لطخة نورثرن

يُعدّ تحليل النورثرن بلوت ، أو تحليل الحمض النووي الريبوزي (RNA blot)، ^{[ 1 ]} تقنيةً تُستخدم في أبحاث البيولوجيا الجزيئية لدراسة التعبير الجيني عن طريق الكشف عن الحمض النووي الريبوزي (RNA ) (أو الحمض النووي الريبوزي الرسول mRNA المعزول ) في العينة. ^{[ 2 ] [ 3 ]}

باستخدام تقنية التلطيخ الشمالي، يُمكن رصد التحكم الخلوي في البنية والوظيفة من خلال تحديد معدلات التعبير الجيني أثناء التمايز والتكوين الشكلي ، وكذلك في الحالات غير الطبيعية أو المرضية. ^{[ 4 ]} تعتمد هذه التقنية على استخدام الرحلان الكهربائي لفصل عينات الحمض النووي الريبوزي (RNA) حسب الحجم، والكشف عنها باستخدام مسبار تهجين مُكمِّل لجزء من التسلسل المستهدف أو كامله. وبالتحديد، يشير مصطلح "التلطيخ الشمالي" إلى النقل الشعري للحمض النووي الريبوزي من هلام الرحلان الكهربائي إلى غشاء التلطيخ. مع ذلك، يُشار إلى العملية برمتها عادةً باسم التلطيخ الشمالي. ^{[ 5 ]} طُوِّرت تقنية التلطيخ الشمالي عام 1977 على يد جيمس ألوين، وديفيد كيمب ، وجورج ستارك في جامعة ستانفورد . ^{[ 6 ]} سُمِّيت هذه التقنية بهذا الاسم لتشابهها مع تقنية التلطيخ الأولى، وهي التلطيخ الجنوبي ، نسبةً إلى عالم الأحياء إدوين ساوثرن . ^{[ 2 ]} الفرق الرئيسي هو أنه يتم تحليل الحمض النووي الريبي (RNA) بدلاً من الحمض النووي (DNA ) في عملية التلطيخ الشمالي. ^{[ 7 ]}

تبدأ عملية التلطيخ العامة ^{[ 5 ]} باستخلاص الحمض النووي الريبوزي الكلي من عينة نسيجية متجانسة أو من الخلايا. بعد ذلك، يمكن عزل الحمض النووي الريبوزي الرسول حقيقي النواة باستخدام كروماتوغرافيا السليلوز المرتبط بـ (dT) لعزل جزيئات الحمض النووي الريبوزي التي تحتوي على ذيل متعدد الأدينين فقط . ^{[ 8 ] [ 9 ]} ثم تُفصل عينات الحمض النووي الريبوزي بواسطة الرحلان الكهربائي الهلامي. ولأن الهلام هش ولا تستطيع المجسات اختراقه، تُنقل عينات الحمض النووي الريبوزي، بعد فصلها حسب الحجم، إلى غشاء نايلون عبر نظام تلطيخ شعري أو نظام تلطيخ فراغي.

يُعد غشاء النايلون ذو الشحنة الموجبة الأكثر فعاليةً في تقنية التلطيخ الشمالي، نظرًا لشدة انجذاب الأحماض النووية سالبة الشحنة إليه. يحتوي محلول النقل المستخدم في هذه التقنية عادةً على الفورماميد، لأنه يُخفّض درجة حرارة التفاعل بين المجس والحمض النووي الريبي، مما يُغني عن استخدام درجات حرارة عالية قد تُسبب تحلل الحمض النووي الريبي. ^{[ 10 ]} بعد نقل الحمض النووي الريبي إلى الغشاء، يتم تثبيته بروابط تساهمية باستخدام الأشعة فوق البنفسجية أو الحرارة. بعد وسم المجس، يتم تهجينه مع الحمض النووي الريبي الموجود على الغشاء. تشمل الظروف التجريبية التي قد تؤثر على كفاءة وخصوصية التهجين: القوة الأيونية، واللزوجة، وطول السلسلة المزدوجة، وعدم تطابق أزواج القواعد، وتركيب القواعد. ^{[ 11 ]} يُغسل الغشاء لضمان ارتباط المجس بشكلٍ نوعي ومنع ظهور إشارات خلفية. ثم تُكشف الإشارات الهجينة باستخدام فيلم الأشعة السينية، ويمكن قياسها كميًا باستخدام قياس الكثافة الضوئية . لإنشاء ضوابط للمقارنة في لطخة نورثرن، يمكن استخدام العينات التي لا تعرض ناتج الجين محل الاهتمام بعد تحديده بواسطة المصفوفات الدقيقة أو RT-PCR . ^{[ 11 ]}

