قاعدي، و lacA على 800 زوج قاعدي، حيث يتوافق كل 3 أزواج قاعدية مع حمض أميني واحد. [ 6 ]

التسمية الجينية

تُستخدم الاختصارات المكونة من ثلاثة أحرف لوصف الأنماط الظاهرية في البكتيريا بما في ذلك الإشريكية القولونية .

ومن الأمثلة على ذلك:

  • اللاك (القدرة على استخدام اللاكتوز)،
  • قدرته على تصنيع الحمض الأميني الهيستيدين
  • موت (حركة السباحة)
  • Sm R (مقاومة المضاد الحيوي ستربتوميسين )

في حالة اللاكتوز، تكون الخلايا الطبيعية Lac +، وهي قادرة على استخدام اللاكتوز كمصدر للكربون والطاقة، بينما لا تستطيع الخلايا الطافرة Lac- استخدام اللاكتوز. تُستخدم الأحرف الثلاثة نفسها عادةً (أحرف صغيرة، مائلة) لتسمية الجينات المسؤولة عن نمط ظاهري معين، حيث يُميز كل جين مختلف بحرف إضافي. جينات اللاكتوز التي تُشفّر الإنزيمات هي lacZ و lacY و lacA . أما جين اللاكتوز الرابع فهو lacI ، الذي يُشفّر مثبط اللاكتوز، حيث يرمز الحرف "I" إلى قابلية التحفيز .

يمكن التمييز بين الجينات البنيوية التي تشفر الإنزيمات، والجينات التنظيمية التي تشفر البروتينات التي تؤثر على التعبير الجيني. ويوسع الاستخدام الحالي نطاق التسمية الظاهرية ليشمل البروتينات؛ فمثلاً، LacZ هو ناتج البروتين لجين lacZ ، وهو بيتا-جالاكتوزيداز. كما تؤثر تسلسلات قصيرة مختلفة، ليست جينات، على التعبير الجيني، بما في ذلك مُحفِّز lac ( lac p) ومُشغِّل lac ( lac o) . وعلى الرغم من أن هذا ليس استخدامًا قياسيًا، إلا أن الطفرات التي تؤثر على lac o تُسمى lac o c ، لأسباب تاريخية.

أنظمة

يعتمد التحكم الدقيق في جينات اللاكتوز على توافر اللاكتوز كمادة أساسية للبكتيريا. لا تُنتج البكتيريا البروتينات عندما لا يتوفر اللاكتوز كمصدر للكربون. تُنظم جينات اللاكتوز في أوبيرون ؛ أي أنها مُوجهة في نفس الاتجاه ومتجاورة مباشرة على الكروموسوم، وتُنسخ معًا إلى جزيء mRNA متعدد السيسترونات واحد . يبدأ نسخ جميع الجينات بارتباط إنزيم بوليميراز الحمض النووي الريبي (RNAP)، وهو بروتين رابط للحمض النووي ، والذي يرتبط بموقع ارتباط محدد للحمض النووي، وهو المُحفز ، الموجود مباشرة قبل الجينات. يُساعد بروتين مُنشط الهدم المرتبط بـ cAMP (CAP، المعروف أيضًا باسم بروتين مستقبل cAMP) في ارتباط بوليميراز الحمض النووي الريبي بالمُحفز. [ 7 ] مع ذلك، يُنتج جين lacI (الجين المُنظم لأوبيرون اللاكتوز ) بروتينًا يمنع بوليميراز الحمض النووي الريبي من الارتباط بمُشغل الأوبيرون. لا يمكن إزالة هذا البروتين إلا عند ارتباط الألولاكتوز به، مما يؤدي إلى تعطيله. يُعرف البروتين الناتج عن جين lacI باسم مثبط اللاكتوز. يُشار إلى نوع التنظيم الذي يخضع له أوبيرون اللاكتوز باسم التنظيم السلبي المُحفَّز، أي أن الجين يُعطَّل بواسطة العامل التنظيمي ( مثبط اللاكتوز ) ما لم يُضَف جزيء ما (اللاكتوز). بمجرد إزالة المثبط، يبدأ بوليميراز الحمض النووي الريبي (RNAP) بنسخ الجينات الثلاثة ( lacZYA ) إلى mRNA. لكل جين من الجينات الثلاثة على شريط mRNA تسلسل شاين-دالغارنو خاص به ، لذا تُترجم الجينات بشكل مستقل. [ 8 ] يتوفر تسلسل الحمض النووي (DNA) لأوبيرون اللاكتوز في الإشريكية القولونية ، و mRNA الخاص بـ lacZYA ، وجينات lacI في بنك الجينات (عرض) .

The first control mechanism is the regulatory response to lactose, which uses an intracellular regulatory protein called the lactose repressor to hinder production of β-galactosidase in the absence of lactose. The lacI gene coding for the repressor lies nearby the lac operon and is always expressed (constitutive). If lactose is missing from the growth medium, the repressor binds very tightly to a short DNA sequence just downstream of the promoter near the beginning of lacZ called the lac operator. The repressor binding to the operator interferes with binding of RNAP to the promoter, and therefore mRNA encoding LacZ and LacY is only made at very low levels. When cells are grown in the presence of lactose, however, a lactose metabolite called allolactose, made from lactose by the product of the lacZ gene, binds to the repressor, causing an allosteric shift. Thus altered, the repressor is unable to bind to the operator, allowing RNAP to transcribe the lac genes and thereby leading to higher levels of the encoded proteins.

