Cas9

📅 آخر تحديث: ٣ أغسطس ٢٠٢٦
✍️ نُشر في: ٣ أغسطس ٢٠٢٦
📷 يحتوي على 6 صور
الموسوعة الحرة

إنزيم Cas9 (البروتين 9 المرتبط بتقنية CRISPR) هو إنزيم نووي داخلي قاطع للحمض النووي ، وهو جزء من نظام المناعة CRISPR في البكتيريا والعتائق . وقد تم تكييفه لاستخدامه كأداة لتحرير الجينوم بتقنية CRISPR . يُستخدم نظام CRISPR-Cas9 على نطاق واسع في الهندسة الوراثية والطب والزراعة والتكنولوجيا الحيوية.

يقوم إنزيم Cas9 الداخلي بإحداث فواصل مزدوجة السلسلة في الحمض النووي في مواقع محددة، مما يتيح تعطيل الجينات أو إزالتها أو إدخالها من خلال آليات الإصلاح الخلوي مثل الربط غير المتجانس للنهايات أو إعادة التركيب المتجانس . [ 2 ]

تم اكتشاف Cas9 في بكتيريا S. pyogenes ولاحقًا في بكتيريا S. thermophilus . [ 3 ] وهو يعمل مع اثنين من جزيئات RNA الصغيرةتُدمج جزيئات crRNA و tracrRNA لتشكيل مُركّب رباعي المكونات. [ 4 ] [ 5 ] في عام 2012، دمجت دودنا وشاربنتييه جزيئات الحمض النووي الريبوزي (RNA) في جزيء واحد من الحمض النووي الريبوزي الدليلي ( gRNA )، مما مكّن إنزيم Cas9 من قطع تسلسلات محددة من الحمض النووي (DNA). حفّزت هذه التطورات جهود تعديل الجينوم، بما في ذلك مجموعات بقيادة تشانغ وتشرش اللذان أظهرا إمكانية تعديل الجينوم في الخلايا البشرية. [ 6 ] [ 7 ] [ 8 ]

تعالج متغيرات Cas9، بما في ذلك Cas9 nickase (Cas9n)، التي تُحدث فواصل في السلسلة المفردة، والإصدارات التي تتعرف على تسلسلات PAM المختلفة ، قيودًا محددة لـ Cas9. [ 9 ]

أثارت تقنية CRISPR-Cas9 مخاوف أخلاقية وتنظيمية، لا سيما فيما يتعلق بتحرير الخط الجرثومي البشري والتحسين الجيني .

تاريخ

تطور نظام CRISPR/Cas في الطبيعة كوسيلة لحماية البكتيريا من الفيروسات والبكتيريا العاثية الغازية، وذلك بإدخال أجزاء من حمضها النووي في جينوم العائل. وقد مكّن هذا النظام جهاز المناعة التكيفي من الاستجابة بشكل مناسب عند حدوث عدوى لاحقة. اكتُشف هذا النظام في بكتيريا المكورات العقدية المقيحة ، ثم وُجد لاحقًا في العديد من الأنواع الأخرى.

نهاية المقتطف

تطوير Cas9 كأداة لتحرير الجينوم

تم التعرف على بروتين Cas9 لأول مرة في بكتيريا Streptococcus pyogenes كبروتين مرتبط بتقنية CRISPR، وكان يُشار إليه في الأصل باسم Cas5، وهو بروتين يشارك في جهاز المناعة التكيفي للبكتيريا. وقد وجدت الدراسات أن Cas9 يحتوي على نطاق نوكلياز، وهو الإنزيم الفعال المسؤول عن إحداث كسور في الحمض النووي المزدوج في نظام CRISPR من النوع الثاني. [ 10 ]

حدد الباحثون أن نشاط Cas9 يعتمد على جزيئين من الحمض النووي الريبي: الحمض النووي الريبي CRISPR (crRNA)، الذي يوجه الإنزيم إلى تسلسلات الحمض النووي المستهدفة، والحمض النووي الريبي CRISPR المنشط (tracrRNA)، وهو ضروري لنشاط النيوكلياز. [ 11 ]

في عام 2012، أعادت جينيفر دودنا وإيمانويل شاربنتييه هندسة إنزيم Cas9 الداخلي ليصبح نظامًا ثنائي المكونات مبسطًا، وذلك بدمج جزيئي الحمض النووي الريبوزي (RNA) في حمض نووي ريبوزي موجّه واحد ، والذي عند دمجه مع Cas9، يستطيع تحديد وقطع هدف الحمض النووي (DNA) المحدد بواسطة الحمض النووي الريبوزي الموجّه. [ 12 ] وفي العام نفسه، أظهرت الأبحاث إمكانية برمجة مكونات CRISPR Cas9 لإحداث كسور في الحمض النووي المزدوج في مواقع محددة في المختبر ، مما وضع الأساس لتعديل الجينوم.

من خلال التلاعب بتسلسل النيوكليوتيدات في الحمض النووي الريبوزي الدليل، يمكن برمجة نظام Cas9 الاصطناعي لاستهداف تسلسل الحمض النووي وقطعه لفصله. [ 12 ] وفي نفس الفترة تقريبًا، أظهر تعاونٌ ضمّ فيرجينيوس شيكشنيس ، وغاسيوناس، وبارانغو، وهورفاث، أن Cas9 من نظام CRISPR الخاص ببكتيريا S. thermophilus يمكن أيضًا إعادة برمجته عن طريق تعديل تسلسل crRNA الخاص به لاستهداف مواقع محددة في الحمض النووي.