جل

تُفصل عينات الحمض النووي الريبوزي (RNA) عادةً على هلامات الأغاروز المحتوية على الفورمالديهايد كعامل مُفسِّخ للحد من البنية الثانوية للحمض النووي الريبوزي. ^{[ 11 ] [ 12 ]} يمكن تلوين الهلامات ببروميد الإيثيديوم (EtBr) وفحصها تحت ضوء الأشعة فوق البنفسجية لمراقبة جودة وكمية الحمض النووي الريبوزي قبل عملية النقل. ^{[ 11 ]} كما يمكن استخدام الرحلان الكهربائي على هلام متعدد الأكريلاميد مع اليوريا في فصل الحمض النووي الريبوزي، ولكنه يُستخدم غالبًا مع الحمض النووي الريبوزي المُجزأ أو الحمض النووي الريبوزي الميكروي. ^{[ 13 ]} غالبًا ما يُجرى فصل سلم الحمض النووي الريبوزي جنبًا إلى جنب مع العينات على هلام الرحلان الكهربائي لمراقبة حجم الشظايا المُتحصل عليها، ولكن في عينات الحمض النووي الريبوزي الكلي، يمكن أن تعمل الوحدات الفرعية للريبوسوم كعلامات للحجم. ^{[ 11 ]} بما أن الوحدة الريبوسومية الكبيرة هي 28S (حوالي 5 كيلوبايت) والوحدة الريبوسومية الصغيرة هي 18S (حوالي 2 كيلوبايت)، يظهر شريطان بارزان على الهلام، أحدهما أكبر بكثافة تقارب ضعف كثافة الشريط الأصغر. ^{[ 11 ] [ 14 ]}

تتيح تقنية التلطيخ الشمالي مراقبة نمط التعبير الجيني لجين معين بين الأنسجة والأعضاء ومراحل النمو ومستويات الإجهاد البيئي والعدوى المرضية، وأثناء العلاج. ^{[ 9 ] [ 15 ] [ 17 ]} وقد استُخدمت هذه التقنية لإظهار فرط التعبير عن الجينات الورمية وانخفاض تنظيم الجينات الكابتة للأورام في الخلايا السرطانية مقارنةً بالأنسجة الطبيعية، ^{[ 11 ]} بالإضافة إلى التعبير الجيني في رفض الأعضاء المزروعة. ^{[ 18 ]} إذا لوحظ ارتفاع في مستوى التعبير عن جين ما من خلال وفرة الحمض النووي الريبوزي الرسول (mRNA) في التلطيخ الشمالي، فيمكن حينها تسلسل العينة لتحديد ما إذا كان الجين معروفًا للباحثين أم أنه اكتشاف جديد. ^{[ 18 ]} ويمكن لأنماط التعبير التي يتم الحصول عليها في ظل ظروف معينة أن توفر نظرة ثاقبة لوظيفة ذلك الجين. بما أن الحمض النووي الريبوزي (RNA) يُفصل أولاً حسب الحجم، فإذا استُخدم نوع واحد فقط من المجسات، فإن التباين في مستوى كل حزمة على الغشاء يُمكن أن يُشير إلى حجم الناتج، مما يُوحي بوجود نواتج ربط بديلة لنفس الجين أو أنماط تسلسلية متكررة. ^{[ 8 ] [ 14 ]} كما يُمكن أن يُشير التباين في حجم ناتج الجين إلى وجود حذف أو أخطاء في معالجة النسخ. ومن خلال تغيير هدف المجس المستخدم على طول التسلسل المعروف، يُمكن تحديد المنطقة المفقودة من الحمض النووي الريبوزي. ^{[ 2 ]}