The second control mechanism is a response to glucose, which uses the catabolite activator protein (CAP) homodimer to greatly increase production of β-galactosidase in the absence of glucose. Cyclic adenosine monophosphate (cAMP) is a signal molecule whose prevalence is inversely proportional to that of glucose. It binds to the CAP, which in turn allows the CAP to bind to the CAP binding site (a 16 bp DNA sequence upstream of the promoter on the left in the diagram below, about 60 bp upstream of the transcription start site),[9] which assists the RNAP in binding to the DNA. In the absence of glucose, the cAMP concentration is high and binding of CAP-cAMP to the DNA significantly increases the production of β-galactosidase, enabling the cell to hydrolyse lactose and release galactose and glucose.

أظهرت دراسة حديثة أن استبعاد المحفز يمنع التعبير عن أوبيرون اللاكتوز عند وجود الجلوكوز. يُنقل الجلوكوز إلى داخل الخلية بواسطة نظام الفوسفاتاز المعتمد على الفوسفينول بيروفات (PEP) . تُنقل مجموعة الفوسفات من الفوسفينول بيروفات عبر سلسلة من تفاعلات الفسفرة تتكون من بروتينات نظام الفوسفاتاز العامة (PTS) HPr وEIA، وبروتينات نظام الفوسفاتاز الخاصة بالجلوكوز EIIA Glc وEIIB Glc ، وهي النطاق السيتوبلازمي لناقل الجلوكوز EII. يترافق نقل الجلوكوز مع فسفرته بواسطة EIIB Glc ، مما يؤدي إلى سحب مجموعة الفوسفات من بروتينات نظام الفوسفاتاز الأخرى، بما في ذلك EIIA Glc . يرتبط الشكل غير المفسفر من EIIA Glc بناقل اللاكتوز ويمنعه من إدخال اللاكتوز إلى الخلية. لذلك، في حال وجود كل من الجلوكوز واللاكتوز، فإن نقل الجلوكوز يمنع نقل محفز أوبيرون اللاكتوز . [ 10 ]

بنية الكابت

يرتبط بروتين LacI الرباعي بتسلسلين مُشغِّلين ويُحفِّز تكوين حلقات الحمض النووي. ترتبط وحدتان وظيفيتان ثنائيتان من بروتين LacI (أحمر + أزرق وأخضر + برتقالي) بتسلسل مُشغِّل الحمض النووي (مُعلَّم). تتصل هاتان الوحدتان الوظيفيتان في منطقة التجميع الرباعي (مُعلَّمة)؛ وبالتالي، يرتبط بروتين LacI الرباعي بتسلسلين مُشغِّلين. وهذا ما يسمح لبروتين LacI الرباعي بتحفيز تكوين حلقات الحمض النووي.

مُثبِّط اللاكتوز بروتين رباعي الأجزاء، يتكون من وحدات فرعية متطابقة. تحتوي كل وحدة فرعية على نمط حلزوني-انعطافي-حلزوني (HTH) قادر على الارتباط بالحمض النووي. موقع الارتباط الخاص بالمُثبِّط هو تسلسل من الحمض النووي ذو تكرار معكوس. يرتبط نصفا موقع الارتباط في الحمض النووي للمُثبِّط معًا بوحدتين فرعيتين من المُثبِّط. على الرغم من أن الوحدتين الفرعيتين الأخريين للمُثبِّط لا تؤديان أي وظيفة في هذا النموذج، إلا أن هذه الخاصية ظلت غير مفهومة لسنوات عديدة.

في نهاية المطاف، اكتُشف أن مُشغِّلين إضافيين يُشاركان في تنظيم جين اللاكتوز . [ 11 ] يقع أحدهما (O3 ) على بُعد حوالي 90 زوجًا قاعديًا قبل O1 في نهاية جين lacI ، بينما يقع الآخر (O2 ) على بُعد حوالي 410 أزواج قاعدية بعد O1 في الجزء الأول من جين lacZ . لم يُكتشف هذان الموقعان في الدراسات السابقة نظرًا لتكرار وظائفهما، ولأن الطفرات الفردية فيهما لا تُؤثر بشكل كبير على كبح التعبير الجيني. إذ لا تتجاوز تأثيرات الطفرات الفردية في أيٍّ من O2 أو O3 ضعفين إلى ثلاثة أضعاف. ومع ذلك، تتجلى أهميتهما في حقيقة أن الطفرة المزدوجة التي تعاني من خلل في كلٍّ من O2 و O3 تُظهر انخفاضًا ملحوظًا في التعبير الجيني (بحوالي 70 ضعفًا).

في النموذج الحالي، يرتبط مثبط اللاكتوز في آنٍ واحدٍ بكلٍّ من المشغل الرئيسي O1 ، وإما O2 أو O3 . وتتفرع حلقات الحمض النووي الوسيطة من هذا المركب. تشير الطبيعة المتكررة للمشغلين الثانويين إلى أن أهمية هذا المركب الحلقي ليست في حد ذاتها. إحدى الأفكار المطروحة هي أن النظام يعمل من خلال الربط؛ فإذا انفصل المثبط المرتبط عن O1 مؤقتًا ، فإن ارتباطه بمشغل ثانوي يبقيه في الجوار، مما يسمح له بالارتباط مجددًا بسرعة. وهذا من شأنه أن يزيد من ألفة المثبط لـ O1 .