في عام 2013، أعلنت مجموعات بحثية بقيادة فينغ تشانغ وجورج تشيرش عن نجاح تعديل الحمض النووي المستهدف في الجينوم البشري، مسجلةً بذلك أول استخدام لتقنية كريسبر-كاس9 للتعديل المستهدف في الأنظمة حقيقية النواة. [ 10 ] [ 13 ] [ 14 ] [ 15 ] وقد ساهمت هذه النتائج في تطوير تقنية كريسبر-كاس9 كأداة متعددة الاستخدامات لتعديل الجينوم في مجموعة واسعة من الكائنات الحية. [ 16 ]

إضافةً إلى قطع الحمض النووي، تم تعديل نظام CRISPR Cas9 ليعمل كعوامل نسخ قابلة للبرمجة تسمح بتنشيط أو تثبيط الجينات المستهدفة. [ 17 ] وقد تم الاعتراف رسميًا بأهمية تطوير هذا النظام في عام 2020، عندما مُنحت إيمانويل شاربنتييه وجينيفر دودنا جائزة نوبل في الكيمياء لعملهما في تحرير الجينوم باستخدام CRISPR Cas9. [ 10 ]

الآلية

إنزيم Cas9 الأصلي هو إنزيم نووي داخلي يبلغ وزنه 160 كيلودالتون ويتطلب حمضًا نوويًا ريبوزيًا مرشدًا يتكون من جزيئين متميزين من الحمض النووي الريبوزي: الحمض النووي الريبوزي CRISPR (crRNA) والحمض النووي الريبوزي المنشط للنسخ ( tracrRNA ). [ 18 ]

بحث

2013

في عام 2013، أفاد كل من مالي وآخرون وجيلبرت وآخرون أن متغيرات Cas9 غير القاطعة يمكنها التحكم في منشطات أو مثبطات النسخ في تسلسلات محددة من الحمض النووي. [ 19 ] وفي العام نفسه، أفاد بيكارد وآخرون أن dCas9 يمكنه تثبيط بوليميراز الحمض النووي الريبي في المحفزات أو أثناء الاستطالة، مما يؤدي إلى إسكات الجينات. [ 20 ]

2014

في عام 2014، اقترح كل من إسفلت، سميدلر، كاتيروتشيا، وتشرش أن محركات الجينات القائمة على Cas9 يمكن أن تنشر التعديلات الجينية عبر مجموعات الكائنات الحية بأكملها. [ 21 ]

2017-19

في عام 2017، أفاد لي وآخرون أن Cas9 يمكنه استهداف نهايات جينوم فيروس التهاب الكبد B، مما يقلل من العدوى. [ 22 ]

أفاد جنسن وآخرون أن dCas9 يغير بنية الكروماتين عند دمجه مع مُعدِّلات الكروماتين . [ 23 ] كما أفاد أوجين وآخرون أن dCas9 مع FOG1 يثبط الجينات عن طريق مثيلة H3K27. [ 24 ]

أفاد لودر وآخرون أن dCas9 يثبط جينات نباتية مثل AtCSTF64 عند دمجه مع نطاقات مثبطة. [ 25 ]

في عام 2018، أفاد لي وآخرون أن Cas9 المُهندس يقلل من التأثيرات الجانبية عن طريق تغيير معدلات التفاعل. [ 26 ]

في عام 2019، أفاد تشين وبيج-مكاو أن Cas9 يثبط التكرارات الطرفية الطويلة لفيروس نقص المناعة البشرية من النوع 1، مما يؤدي إلى تحوير الجينوم الفيروسي. [ 27 ]

2020

في عام 2020، أفاد كل من أودين ورودين وسين أن متغيرات Cas9، مثل Cas9 nickase، تعمل على تحسين تحرير الجينوم عن طريق تقليل التأثيرات غير المستهدفة. [ 28 ]

2025

في عام 2025، أفاد كل من تشو، ودياو، ولي، وزملاؤهم أن apoNmeCas9 (وهو شكل خالٍ من الحمض النووي الريبي من NmeCas9) يمكنه تحفيز اكتساب فواصل CRISPR بوساطة Cas1-Cas2 في نظام من النوع II-C عندما تكون مستويات الحمض النووي الريبي CRISPR منخفضة. [ 29 ]

المناعة بوساطة تقنية كريسبر

تعمل أنظمة كريسبر في البكتيريا والعتائق كإنزيمات تقييد قابلة للبرمجة لمكافحة الفيروسات والبلازميدات. [ 30 ] تتكون مواقع كريسبر من تكرارات متناظرة قصيرة وفواصل متغيرة (24-48 نيوكليوتيدًا) تخزن تسلسلات من الحمض النووي الغريب. [ 31 ] تشفر جينات كاس المجاورة ، بما في ذلك كاس1 وكاس2 العالميين، وكاس9 الخاص بالنوع الثاني، بروتينات للمناعة. يستخدم كاس9 الحمض النووي الريبوزي الموجه (crRNA) والحمض النووي الريبوزي الموجه (tracrRNA) لتكوين مركب يستهدف ويقطع الحمض النووي الغريب المطابق لتسلسل الفاصل. [ 18 ]

التكيف

خلال مرحلة التكيف، تُدمج أنظمة كريسبر فواصل من "بروتوسبيسرز " فيروسية في موقع كريسبر. ويتطلب ذلك وجود تسلسل PAM ، مثل NGG في المكورات العقدية المقيحة ، للتعرف عليه. [ 32 ] يضمن Cas9 اكتساب الفواصل الوظيفية. [ 33 ] مع ذلك، قد تُفقد الفواصل عبر إعادة التركيب المتماثل. [ 31 ]

أُفيد أن ApoCas9 يحفز اكتساب الفواصل في أنظمة النوع II-C، ويربط نشاط الاكتساب بوفرة الحمض النووي الريبوزي CRISPR، حيث يرتبط انخفاض مستوى crRNA (كما في الخلايا التي تخضع لتكوين مصفوفات جديدة أو انكماش طبيعي للمصفوفات) بزيادة الاكتساب، بينما يرتبط ارتفاع مستوى crRNA (المصفوفات المتوسعة) بانخفاض الاكتساب. يكفي فص النيوكلياز وحده لتحفيز الاكتساب، في حين أن التنظيم المعتمد على crRNA يتطلب وجود Cas9 كامل الطول. هذا النشاط محفوظ تطوريًا عبر العديد من نظائر Cas9 من النوع II-C. [ 29 ]

معالجة كريسبر

يقوم إنزيم بوليميراز الحمض النووي الريبي بنسخ موقع CRISPR إلى pre-crRNA، والذي تتم معالجته بواسطة إنزيمات نووية داخلية محددة إلى crRNA ناضج، يحتوي كل منها على فاصل واحد وتكرار جزئي. [ 30 ]