يمكن تحليل التعبير الجيني باستخدام عدة طرق مختلفة، منها تفاعل البوليميراز المتسلسل العكسي (RT-PCR)، واختبارات حماية الحمض النووي الريبوزي (RNase)، والمصفوفات الدقيقة، وتسلسل الحمض النووي الريبوزي ( RNA-Seq )، والتحليل التسلسلي للتعبير الجيني (SAGE)، بالإضافة إلى تقنية التلطيخ الشمالي. ^{[ 4 ] [ 5 ]} تُستخدم المصفوفات الدقيقة على نطاق واسع، وتتوافق نتائجها عادةً مع البيانات المُستقاة من التلطيخ الشمالي؛ ومع ذلك، قد يتمكن التلطيخ الشمالي أحيانًا من رصد تغيرات طفيفة في التعبير الجيني لا تستطيع المصفوفات الدقيقة رصدها. ^{[ 19 ]} تتمثل ميزة المصفوفات الدقيقة على التلطيخ الشمالي في إمكانية تصوير آلاف الجينات في وقت واحد، بينما يقتصر التلطيخ الشمالي عادةً على جين واحد أو عدد قليل من الجينات. ^{[ 17 ] [ 19 ]}

تُعدّ مشكلة تحلل العينات بواسطة إنزيمات الريبونيوكلياز (سواءً كانت داخلية المنشأ أو ناتجة عن التلوث البيئي) من أبرز المشاكل في تقنية التلطيخ الشمالي، ويمكن تجنب ذلك بتعقيم الأدوات الزجاجية بشكل صحيح واستخدام مثبطات إنزيمات الريبونيوكلياز مثل ثنائي إيثيل بيروكربونات (DEPC ). ^{[ 5 ]} قد تُشكّل المواد الكيميائية المستخدمة في معظم تقنيات التلطيخ الشمالي خطرًا على الباحث، إذ يُعدّ كلٌّ من الفورمالديهايد والمواد المشعة وبروميد الإيثيديوم وثنائي إيثيل بيروكربونات والأشعة فوق البنفسجية مواد ضارة عند التعرض لها بجرعات معينة. ^{[ 11 ]} بالمقارنة مع تفاعل البوليميراز المتسلسل العكسي (RT-PCR)، يتميز التلطيخ الشمالي بحساسية منخفضة، ولكنه يتميز أيضًا بخصوصية عالية، وهو أمر بالغ الأهمية لتقليل النتائج الإيجابية الكاذبة. ^{[ 11 ]}

تشمل مزايا استخدام تقنية التلطيخ الشمالي الكشف عن حجم الحمض النووي الريبي، وملاحظة منتجات التضفير البديلة، واستخدام المجسات ذات التماثل الجزئي، وإمكانية قياس جودة وكمية الحمض النووي الريبي على الهلام قبل التلطيخ، وإمكانية تخزين الأغشية وإعادة فحصها لسنوات بعد التلطيخ. ^{[ 11 ]}

في تقنية التلطيخ الشمالي للكشف عن الحمض النووي الريبوزي المرسال لإنزيم أستيل كولين إستراز ، تمت مقارنة التقنية غير المشعة بتقنية مشعة، ووجد أنها بنفس حساسية التقنية المشعة، ولكنها لا تتطلب أي حماية من الإشعاع وتستغرق وقتًا أقل. ^{[ 20 ]}

يستخدم الباحثون أحيانًا نوعًا مختلفًا من هذه التقنية يُعرف باسم "التلطيخ الشمالي العكسي". في هذه التقنية، يكون الحمض النووي الركيزة (المثبت على الغشاء) عبارة عن مجموعة من شظايا الحمض النووي المعزولة، بينما يكون المجس عبارة عن حمض نووي ريبوزي (RNA) مستخلص من نسيج وموسوم إشعاعيًا. ويُعدّ استخدام المصفوفات الدقيقة للحمض النووي، الذي انتشر استخدامه على نطاق واسع في أواخر التسعينيات وأوائل الألفية الثانية، أقرب إلى التقنية العكسية، حيث يتضمن استخدام شظايا الحمض النووي المعزولة المثبتة على ركيزة، وتهجينها مع مجس مصنوع من الحمض النووي الريبوزي الخلوي. وهكذا، فإن التقنية العكسية، رغم ندرتها في البداية، مكّنت تحليل التلطيخ الشمالي من التطور إلى تحليل التعبير الجيني ، حيث يُمكن رصد تعبير العديد من الجينات (وربما جميعها) في الكائن الحي.

• لطخة ويسترن
• لطخة شرقية
• لطخة شمال غربية
• بقعة الشرق الأقصى
• لطخة الغرب الأقصى
• شاشة عرض تفاضلية

• أوبن ويتوير