آلية الحث

1 : بوليميراز الحمض النووي الريبي، 2 : الكابت، 3 : المحفز، 4 : المشغل، 5 : اللاكتوز، 6 : lacZ، 7 : lacY، 8 : lacA. أعلى : يكون الجين غير نشط. لا يوجد ألولاكتوز لتثبيط الكابت lac ، لذا يرتبط الكابت بإحكام بالمشغل، مما يعيق ارتباط بوليميراز الحمض النووي الريبي بالمحفز، وبالتالي لا يتم إنتاج نسخ mRNA لـ lacZYA . أسفل : يكون الجين نشطًا. يثبط الألولاكتوز الكابت، مما يسمح لبوليميراز الحمض النووي الريبي بالارتباط بالمحفز والتعبير عن الجينات، مما يؤدي إلى إنتاج LacZYA. في النهاية، ستقوم الإنزيمات بهضم كل اللاكتوز، حتى لا يتبقى أي ألولاكتوز يمكن أن يرتبط بالكبت. عندها سيرتبط الكابت بالمشغل، مما يوقف نسخ جينات LacZYA.

البروتين الكابت هو بروتين ألوستيري ، أي أنه يتخذ أحد شكلين مختلفين قليلاً، وهما في حالة توازن. في أحد الشكلين، يرتبط البروتين الكابت بالحمض النووي للمشغل بانتقائية عالية، بينما يفقد هذه الانتقائية في الشكل الآخر. وفقًا للنموذج الكلاسيكي للحث، يؤثر ارتباط المحفز، سواء كان ألولاكتوز أو IPTG، بالبروتين الكابت على توزيعه بين الشكلين. وبالتالي، يستقر البروتين الكابت المرتبط بالمحفز في هيئة غير قادرة على الارتباط بالحمض النووي. مع ذلك، لا يمثل هذا النموذج البسيط الصورة الكاملة، لأن البروتين الكابت يرتبط بالحمض النووي بثبات نسبي، ولكنه ينفصل عنه بسرعة عند إضافة المحفز. لذلك، يبدو واضحًا أن المحفز يمكنه أيضًا الارتباط بالبروتين الكابت حتى عندما يكون الأخير مرتبطًا بالحمض النووي. ولا تزال آلية الارتباط الدقيقة غير معروفة تمامًا. [ 12 ]

دور الارتباط غير المحدد

يلعب الارتباط غير النوعي للمثبط بالحمض النووي دورًا حاسمًا في كبح وتحفيز أوبيرون اللاكتوز. موقع الارتباط النوعي لبروتين مثبط اللاكتوز هو المُشغِّل. يتوسط التفاعل غير النوعي بشكل رئيسي التفاعلات بين الشحنات، بينما يتعزز الارتباط بالمُشغِّل بالتفاعلات الكارهة للماء. بالإضافة إلى ذلك، يوجد وفرة من تسلسلات الحمض النووي غير النوعية التي يمكن للمثبط الارتباط بها. في الأساس، يُعتبر أي تسلسل ليس المُشغِّل غير نوعي. أظهرت الدراسات أنه بدون وجود ارتباط غير نوعي، لا يمكن تحفيز (أو إزالة كبح) أوبيرون اللاكتوز حتى مع مستويات مشبعة من المُحفِّز. وقد ثبت أنه بدون ارتباط غير نوعي، يكون المستوى الأساسي للتحفيز أقل بعشرة آلاف مرة من المستوى الطبيعي. هذا لأن الحمض النووي غير النوعي يعمل كنوع من "المُستقبِل" لبروتينات المثبط، مما يصرفها عن المُشغِّل. تُقلل التسلسلات غير النوعية من كمية المثبط المتاحة في الخلية. وهذا بدوره يقلل من كمية المحفز اللازمة لفك تثبيط النظام. [ 13 ]

نظائر اللاكتوز

IPTG
أونبج
إكس-غال
ألولاكتوز

تم وصف عدد من مشتقات اللاكتوز أو نظائرها المفيدة في العمل مع أوبيرون اللاكتوز . هذه المركبات هي في الأساس غالاكتوزيدات مُستبدلة، حيث يتم استبدال جزء الجلوكوز في اللاكتوز بمجموعة كيميائية أخرى.