تدخل

في مرحلة التداخل، يوجه crRNA إنزيم Cas9 مع tracrRNA إلى تسلسلات الحمض النووي الأمامية المكملة. إذا تطابق التسلسل المستهدف مع الفاصل وكان PAM موجودًا، يُحدث Cas9 فواصل في سلسلتي الحمض النووي، مما يوقف تكاثر الفيروس. [ 34 ]

تنظيم النسخ

يستطيع بروتين Cas9 غير النشط (dCas9)، الذي يفتقر إلى نشاط الإندونوكلياز، الارتباط بالحمض النووي وتنظيم عملية النسخ. [ 35 ] في الخلايا حقيقية النواة ، يستهدف dCas9 تسلسلات المحفزات لمنع ارتباط عوامل النسخ والتعبير الجيني . [ 36 ] وقد أُجريت دراسات مسحية على مستوى الجينوم باستخدام تقنية كبت التعبير الجيني القائمة على dCas9 لتحديد وظائف الجينات بشكل منهجي. [ 37 ]

إضافةً إلى استهداف الحمض النووي، فقد ثبت أن إنزيم Cas9 قادر على شطر الحمض النووي الريبوزي الرسول (mRNA) عند تهجينه مع سلاسل مفردة مكملة تحتوي على تسلسل PAM. [ 38 ] وعند دمجه مع منشطات النسخ، يمكن استخدام dCas9 لتنشيط الجينات (CRISPRa). [ 37 ]

الدراسات الهيكلية

يتميز بروتين Cas9 ببنية ثنائية الفصوص، تتألف من فص حلزوني ألفا (REC) وفص نوكلياز (NUC) يحتوي على نطاقي HNH وRuvC، ويرتبطان بواسطة حلزون جسري. [ 39 ] يحتوي فص النيوكلياز على نطاقي HNH اللذين يشقان خيوط الحمض النووي المستهدفة، وRuvC الذي يشقان الخيط غير المستهدف. [ 1 ] يتعرف نطاق التفاعل مع PAM على تسلسل NGG PAM. يحل الحمض النووي الريبوزي الدليل المفرد (sgRNA) محل معقد crRNA-tracrRNA، ويشكل بنية على شكل حرف T مع الحمض النووي المستهدف. [ 40 ] أشارت دراسة أجريت عام 2014 إلى أن نطاقي REC1 والحلزون الجسري ضروريان للتعرف على sgRNA. [ 1 ]

التحديات في تحرير البكتيريا

تستطيع أنظمة التقييد والتعديل البكتيرية تحطيم الحمض النووي الغريب المُدخل إلى الخلية. تتعرف هذه الأنظمة على تسلسلات محددة من الحمض النووي وتقوم بقطع الحمض النووي الغريب، بما في ذلك الجينات المُدخلة بواسطة Cas9، مما يعيق عملية تحرير الجينوم. [ 41 ]

التطبيقات

تحرير الجينات

يقوم إنزيم Cas9 بتعديل الجينومات في مجموعة واسعة من الكائنات الحية، بما في ذلك الخميرة ( Saccharomyces cerevisiae )، [ 42 ] والمبيضات البيضاء ( Candida albicans ) ، [ 43 ] وسمك الزيبرا ( Danio rerio )، [ 44 ] وذباب الفاكهة ( Drosophila melanogaster )، [ 45 ] والنمل ( Harpegnathos saltator و Ooceraea biroi )، [ 46 ] [ 47 ] والبعوض ( Aedes aegypti )، [ 48 ] والديدان الأسطوانية ( Caenorhabditis elegans )، [ 49 ] والنباتات، [ 50 ] والفئران ( Mus musculus domesticus )، [ 51 ] والقرود. [ 52 ]

الدفاع الخلوي

يمكن لتقنية CRISPR/Cas9 أن تساعد البكتيريا في الدفاع عن نفسها ضد الغزاة مثل العاثيات ، والبلازميدات ، وفيروسات الحمض النووي . يعمل Cas9، الموجه بواسطة الحمض النووي الريبي ( RNA) ، كإنزيم نوكلياز داخلي، حيث يستهدف الحمض النووي الغريب ويقطعه. [ 18 ] [ 40 ] يقوم Cas9 بفك الحمض النووي الغريب وقطع المواقع المطابقة، على غرار آلية التداخل الريبي (RNAi) في حقيقيات النوى .

تنظيم الجينات

تستطيع نسخ أخرى من Cas9 الارتباط بالحمض النووي دون قطعه. ويمكن استخدامها للتحكم في جينات التنشيط أو التثبيط النسخي ، وإدارة تنشيط الجينات وتثبيطها. [ 53 ] [ 54 ]

بصورة أدق، يُعد Cas9 إنزيمًا نوويًا داخليًا للحمض النووي موجهًا بواسطة الحمض النووي الريبي ، ويرتبط بنظام المناعة التكيفية CRISPR (التكرارات المتناوبة القصيرة المنتظمة المتباعدة ) في بكتيريا المكورات العقدية المقيحة . [ 18 ] [ 40 ] [ 55 ] تستخدم بكتيريا المكورات العقدية المقيحة نظام CRISPR لحفظ التسلسلات، بينما يستخدم Cas9 لاحقًا لفحص الحمض النووي الغريب وقطعه، مثل الحمض النووي للفيروسات البكتيرية الغازية أو الحمض النووي البلازميدي . [ 40 ] [ 33 ] [ 56 ] [ 32 ] يقوم Cas9 بهذا الفحص عن طريق فك الحمض النووي الغريب والتحقق من وجود مواقع مكملة لمنطقة الفاصل المكونة من 20 نيوكليوتيدًا في الحمض النووي الريبي الموجه (gRNA). إذا كان الحمض النووي مكملًا للحمض النووي الريبي الموجه، يقوم Cas9 بقطع الحمض النووي الغازي. بهذا المعنى، تُشابه آلية CRISPR-Cas9 آلية التداخل الرناوي (RNAi) في حقيقيات النوى . فإلى جانب وظيفتها الأصلية في المناعة البكتيرية، استُخدم Cas9 كأداة للهندسة الجينية لإحداث كسور ثنائية السلسلة في الحمض النووي (DNA) في مواقع محددة. ويمكن أن تؤدي هذه الكسور إلى تعطيل الجينات أو إدخال جينات غير متجانسة من خلال الربط غير المتجانس للنهايات وإعادة التركيب المتجانس على التوالي في الكائنات النموذجية . وقد مثّل البحث في متغيرات Cas9 وسيلة واعدة للتغلب على قيود تقنية CRISPR-Cas9 لتحرير الجينوم . ومن الأمثلة على ذلك Cas9 nickase (Cas9n)، وهو متغير يُحدث كسورًا أحادية السلسلة (SSBs)، أو متغيرات تتعرف على تسلسلات PAM مختلفة . [ 57 ] وإلى جانب نوكليازات أصابع الزنك وبروتينات نوكلياز المؤثر الشبيه بمنشط النسخ (TALEN)، أصبح Cas9 أداة بارزة في مجال تحرير الجينوم.

اكتسب إنزيم Cas9 زخمًا في السنوات الأخيرة لقدرته على قطع أي تسلسل تقريبًا مكمل للحمض النووي الريبوزي الدليل (guide RNA). [ 40 ] ولأن خصوصية استهداف Cas9 تنبع من تكامل الحمض النووي الريبوزي الدليل مع الحمض النووي (dNA) وليس من تعديلات على البروتين نفسه (مثل TALENs وأصابع الزنك )، فإن هندسة Cas9 لاستهداف حمض نووي جديد أمرٌ بسيط. [ 58 ] وقد تم تبسيط استهداف Cas9 من خلال هندسة حمض نووي ريبوزي دليل مفرد هجين (chiRNA). وقد أشار العلماء إلى أن محركات الجينات القائمة على Cas9 قد تكون قادرة على تعديل جينومات مجموعات كاملة من الكائنات الحية. [ 21 ] وفي عام 2015، استُخدم Cas9 لتعديل جينوم الأجنة البشرية لأول مرة. [ 59 ]

المناعة بوساطة تقنية كريسبر

للبقاء على قيد الحياة في بيئات متنوعة صعبة وغير مواتية تعجّ بالعاثيات ، طوّرت البكتيريا والعتائق آليات للتهرب من الفيروسات المفترسة ومقاومتها . ويشمل ذلك نظام كريسبر للمناعة التكيفية. عمليًا، تعمل أنظمة كريسبر/كاس كإنزيمات تقييد ذاتية البرمجة. تتكون مواقع كريسبر من تكرارات متناظرة قصيرة تظهر على فترات منتظمة، وتتألف من تكرارات كريسبر متبادلة وفواصل كريسبر متغيرة يتراوح طولها بين 24 و48 نيوكليوتيدًا. عادةً ما تُصاحب هذه المواقع جينات كريسبر المرتبطة بها (كاس). في عام 2005، اكتشفت ثلاث مجموعات بحثية منفصلة أن مناطق الفواصل متماثلة مع عناصر الحمض النووي الغريبة، بما في ذلك البلازميدات والفيروسات. وقدّمت هذه التقارير أول دليل بيولوجي على أن كريسبر قد يعمل كنظام مناعي.

يُستخدم إنزيم Cas9 بشكل متكرر كأداة لتحرير الجينوم. وقد استُخدم في التطورات الحديثة لمنع الفيروسات من التلاعب بالحمض النووي للخلايا المضيفة. وبما أن نظام CRISPR-Cas9 مُطوّر من أنظمة الجينوم البكتيري ، فإنه يُمكن استخدامه لاستهداف المادة الوراثية في الفيروسات. يُمكن أن يُشكّل استخدام إنزيم Cas9 حلاً للعديد من العدوى الفيروسية. يمتلك Cas9 القدرة على استهداف فيروسات مُحددة من خلال استهداف خيوط مُعينة من المعلومات الوراثية الفيروسية. وبشكل أكثر تحديدًا، يستهدف إنزيم Cas9 أجزاءً مُعينة من الجينوم الفيروسي، مما يمنع الفيروس من أداء وظيفته الطبيعية. [ 60 ] كما استُخدم Cas9 لتعطيل خيوط الحمض النووي DNA وRNA الضارة التي تُسبب الأمراض، بالإضافة إلى تعطيل خيوط الحمض النووي المُتحوّرة. وقد أظهر Cas9 بالفعل نتائج واعدة في تعطيل تأثيرات فيروس نقص المناعة البشرية HIV-1. فقد ثبت أن Cas9 يُثبّط التعبير عن التكرارات الطرفية الطويلة في HIV-1. وعند إدخاله في جينوم HIV-1، أظهر Cas9 القدرة على تحوير خيوط HIV-1. [ 61 ] [ 62 ] استُخدم إنزيم Cas9 أيضًا في علاج التهاب الكبد B من خلال استهداف نهايات بعض التكرارات الطرفية الطويلة في جينوم فيروس التهاب الكبد B. [ 22 ] كما استُخدم إنزيم Cas9 لإصلاح الطفرات المسببة لإعتام عدسة العين في الفئران.

الشكل 2: مراحل مناعة كريسبر

تُقسّم أنظمة CRISPR-Cas إلى ثلاثة أنواع رئيسية (النوع الأول، والنوع الثاني، والنوع الثالث) واثني عشر نوعًا فرعيًا، وذلك بناءً على محتواها الجيني واختلافاتها البنيوية. ومع ذلك، فإن السمات الأساسية التي تُميّز جميع أنظمة CRISPR-Cas هي جينات cas وبروتيناتها: إذ يُعدّ كل من cas1 وcas2 جينين أساسيين في جميع الأنواع والأنواع الفرعية، بينما تُعتبر جينات cas3 وcas9 وcas10 جينات مميزة للنوع الأول، والنوع الثاني، والنوع الثالث على التوالي.