  • يُستخدم إيزوبروبيل-β-D-ثيوغالاكتوبيرانوزيد (IPTG) بشكل متكرر كمحفز لـ lac operon للعمل الفيزيولوجي. يرتبط IPTG بالمثبط ويعطله، ولكنه ليس ركيزة لإنزيم بيتا-جالاكتوزيداز. من مزايا IPTG في الدراسات الحيوية أنه لا يُستقلب بواسطة الإشريكية القولونية، لذا يبقى تركيزه ثابتًا، وبالتالي لا يتغير معدل التعبير عن الجينات المتحكمة بواسطة lac p/o في التجربة. يعتمد امتصاص IPTG على عمل إنزيم نفاذية اللاكتوز في الزائفة المتألقة ، وليس في الإشريكية القولونية . [ 14 ]
  • يُعدّ فينيل-β-D-جالاكتوز (فينيل-جال) ركيزةً لإنزيم بيتا-جالاكتوزيداز، ولكنه لا يُعطّل المُثبِّط، وبالتالي فهو ليس مُحفِّزًا. ولأن الخلايا البرية تُنتج كميةً ضئيلةً جدًا من بيتا-جالاكتوزيداز، فإنها لا تستطيع النمو على فينيل-جال كمصدر للكربون والطاقة. أما الطفرات التي تفتقر إلى المُثبِّط، فتستطيع النمو على فينيل-جال. لذا، فإن الوسط الغذائي الأدنى الذي يحتوي على فينيل-جال فقط كمصدر للكربون والطاقة يكون انتقائيًا لطفرات المُثبِّط وطفرات المُشغِّل. إذا زُرعت 10⁸ خلية من سلالة برية على أطباق أجار تحتوي على فينيل-جال، فإن المستعمرات النادرة التي تنمو هي في الغالب طفرات تلقائية تُؤثِّر على المُثبِّط. ويتأثر التوزيع النسبي لطفرات المُثبِّط والمُشغِّل بحجم الهدف. ولأن جين lacI الذي يُشفِّر المُثبِّط أكبر بحوالي 50 مرة من المُشغِّل، فإن طفرات المُثبِّط هي السائدة في عملية الانتقاء.
  • يُعدّ ثيوميثيل جالاكتوزيد [TMG] نظيرًا آخر للاكتوز. تعمل هذه المركبات على تثبيط مثبط lacI. عند تركيزات منخفضة للمحفز، يمكن لكل من TMG وIPTG دخول الخلية عبر إنزيم نفاذية اللاكتوز. أما عند تركيزات عالية للمحفز، فيمكن لكليهما دخول الخلية بشكل مستقل. يُمكن لـ TMG أن يُقلل من معدلات النمو عند التركيزات العالية خارج الخلية. [ 15 ]
  • وتعمل مركبات أخرى كمؤشرات ملونة لنشاط بيتا جالاكتوزيداز.
    • يتم شطر ONPG لإنتاج المركب الأصفر الشديد، أورثونيتروفينول والجلاكتوز، ويستخدم عادة كركيزة لفحص β-جالاكتوزيداز في المختبر . [ 16 ]
    • تتحول المستعمرات المنتجة لإنزيم بيتا-جالاكتوزيداز إلى اللون الأزرق بفعل مادة X-gal (5-برومو-4-كلورو-3-إندوليل-بيتا-دي-جالاكتوزيد)، وهي مادة اصطناعية لإنزيم بيتا-جالاكتوزيداز، وينتج عن انشطارها الجالاكتوز وصبغة 4-كلورو،3-برومو النيلي، مما ينتج عنه لون أزرق داكن. [ 17 ]
  • الألولاكتوز هو متصاوغ للاكتوز، وهو المحفز لجين اللاكتوز ( lac operon). اللاكتوز هو غالاكتوز-β(1→4)-غلوكوز، بينما الألولاكتوز هو غالاكتوز-β(1→6)-غلوكوز. يتحول اللاكتوز إلى ألولاكتوز بواسطة إنزيم بيتا-غالاكتوزيداز في تفاعل بديل عن التفاعل التحللي. من التجارب الفيزيولوجية التي توضح دور جين LacZ في إنتاج المحفز "الحقيقي" في خلايا الإشريكية القولونية، ملاحظة أن طفرة حذف جين lacZ لا تزال قادرة على إنتاج إنزيم LacY permease عند زراعتها مع IPTG، وهو نظير غير قابل للتحلل المائي للألولاكتوز، ولكن ليس عند زراعتها مع اللاكتوز. التفسير هو أن معالجة اللاكتوز إلى ألولاكتوز (بتحفيز من إنزيم بيتا-غالاكتوزيداز) ضرورية لإنتاج المحفز داخل الخلية.

تطوير النموذج الكلاسيكي

كان الكائن الحي الدقيق التجريبي الذي استخدمه فرانسوا جاكوب وجاك مونود هو بكتيريا المختبر الشائعة، الإشريكية القولونية (E. coli )، لكن العديد من المفاهيم التنظيمية الأساسية التي اكتشفها جاكوب ومونود تُعدّ أساسية للتنظيم الخلوي في جميع الكائنات الحية. [ 18 ] الفكرة الرئيسية هي أن البروتينات لا تُصنّع عندما لا تكون هناك حاجة إليها؛ إذ تحافظ الإشريكية القولونية على موارد الخلية وطاقتها بعدم إنتاج بروتينات اللاكتوز الثلاثة عندما لا تكون هناك حاجة لاستقلاب اللاكتوز، كما هو الحال عند توفر سكريات أخرى مثل الجلوكوز . يناقش القسم التالي كيف تتحكم الإشريكية القولونية في جينات معينة استجابةً للاحتياجات الأيضية.

خلال الحرب العالمية الثانية ، كان مونود يختبر تأثيرات مزيج السكريات كمصادر غذائية لبكتيريا الإشريكية القولونية والعصوية الرقيقة . وكان مونود يتابع دراسات مماثلة أجراها علماء آخرون على البكتيريا والخميرة. ووجد أن البكتيريا التي تنمو بنوعين مختلفين من السكريات غالبًا ما تُظهر مرحلتين من النمو. فعلى سبيل المثال، إذا تم توفير الجلوكوز واللاكتوز معًا، يتم استقلاب الجلوكوز أولًا (مرحلة النمو الأولى، انظر الشكل 2) ثم اللاكتوز (مرحلة النمو الثانية). ولا يتم استقلاب اللاكتوز خلال الجزء الأول من منحنى النمو ثنائي الطور لأن إنزيم بيتا-جالاكتوزيداز لا يُنتج عند وجود كل من الجلوكوز واللاكتوز في الوسط. وقد أطلق مونود على هذه الظاهرة اسم "ثنائي الطور" . [ 19 ]