مراحل الدفاع في تقنية كريسبر-كاس

التكيف

تتضمن عملية التكيف التعرف على الفواصل بين تكرارين متجاورين في موقع CRISPR ودمجها. يُشير مصطلح "البروتوسبيسر" إلى التسلسل الموجود على الجينوم الفيروسي الذي يُطابق الفاصل. توجد سلسلة قصيرة من النيوكليوتيدات المحفوظة بالقرب من البروتوسبيسر، تُسمى النمط المجاور للبروتوسبيسر (PAM). يُعد PAM نمطًا للتعرف يُستخدم لاكتساب قطعة الحمض النووي. [ 32 ] في النوع الثاني، يتعرف Cas9 على PAM أثناء التكيف لضمان اكتساب فواصل وظيفية. [ 33 ]

وقد لوحظ أيضاً فقدان الفواصل وحتى مجموعات من عدة فواصل بواسطة أراناز وآخرون 2004 وبورسل وآخرون 2007. وربما يحدث هذا من خلال إعادة التركيب المتماثل للمادة بين التكرارات. [ 63 ]

معالجة/تكوين حيوي بتقنية كريسبر

تتضمن عملية التعبير عن تقنية كريسبر نسخ نسخة أولية تُسمى RNA كريسبر (pre-crRNA)، والتي تُنسخ من موقع كريسبر بواسطة بوليميراز RNA . ثم تقوم إنزيمات نووية داخلية محددة بقطع pre-crRNA إلى جزيئات صغيرة من RNA كريسبر (crRNA). [ 30 ]

التداخل/الحصانة

تتضمن عملية التداخل جزيئات الحمض النووي الريبوزي الموجه (crRNA) ضمن مُركب بروتيني متعدد يُسمى CASCADE، والذي يستطيع التعرف على مناطق إدخال الحمض النووي الغريب المُكمل وتكوين أزواج قواعدية معها بشكلٍ مُحدد. ثم يتم شطر مُركب crRNA- الحمض النووي الغريب ، ولكن في حال وجود عدم تطابق بين الفاصل والحمض النووي المستهدف، أو في حال وجود طفرات في تسلسل PAM، فلن يبدأ الشطر. في الحالة الأخيرة، لا يستهدف الحمض النووي الغريب للهجوم من قِبل الخلية، وبالتالي يستمر تكاثر الفيروس ولا يكون المُضيف مُحصنًا ضد العدوى الفيروسية. قد تكون مرحلة التداخل مُختلفة ميكانيكيًا وزمنيًا عن اكتساب CRISPR والتعبير عنه، ولكن لكي يعمل نظام CRISPR بشكلٍ كامل كنظام دفاعي، يجب أن تكون جميع المراحل الثلاث فعّالة. [ 34 ]

المرحلة الأولى: دمج فواصل CRISPR. تُكتسب الفواصل الأولية والزخارف المرتبطة بها (الموضحة باللون الأحمر) عند الطرف "القائد" لمصفوفة CRISPR في الحمض النووي للخلية المضيفة. تتكون مصفوفة CRISPR من تسلسلات فاصلة (موضحة في مربعات ملونة) محاطة بتكرارات (معينات سوداء). تتطلب هذه العملية وجود Cas1 وCas2 (وCas9 في النوع الثاني [ 33 ] )، والتي يتم ترميزها في موضع cas، الذي يقع عادةً بالقرب من مصفوفة CRISPR.

المرحلة 2: التعبير عن CRISPR. يتم نسخ pre-crRNA بدءًا من المنطقة الرائدة بواسطة بوليميراز الحمض النووي الريبي المضيف ثم يتم تقسيمه بواسطة بروتينات Cas إلى crRNAs أصغر تحتوي على فاصل واحد وتكرار جزئي (يظهر على شكل بنية دبوس الشعر مع فواصل ملونة).

المرحلة الثالثة: تداخل تقنية كريسبر . يبدأ جزيء crRNA، الذي يحتوي على فاصل ذي تكامل قوي مع الحمض النووي الغريب الداخل، عملية قطع (موضحة بالمقص)، والتي تتطلب بروتينات Cas. يُعيق قطع الحمض النووي تكاثر الفيروس، مما يوفر مناعة للمضيف. قد تختلف مرحلة التداخل وظيفيًا ومؤقتًا عن اكتساب تقنية كريسبر والتعبير عنها (موضحة بالخط الأبيض الذي يقسم الخلية).

تعطيل النسخ باستخدام dCas9

يُستخدم بروتين dCas9 ، المعروف أيضًا باسم Cas9 المُفتقر إلى الإندونوكلياز، لتعديل التعبير الجيني عند تطبيقه على موقع ارتباط النسخ في الجزء المطلوب من الجين. تُعزى الوظيفة المثلى لـ dCas9 إلى آلية عمله. إذ يُثبط التعبير الجيني عند توقف إضافة النيوكليوتيدات إلى سلسلة الحمض النووي الريبوزي (RNA)، مما يُوقف استطالة تلك السلسلة، وبالتالي يؤثر على عملية النسخ. تحدث هذه العملية عند إنتاج dCas9 بكميات كبيرة، مما يُمكّنه من التأثير على أكبر عدد من الجينات في أي وقت عبر جزيء الحمض النووي الريبوزي الدليلي المُحدد للتسلسل. ونظرًا لأن dCas9 يُقلل من التعبير الجيني، فإن هذا التأثير يتضاعف عند استخدامه مع نطاقات تعديل الكروماتين الكابتة. [ 64 ] يؤدي بروتين dCas9 وظائف أخرى إلى جانب تنظيم التعبير الجيني . يمكن إضافة مُحفِّز إلى بروتين dCas9، مما يسمح لهما بالعمل معًا بكفاءة عالية لبدء أو إيقاف عملية النسخ عند تسلسلات مختلفة على طول شريط الحمض النووي. يتميز هذان البروتينان بتخصصهما في تحديد موقع تأثيرهما على الجين. ويشيع هذا التأثير في أنواع معينة من بدائيات النوى، حيث يصطف المُحفِّز وبروتين dCas9 معًا لمنع استطالة بوليمر النيوكليوتيدات المتجمعة لتكوين قطعة الحمض النووي المنسوخة. وبدون المُحفِّز، لا يُحدث بروتين dCas9 التأثير نفسه بمفرده أو مع جسم الجين. [ 65 ]