الشكل 2: منحنى النمو "ثنائي الطور" لمونود

ثم ركز مونود اهتمامه على تحفيز تكوين بيتا-جالاكتوزيداز الذي يحدث عندما يكون اللاكتوز هو السكر الوحيد في وسط الاستنبات. [ 20 ]

تصنيف الطفرات التنظيمية

تمثلت إحدى أهم الإنجازات المفاهيمية التي حققها جاكوب ومونود [ 21 ] في إدراك الفرق بين المواد التنظيمية والمواقع التي تعمل فيها على تغيير التعبير الجيني. استخدم جاكوب، وهو جندي سابق، تشبيهًا بقاذفة قنابل تُطلق حمولتها الفتاكة عند تلقيها إشارة لاسلكية خاصة. يتطلب النظام العامل جهاز إرسال أرضي وجهاز استقبال في الطائرة. لنفترض الآن أن جهاز الإرسال المعتاد معطل. يمكن إصلاح هذا النظام بإضافة جهاز إرسال ثانٍ سليم. في المقابل، كما قال، لنفترض قاذفة قنابل بجهاز استقبال معطل. لا يمكن تغيير سلوك هذه القاذفة بإضافة طائرة ثانية سليمة.

لتحليل الطفرات التنظيمية في أوبيرون اللاكتوز ، طوّر جاكوب نظامًا يسمح بإدخال نسخة ثانية من جينات اللاكتوز ( lacI مع مُحفِّزه، و lacZYA مع مُحفِّزه ومُشغِّله) إلى خلية واحدة. ثم تُختبر مزرعة من هذه البكتيريا، ثنائية الصيغة الصبغية لجينات اللاكتوز ولكنها طبيعية فيما عدا ذلك، للكشف عن النمط الظاهري التنظيمي. وعلى وجه الخصوص، يُحدَّد ما إذا كان يتم إنتاج LacZ وLacY حتى في غياب IPTG (نظرًا لأن مثبط اللاكتوز الذي ينتجه الجين الطافر غير وظيفي). تُسمى هذه التجربة، التي تُختبر فيها الجينات أو مجموعات الجينات بشكل ثنائي، باختبار التكامل .

يوضح الشكل هذا الاختبار ( تم حذف lacA للتبسيط). أولًا، تُعرض بعض الحالات أحادية الصيغة الصبغية (أي أن الخلية تحمل نسخة واحدة فقط من جينات lac ). يُظهر الشكل (أ) الكبت، ويُظهر الشكل (ب) التحفيز بواسطة IPTG، ويُظهر الشكلان (ج) و(د) تأثير طفرة في جين lacI أو في المُشغِّل، على التوالي. في الشكل (هـ)، يُعرض اختبار التكامل للمُثبِّط. إذا كانت إحدى نسختي جينات lac تحمل طفرة في lacI ، بينما النسخة الثانية من النوع البري لـ lacI ، فإن النمط الظاهري الناتج يكون طبيعيًا، ولكن يتم التعبير عن lacZ عند التعرض للمُحفِّز IPTG. يُقال إن الطفرات التي تؤثر على المُثبِّط متنحية بالنسبة للنوع البري (وأن النوع البري سائد )، ويُفسَّر ذلك بحقيقة أن المُثبِّط بروتين صغير يمكنه الانتشار في الخلية. يتم إيقاف نسخة أوبيرون lac المجاورة لجين lacI المعيب بشكل فعال بواسطة البروتين المُنتَج من النسخة الثانية من lacI .

إذا أُجريت التجربة نفسها باستخدام طفرة في موقع المُشغِّل، فستُحصل على نتيجة مختلفة (اللوحة (و)). يتمثل النمط الظاهري للخلية التي تحمل موقع مُشغِّل طافرًا وآخر من النوع البري في إنتاج LacZ وLacY حتى في غياب المُحفِّز IPTG؛ لأن موقع المُشغِّل التالف لا يسمح بارتباط الكابت لتثبيط نسخ الجينات البنيوية. طفرة المُشغِّل سائدة. عندما يتضرر موقع المُشغِّل الذي يجب أن يرتبط به الكابت بفعل الطفرة، فإن وجود موقع وظيفي ثانٍ في الخلية نفسها لا يُحدث فرقًا في التعبير عن الجينات التي يتحكم بها الموقع الطافر.

تستخدم نسخة أكثر تطورًا من هذه التجربة أوبيرونات مُعَلَّمة للتمييز بين نسختي جينات اللاكتوز ، وتُظهر أن الجين (أو الجينات) البنيوية غير المُعَدَّلة هي تلك المجاورة للمُشغِّل الطافر (اللوحة (g)). على سبيل المثال، لنفترض أن إحدى النسختين مُعَلَّمة بطفرة تُعطِّل جين lacZ بحيث لا تُنتج إلا بروتين LacY، بينما تحمل النسخة الثانية طفرة تؤثر على جين lacY ولا تُنتج إلا بروتين LacZ. في هذه الحالة، تُعَبَّر نسخة أوبيرون اللاكتوز المجاورة للمُشغِّل الطافر فقط دون الحاجة إلى IPTG. نقول إن طفرة المُشغِّل سائدة في نفس الجين ، أي أنها سائدة على النمط البري ولكنها تؤثر فقط على نسخة الأوبيرون المجاورة لها مباشرةً.

هذا التفسير مُضللٌ من ناحيةٍ مهمة، لأنه ينطلق من وصف التجربة ثم يُفسر النتائج استنادًا إلى نموذج. لكن في الواقع، غالبًا ما يكون النموذج هو الأساس، وتُصمم التجربة خصيصًا لاختباره. فقد تخيّل جاكوب ومونود أولًا وجود موقع في الحمض النووي يحمل خصائص المُشغّل، ثم صمما اختباراتهما التكميلية لإثبات ذلك.

يشير غلبة طفرات المُشغِّل أيضًا إلى ضرورة وجود إجراء لاختيارها تحديدًا. فإذا تم اختيار الطفرات التنظيمية من مزرعة من النوع البري باستخدام فينيل-غال، كما هو موضح أعلاه، فإن طفرات المُشغِّل نادرة مقارنةً بطفرات الكابت نظرًا لصغر حجم الهدف. ولكن إذا بدأنا بسلالة تحمل نسختين من منطقة اللاكتوز بأكملها (أي ثنائية الصيغة الصبغية بالنسبة لجين اللاكتوز )، فإن طفرات الكابت (التي لا تزال تحدث) لا تُستعاد لأن التكميل بواسطة جين اللاكتوز الثاني من النوع البري يُكسب النمط الظاهري للنوع البري. في المقابل، تُكسب طفرة نسخة واحدة من المُشغِّل نمطًا ظاهريًا طافرًا لأنها سائدة على النسخة الثانية من النوع البري.

التنظيم بواسطة الأدينوسين أحادي الفوسفات الحلقي

المصدر: [ 22 ]

اعتمد تفسير ظاهرة التضاعف الثنائي على تحديد طفرات إضافية تؤثر على جينات اللاكتوز (lac) بخلاف تلك التي يفسرها النموذج الكلاسيكي. لاحقًا، تم تحديد جينين آخرين، هما cya و crp ، يقعان بعيدًا عن جين اللاكتوز ، ويؤدي حدوث طفرات فيهما إلى انخفاض مستوى التعبير الجيني في وجود IPTG، وحتى في سلالات البكتيريا التي تفتقر إلى الكابت أو المشغل. أدى اكتشاف cAMP في بكتيريا الإشريكية القولونية إلى إثبات إمكانية استعادة النشاط الكامل للطفرات التي تعاني من خلل في جين cya دون جين crp، وذلك بإضافة cAMP إلى الوسط.

يشفر جين cya إنزيم أدينيلات سيكلاز، الذي ينتج cAMP. في طفرة cya ، يؤدي غياب cAMP إلى انخفاض تعبير جينات lacZYA بأكثر من عشرة أضعاف عن المعدل الطبيعي. وتؤدي إضافة cAMP إلى تصحيح انخفاض تعبير Lac المميز لطفرات cya . أما الجين الثاني، crp ، فيشفر بروتينًا يُسمى بروتين مُنشِّط الهدم (CAP) أو بروتين مستقبل cAMP (CRP). [ 23 ]

مع ذلك، تُنتَج إنزيمات استقلاب اللاكتوز بكميات ضئيلة في وجود كلٍّ من الجلوكوز واللاكتوز (وهو ما يُعرف أحيانًا بالتعبير المُسرَّب)، وذلك لأن بوليميراز الحمض النووي الريبي (RNAP) قد يرتبط أحيانًا ويبدأ عملية النسخ حتى في غياب بروتين CAP. يُعدّ التعبير المُسرَّب ضروريًا للسماح باستقلاب بعض اللاكتوز بعد استهلاك مصدر الجلوكوز، ولكن قبل التنشيط الكامل لتعبير جين اللاكتوز .

في ملخص:

  • عندما يكون اللاكتوز غائباً، يكون إنتاج إنزيم اللاكتوز ضئيلاً للغاية (يرتبط مثبط اللاكتوز بالمشغل).
  • عندما يكون اللاكتوز موجودًا ولكن يوجد أيضًا مصدر كربون مفضل (مثل الجلوكوز) يتم إنتاج كمية صغيرة من الإنزيم (لا يرتبط مثبط اللاكتوز بالمشغل).
  • عندما يكون الجلوكوز غائباً، يرتبط CAP-cAMP بموقع محدد من الحمض النووي في اتجاه المنبع من المحفز ويجري تفاعلاً مباشراً بين البروتين والبروتين مع RNAP مما يسهل ارتباط RNAP بالمحفز.

يعكس التأخير بين مراحل النمو الوقت اللازم لإنتاج كميات كافية من الإنزيمات المسؤولة عن استقلاب اللاكتوز. أولًا، يجب أن يتجمع البروتين التنظيمي CAP على مُحفِّز جين اللاكتوز ، مما يؤدي إلى زيادة إنتاج mRNA الخاص به . يؤدي توفر المزيد من نسخ mRNA إلى إنتاج (انظر الترجمة ) عدد أكبر بكثير من نسخ LacZ (بيتا-جالاكتوزيداز، المسؤول عن استقلاب اللاكتوز) وLacY (بروتين ناقل اللاكتوز لنقل اللاكتوز إلى داخل الخلية). بعد فترة التأخير اللازمة لزيادة مستوى الإنزيمات المسؤولة عن استقلاب اللاكتوز، تدخل البكتيريا في مرحلة جديدة سريعة من النمو الخلوي .