عند دراسة تأثيرات تثبيط النسخ بشكل أعمق، يتبين أن H3K27، وهو حمض أميني مكون من الهيستون، يخضع لعملية المثيلة من خلال تفاعل dCas9 مع ببتيد يُسمى FOG1. يؤدي هذا التفاعل أساسًا إلى تثبيط الجين في الجزء الطرفي C + N من معقد الأحماض الأمينية عند نقطة اتصال محددة في الجين، وبالتالي، يُنهي عملية النسخ. [ 66 ]

يُثبت dCas9 فعاليته أيضًا في تعديل بعض البروتينات التي قد تُسبب الأمراض. فعندما يرتبط dCas9 بنوع من الحمض النووي الريبوزي يُسمى الحمض النووي الريبوزي الدليل (gRNA)، فإنه يمنع تكاثر الكودونات المتكررة وتسلسلات الحمض النووي التي قد تُضر بجينوم الكائن الحي. بمعنى آخر، عند إنتاج كودونات متكررة متعددة، يُحفز ذلك استجابةً، أو يستدعي كمية كبيرة من dCas9 لمكافحة الإفراط في إنتاج هذه الكودونات، مما يؤدي إلى توقف عملية النسخ. يعمل dCas9 بالتآزر مع gRNA ويؤثر بشكل مباشر على بوليميراز الحمض النووي II، مانعًا إياه من مواصلة عملية النسخ.

يمكن إيجاد شرحٍ إضافي لكيفية عمل بروتين dCas9 من خلال استخدامه لجينومات النباتات عبر تنظيم إنتاج الجينات فيها، إما لزيادة أو تقليل خصائص معينة. يتميز نظام CRISPR-Cas9 بقدرته على رفع أو خفض مستوى التعبير الجيني. تُعد بروتينات dCas9 أحد مكونات نظام CRISPR-Cas9، وتستطيع هذه البروتينات كبح مناطق معينة من جينات النبات. يحدث هذا عندما يرتبط dCas9 بمجالات الكبح، وفي حالة النباتات، يتم تعطيل جين منظم مثل AtCSTF64. [ 67 ]

تُعدّ البكتيريا مجالًا آخر لاستخدام بروتينات dCas9. نظرًا لأنّ حقيقيات النوى تمتلك تركيبًا جينيًا أكبر من الحمض النووي (DNA) وجينومًا أوسع، فإنّ البكتيريا الأصغر حجمًا يسهل التلاعب بها. ونتيجةً لذلك، تستخدم حقيقيات النوى بروتين dCas9 لتثبيط إنزيم بوليميراز الحمض النووي الريبي (RNA polymerase) ومنعه من مواصلة عملية نسخ المادة الوراثية. [ 68 ]

الدراسات الهيكلية والكيميائية الحيوية

البنية البلورية

بنية Cas9
البنية البلورية لبروتين Cas9 المرتبط بتقنية CRISPR، استنادًا إلى PDB 5AXW بواسطة Nishimasu et al.

يتميز إنزيم Cas9 ببنية ثنائية الفصوص، حيث يقع الحمض النووي الريبوزي الدليل بين الفص الحلزوني ألفا (الأزرق) وفص النيوكلياز (السماوي والبرتقالي والرمادي). ويرتبط هذان الفصان عبر حلزون جسري واحد. يوجد نطاقان نيوكليازيان في فص النيوكلياز متعدد النطاقات، وهما RuvC (الرمادي) الذي يقطع سلسلة الحمض النووي غير المستهدفة، ونطاق HNH النيوكليازي (السماوي) الذي يقطع سلسلة الحمض النووي المستهدفة. يُشفّر نطاق RuvC بواسطة مواقع متباينة متسلسلة تتفاعل في البنية الثلاثية لتشكيل نطاق قطع RuvC (انظر الشكل على اليمين).

البنية البلورية لبروتين Cas9 في شكله الخالي من الركيزة. [ 39 ] تم إجراء التمثيل البنيوي باستخدام برنامج UCSF Chimera.

من السمات الرئيسية للحمض النووي المستهدف احتواؤه على وحدة بنائية مجاورة للبروتوسبيسر (PAM) تتكون من تسلسل ثلاثي النوكليوتيدات NGG. يتم التعرف على هذه الوحدة البنائية بواسطة نطاق التفاعل مع الوحدات البنائية (نطاق PI، باللون البرتقالي) الموجود بالقرب من الطرف الكربوكسيلي لبروتين Cas9. يخضع بروتين Cas9 لتغيرات بنيوية مميزة بين حالته الخالية من الحمض النووي ( apoenzyme )، وحالته المرتبطة بالحمض النووي الريبوزي الدليل، وحالته المرتبطة بالحمض النووي الريبوزي الدليل والحمض النووي.

يتعرف إنزيم Cas9 على بنية الحلقة الجذعية المتأصلة في موقع CRISPR، والتي تتوسط نضج معقد البروتين النووي الريبوزي crRNA-tracrRNA . [ 69 ] يقوم Cas9، المرتبط بـ RNA CRISPR (crRNA) و crRNA المنشط (tracrRNA)، بالتعرف على الحمض النووي الريبوزي المزدوج المستهدف وتحليله. [ 70 ] في بنية البلورة المشتركة الموضحة هنا، تم استبدال معقد crRNA-tracrRNA بـ RNA دليل مفرد هجين (sgRNA، باللون الأحمر) والذي ثبت أن له نفس وظيفة معقد RNA الطبيعي. [ 40 ] يتم تثبيت sgRNA، المرتبط بقاعدة الحمض النووي الريبوزي المفرد المستهدف، بواسطة Cas9 على شكل حرف T. تكشف بنية البلورة هذه لإنزيم Cas9 المرتبط بالحمض النووي عن تغيرات بنيوية مميزة في الفص الحلزوني ألفا بالنسبة لفص النيوكلياز، بالإضافة إلى موقع نطاق HNH. يتكون البروتين من فص التعرف (REC) وفص النيوكلياز (NUC). تُشكل جميع المناطق، باستثناء HNH، تفاعلات وثيقة فيما بينها ومع مُركب sgRNA-ssDNA، بينما يُشكل نطاق HNH عددًا قليلًا من الروابط مع بقية البروتين. في هيئة أخرى لمركب Cas9 مُلاحظة في البلورة، لا يظهر نطاق HNH. تُشير هذه البنى إلى مرونة نطاق HNH في تغيير بنيته.