شرح مفصل لأوبيرون اللاكتوز

يرتبط لغزان في تثبيط الهدم الخلوي بكيفية ارتباط مستويات cAMP بوجود الجلوكوز، وثانيًا، لماذا تُكلف الخلايا نفسها عناء ذلك. بعد تحلل اللاكتوز، ينتج عنه الجلوكوز والجلاكتوز (الذي يتحول بسهولة إلى جلوكوز). من الناحية الأيضية، يُعد اللاكتوز مصدرًا جيدًا للكربون والطاقة تمامًا مثل الجلوكوز. لا يرتبط مستوى cAMP بتركيز الجلوكوز داخل الخلايا، بل بمعدل نقل الجلوكوز، الذي يؤثر على نشاط إنزيم أدينيلات سيكلاز. (بالإضافة إلى ذلك، يؤدي نقل الجلوكوز أيضًا إلى تثبيط مباشر لإنزيم لاكتوز بيرميز). أما عن سبب عمل بكتيريا الإشريكية القولونية بهذه الطريقة، فلا يسعنا إلا التكهن. تُخمّر جميع البكتيريا المعوية الجلوكوز، مما يشير إلى أنها تتعرض له بشكل متكرر. من المحتمل أن يكون هناك فرق طفيف في كفاءة نقل أو استقلاب الجلوكوز مقابل اللاكتوز، مما يجعل من المفيد للخلايا تنظيم أوبيرون اللاكتوز بهذه الطريقة. [ 24 ]

الاستخدام في البيولوجيا الجزيئية

يُعدّ جين اللاكتوز ومشتقاته مناسبًا للاستخدام كجين مُخبِر في عدد من تقنيات الانتقاء البكتيري، مثل تحليل التهجين الثنائي ، حيث يجب تحديد الارتباط الناجح لمنشط النسخ بتسلسل مُحفِّز مُحدد. [ 17 ] في أطباق LB التي تحتوي على X-gal ، يتوافق تغير لون المستعمرات من الأبيض إلى الأزرق مع حوالي 20-100 وحدة من بيتا-جالاكتوزيداز، بينما يتراوح نطاق حساسية وسط اللاكتوز بالتترازوليوم ووسط لاكتوز ماكونكي بين 100-1000 وحدة، حيث تكون الحساسية في أعلى وأدنى نطاق على التوالي. [ 17 ] ولأن وسطي لاكتوز ماكونكي ولاكتوز بالتترازوليوم يعتمدان على نواتج تحلل اللاكتوز، فإنهما يتطلبان وجود كل من جيني lacZ و lacY . ولذلك، فإن العديد من تقنيات دمج اللاكتوز التي تتضمن جين lacZ فقط تُناسب أطباق X-gal [ 17 ] أو مرق ONPG السائل. [ 25 ]