حتى الآن، دُرست ونُشرت ثلاث بنى بلورية على الأقل. إحداها تمثل هيئة Cas9 في الحالة غير المرتبطة بالحمض النووي، [ 39 ] واثنتان تمثلان Cas9 في الحالة المرتبطة بالحمض النووي. [ 71 ] [ 1 ]

التفاعلات مع الحمض النووي الريبوزي المرشد (sgRNA)

كريسبر/كاس9

في مُركّب sgRNA-Cas9، وبناءً على البنية البلورية، تُظهر نطاقات REC1 وBH وPI روابط مهمة مع العمود الفقري أو القواعد في كلٍّ من منطقة التكرار ومنطقة الفاصل. [ 1 ] [ 71 ] وقد تم اختبار العديد من طفرات Cas9، بما في ذلك حذف نطاقي REC1 أو REC2 وطفرات الأحماض الأمينية في BH. تُظهر الطفرات المرتبطة بـ REC1 وBH نشاطًا أقل أو معدومًا مقارنةً بالنوع البري ، مما يُشير إلى أن هذين النطاقين ضروريان لتعرّف sgRNA على تسلسل التكرار واستقرار المُركّب بأكمله. على الرغم من أن التفاعلات بين تسلسل الفاصل وCas9، وكذلك بين نطاق PI ومنطقة التكرار، تحتاج إلى مزيد من الدراسات، إلا أن البلورة المشتركة تُظهر واجهة واضحة بين Cas9 وsgRNA.

انقسام الحمض النووي

يحتوي Cas9 على نطاقين نوكليازيين: نطاق نوكليازي HNH شبيه بـ McrA، ونطاق نوكليازي شبيه بـ RuvC. [ 72 ] يقوم نطاق HNH بقطع سلسلة الحمض النووي التكميلية (المستهدفة)، بينما تتولى نطاقات النوكلياز الشبيهة بـ RuvC قطع سلاسل الحمض النووي غير التكميلية (غير المستهدفة). [ 40 ] على الرغم من انخفاض التشابه في التسلسل، فإن المنطقة المتماثلة مع RNase H تتخذ بنية RuvC، وتتخذ منطقة HNH بنية مشابهة لـ T4 Endo VII، وهو أحد أفراد عائلة النوكليازات الداخلية HNH. [ 73 ]

يتطلب إنزيم Cas9 من النوع البري في بكتيريا Streptococcus pyogenes وجود أيونات المغنيسيوم (Mg²⁺ ) كعوامل مساعدة لقطع الحمض النووي DNA بوساطة الحمض النووي الريبي (RNA)، على الرغم من ملاحظة مستويات متفاوتة من النشاط في وجود أيونات فلزية ثنائية التكافؤ أخرى . [ 40 ] على سبيل المثال، في وجود أيونات المنغنيز (Mn²⁺ ) ، ثبت أن إنزيم Cas9 يُظهر قدرة على قطع الحمض النووي DNA بشكل مستقل عن الحمض النووي الريبي (RNA). [ 74 ]

إنزيم Cas9 النيوكليازي وموقع قطع الحمض النووي الخاص به

يتطلب انشطار الحمض النووي وجود وحدة بنائية مجاورة للبروتوسبيسر (PAM) تقع على السلسلة غير المستهدفة، على بعد ثلاثة نيوكليوتيدات من موقع الانشطار. [ 40 ] التسلسل البنائي المتعارف عليه لـ Cas9 في بكتيريا S. Pyogenes هو NGG، ولكن يمكن تحمل وحدات بنائية بديلة مثل NAG وNGA مع نشاط انشطار أقل. [ 75 ] [ 76 ] بينما يكون انشطار الحمض النووي بواسطة Cas9 المرتبط بالحمض النووي الريبي

رسم تخطيطي لإنزيمات النيوكلياز Cas12a و Cas9 من تقنية CRISPR ، مع توضيح موضع قطع الحمض النووي بالنسبة لتسلسلات PAM الخاصة بها في صورة مكبرة.

على الرغم من أن معدل التفاعل سريع نسبيًا ( k ≥ 700 ثانية⁻¹ ) ، إلا أن إطلاق نواتج الانشطار يكون بطيئًا جدًا ( t 1/2 = ln(2)/ k ≈ 43–91 ساعة)، مما يجعل Cas9 عمليًا إنزيمًا أحادي الدورة . [ 77 ] وقد أظهرت دراسات إضافية حول حركية Cas9 أن Cas9 المُهندس فعال في تقليل التأثيرات الجانبية غير المستهدفة عن طريق تعديل معدل التفاعل. [ 26 ] [ 78 ]

تعتمد كفاءة القطع على عدة عوامل، منها التعرف على تسلسل PAM، وتركيب النيوكليوتيدات في المنطقة التكميلية المكونة من 20 نيوكليوتيدًا في جزيء gRNAm. وتُعدّ خصائص تركيب النيوكليوتيدات في المنطقة القريبة من تسلسل PAM من أهم العوامل المؤثرة على الكفاءة. [ 79 ] [ 80 ] [ 76 ] كما أن تغيرات الطاقة الحرة للأحماض النووية ذات أهمية بالغة في تحديد نشاط القطع. [ 81 ] وعادةً ما تكون جزيئات الحمض النووي الريبوزي الدليلية التي ترتبط بالحمض النووي الريبوزي منقوص الأكسجين (DNA) مُشكّلةً بنيةً مزدوجةً تقع ضمن نطاق محدود من تغيرات الطاقة الحرة للارتباط، والذي يستبعد الارتباطات الضعيفة أو المستقرة للغاية، فعّالةً. [ 76 ] كما يمكن أن تُعيق التكوينات المستقرة لجزيئات الحمض النووي الريبوزي الدليلية عملية القطع. [ 82 ]