انظر أيضاً

مراجع

  1. 1 2 غريفيث، أنتوني جيه إف؛ ويسلر، سوزان آر؛ كارول، شون بي؛ دوبلي، جون (2015). مقدمة في التحليل الجيني (  الطبعة الحادية عشرة). فريمان، دبليو إتش وشركاه. الصفحات 400-412 . ISBN  9781464109485.
  2. ↑ سانغانيريا، تانيشا؛ بوردوني، برونو (2024)، "علم الوراثة، الأوبرون القابل للتحفيز" ، ستات بيرلز ، تريجر آيلاند (فلوريدا): ستات بيرلز للنشر، PMID 33232031 ، تم الاطلاع عليه في 20 يونيو 2024 
  3. ↑ ماكلين، فيليب (1997). "التعبير الجيني في بدائيات النوى" . ndsu.edu . مؤرشف من الأصل في 27 مارس 2010. تم الاطلاع عليه في 19 مايو 2017 .
  4. ↑ "التعبير الجيني في بدائيات النوى" . ndsu.edu . مؤرشف من الأصل في 26 مارس 2010. تم الاطلاع عليه في 19 مايو 2017 .
  5. ↑ جورز، دوغلاس هـ.؛ ماثيوز، برايان و.؛ هوبر، روبن إي. (ديسمبر 2012). "إنزيم بيتا-غالاكتوزيداز LacZ: بنية ووظيفة إنزيم ذي أهمية تاريخية وبيولوجية جزيئية" . علم البروتين: منشور لجمعية البروتين . 21 (12): 1792-1807 . doi : 10.1002/pro.2165 . ISSN 1469-896X . PMC 3575911. PMID 23011886 .   
  6. ↑ "2.6: أوبرون اللاكتوز؛ موقع CAP؛ بصمة الحمض النووي" . نصوص بيولوجية ليبر . 3 يناير 2019. تم الاطلاع عليه في 20 يونيو 2024 .
  7. ↑ Busby S., Ebright RH. (2001). "تنشيط النسخ بواسطة بروتين منشط الهدم (CAP)". مجلة البيولوجيا الجزيئية 293 ( 2): 199-213 . doi : 10.1006/jmbi.1999.3161 . PMID 10550204 . 
  8. ↑ كينيل، ديفيد؛ ريزمان، هوارد (يوليو 1977). "معدلات بدء النسخ والترجمة لأوبيرون اللاكتوز في الإشريكية القولونية " . مجلة البيولوجيا الجزيئية . 114 (1): 1-21 . doi : 10.1016/0022-2836(77)90279-0 . PMID 409848 . 
  9. ↑ مالان، تي. فيليب؛ كولب، آني؛ بوك، هنري؛ ماكلور، ويليام (ديسمبر 1984). "آلية تنشيط CRP-cAMP لبدء نسخ أوبرون اللاكتوز وتنشيط محفز P1". مجلة البيولوجيا الجزيئية 180 (4): 881-909 . doi : 10.1016/0022-2836(84)90262-6 . PMID 6098691 . 
  10. ↑ غوركه ب، ستولكه ج (أغسطس 2008). "كبح استقلاب الكربون في البكتيريا: طرق عديدة للاستفادة القصوى من العناصر الغذائية". مراجعات الطبيعة. علم الأحياء الدقيقة . 6 (8): 613-24 . doi : 10.1038/nrmicro1932 . PMID 18628769. S2CID 8782171 .  
  11. ↑ أوهلر، س.؛ إيسمان، إي آر؛ كرامر، هـ.؛ مولر-هيل، ب. (1990). " تتعاون العوامل الثلاثة في أوبيرون اللاكتوز في عملية الكبت" . مجلة EMBO . 9 (4): 973-979 . doi : 10.1002/j.1460-2075.1990.tb08199.x . PMC 551766. PMID 2182324 .  
  12. ↑ غريفيث، أنتوني جيه إف؛ غيلبارت، ويليام إم؛ ميلر، جيفري إتش؛ ليونتين، ريتشارد سي (1999). "تنظيم نظام اللاكتوز" . التحليل الجيني الحديث . نيويورك: دبليو إتش فريمان. ISBN 0-7167-3118-5.
  13. ↑ فون هيبل، بي إتش؛ ريفزين، أ؛ غروس، سي إيه؛ وانغ، إيه سي (ديسمبر 1974). "ارتباط البروتينات المنظمة للجينوم بالحمض النووي بشكل غير محدد كآلية للتحكم البيولوجي: 1. أوبيرون اللاكتوز : جوانب التوازن" . وقائع الأكاديمية الوطنية للعلوم . 71 ( 12): 4808-12 . doi : 10.1073/pnas.71.12.4808 . PMC 433986. PMID 4612528 .  
  14. ↑ هانسن إل إتش، كنودسن إس، سورنسن إس جيه (يونيو 1998). "تأثير جين lacY على تحفيز المحفزات القابلة للتحفيز بواسطة IPTG، دُرِسَ في الإشريكية القولونية والزائفة المتألقة " . مجلة علم الأحياء الدقيقة الحالي . 36 (6): 341-347 . doi : 10.1007/s002849900320 . PMID 9608745. S2CID 22257399. أُرْسِخَتْ من الأصل في 18 أكتوبر 2000.  
  15. ↑ مارباخ أ، بيتنبروك ك (يناير 2012). " تحفيز أوبيرون اللاكتوز في الإشريكية القولونية: مقارنة منهجية بين التحفيز باستخدام IPTG وTMG وتأثير ناقل الأسيتيل LacA". مجلة التكنولوجيا الحيوية . 157 (1): 82-88 . doi : 10.1016/j.jbiotec.2011.10.009 . PMID 22079752 . 
  16. ↑ "اختبار ONPG (بيتا-جالاكتوزيداز)" . سبتمبر 2000. مؤرشف من الأصل في 3 نوفمبر 2007. تم الاطلاع عليه في 25 أكتوبر 2007 .
  17. 1234Joung J, Ramm E, Pabo C (2000). "A bacterial two-hybrid selection system for studying protein–DNA and protein–protein interactions". Proc Natl Acad Sci USA. 97 (13): 7382–7. Bibcode:2000PNAS...97.7382J. doi:10.1073/pnas.110149297. PMC 16554. PMID 10852947.
  18. ↑"Milestone 2 – A visionary pair : Nature Milestones in gene expression". www.nature.com. Retrieved 27 December 2015.
  19. ↑Muller-Hill, Benno (1996). The lac Operon, a Short History of a Genetic Paradigm. Berlin: Walter de Gruyter. pp. 7–10. ISBN 3-11-014830-7.
  20. ↑McKnight, Steven L. (1992). Transcriptional Regulation. Cold Spring Harbor, NY: Cold Spring Harbor Laboratory Press. pp. 3–24. ISBN 0-87969-410-6.
  21. ↑Jacob F.; Monod J (June 1961). "Genetic regulatory mechanisms in the synthesis of proteins". J Mol Biol. 3 (3): 318–56. doi:10.1016/S0022-2836(61)80072-7. PMID 13718526.
  22. ↑Montminy, M. (1997). "Transcriptional regulation by cyclic AMP". Annual Review of Biochemistry. 66: 807–822. doi:10.1146/annurev.biochem.66.1.807. ISSN 0066-4154. PMID 9242925.
  23. ↑Botsford, J L; Harman, J G (March 1992). "Cyclic AMP in prokaryotes". Microbiological Reviews. 56 (1): 100–122. doi:10.1128/MMBR.56.1.100-122.1992. ISSN 0146-0749. PMC 372856. PMID 1315922.
  24. ↑Vazquez A, Beg QK, Demenezes MA, et al. (2008). "Impact of the solvent capacity constraint on E. coli metabolism". BMC Syst Biol. 2 7. doi:10.1186/1752-0509-2-7. PMC 2270259. PMID 18215292.
  25. ↑"Induction of the lac operon in E. coli"(PDF). SAPS. Archived from the original(PDF) on 20 January 2022. Retrieved 29 June 2016.