أنماط انقسام الحمض النووي

أظهرت الدراسة البنيوية الرائدة للنيوكلياز أن نطاق HNH يقوم بقطع دقيق بين الموضعين 18 و17 (18|17) من البروتوسبيسر ، بينما يقوم RuvC بقطع السلسلة غير المستهدفة عند المواضع المقابلة والمواضع اللاحقة. [ 40 ] أشارت محاكاة الديناميكا الجزيئية إلى أن قطع السلسلة غير المستهدفة بين الموضعين 17 و16 من التسلسل المستهدف كان أكثر تفضيلًا من الناحية الطاقية من قطعها بين الموضعين 18 و17، مما يُنتج نتوءات أحادية النوكليوتيد في الطرف 5' من الحمض النووي أحادي السلسلة. [ 83 ] والجدير بالذكر أن الباحثين أثبتوا أن هذه النتوءات تُملأ أثناء إصلاح الحمض النووي ، مما يؤدي إلى إدخالات مُوجَّهة، حيث يُستخدم النتوء 5' كقالب بواسطة بوليميراز الحمض النووي 4 (Pol4) لتفاعل الإصلاح. وقد دعمت دراسات إضافية أُجريت على الخلايا البشرية العلاقة بين القطع المتداخل والإدخالات المُوجَّهة الدقيقة. [ 84 ] [ 85 ]

يؤثر تركيب النيوكليوتيدات للقواعد الخمس الأقرب إلى تسلسل PAM في التسلسل المستهدف على نمط القطع، مما يؤثر على ما إذا كان قطع الحمض النووي حادًا أم متدرجًا. [ 86 ] في عام 2024، كشفت دراسة عالية الإنتاجية لنمط قطع Cas9 أن حوالي 85% من القطع في الموقع المستهدف يكون حادًا، بينما يحتوي حوالي 15% على نتوء 5' بطول نيوكليوتيد واحد. [ 86 ] أظهرت المواقع غير المستهدفة معدل قطع متدرج أعلى مقارنةً بالمواقع المستهدفة، حيث أظهر ما يقرب من ثلث المواقع غير المستهدفة نتوءات 5' تتراوح من 1 إلى 3 نيوكليوتيدات. وقد تبين أن أنماط التسلسل داخل المنطقة المستهدفة تُفضل تكوين قطع الحمض النووي الحادة أو المتدرجة، وارتبط القطع المتدرج بتكوين نتائج إدخال/حذف ( indel ) متوقعة. [ 87 ]

المشاكل التي تشكلها البكتيريا على عملية التحرير باستخدام كاس9

ترفض معظم العتائق والبكتيريا بشدة السماح لإنزيم Cas9 بتعديل جينومها. ويعود ذلك إلى قدرتها على إدخال حمض نووي غريب، لا يؤثر عليها، في جينومها. ومن الطرق الأخرى التي تتحدى بها هذه الخلايا إنزيم Cas9 عملية تعديل التقييد (RM). فعندما يدخل عاثية بكتيرية إلى خلية بكتيرية أو عتائقية، يستهدفها نظام RM. ثم يقوم هذا النظام بتقطيع الحمض النووي للعاثية إلى أجزاء منفصلة بواسطة إنزيمات التقييد، ويستخدم إنزيمات نوكلياز داخلية لتدمير خيوط الحمض النووي بشكل أكبر. وهذا يشكل مشكلة لتعديل Cas9 لأن نظام RM يستهدف أيضًا الجينات الغريبة التي أضافها إنزيم Cas9. [ 41 ]

تطبيقات Cas9 في ضبط النسخ

تداخل النسخ بواسطة dCas9

نظراً لقدرة Cas9 الفريدة على الارتباط بأي تسلسل مكمل تقريباً في أي جينوم ، سعى الباحثون إلى استخدام هذا الإنزيم لكبح نسخ مواقع جينومية مختلفة . ولتحقيق ذلك، يمكن استبدال الحمضين الأمينيين الحاسمين في نطاقي RuvC وHNH بالألانين ، مما يُلغي نشاط Cas9 كإنزيم نوكلياز داخلي. البروتين الناتج، والذي يُطلق عليه اسم Cas9 "الميت" أو "dCas9" اختصاراً، لا يزال قادراً على الارتباط بقوة بالحمض النووي المزدوج. وقد استُخدم هذا المتغير غير النشط تحفيزياً من Cas9 في دراسات آلية ارتباط Cas9 بالحمض النووي، وكعامل عام قابل للبرمجة لربط الحمض النووي بالحمض النووي الريبي والبروتين.

إن تفاعل dCas9 مع الحمض النووي الريبوزي المزدوج المستهدف (dsDNA) قويٌّ للغاية لدرجة أن مُفسِّخ البروتين اليوريا عالي التركيز لا يستطيع فصل مُركَّب dCas9-RNA-بروتين تمامًا عن الحمض النووي الريبوزي المزدوج المستهدف. [ 35 ] وقد تم استهداف dCas9 باستخدام جزيئات RNA مُوجِّهة أحادية مُهندسة إلى مواقع بدء النسخ في أي موضع جيني حيث يستطيع dCas9 التنافس مع بوليميراز RNA عند المُحفِّزات لإيقاف عملية النسخ. [ 88 ] كما يُمكن استهداف dCas9 إلى المنطقة المُشفِّرة للمواضع الجينية بحيث يحدث تثبيط بوليميراز RNA خلال مرحلة استطالة النسخ. [ 88 ] في حقيقيات النوى، يُمكن توسيع نطاق إسكات التعبير الجيني عن طريق استهداف dCas9 إلى تسلسلات المُعزِّز، حيث يستطيع dCas9 منع تجميع عوامل النسخ مما يؤدي إلى إسكات التعبير الجيني المُحدَّد. [ 54 ] علاوة على ذلك، يمكن تصميم الحمض النووي الريبوزي الدليلي المُزوَّد لـ dCas9 بحيث يتضمن اختلافات محددة في تسلسله المكمل، مما يُضعف تفاعل dCas9 مع تسلسله المبرمج كميًا، ويتيح للباحث ضبط مدى إسكات الجينات المُطبَّق على جين مُستهدف. [ 88 ] تُشابه هذه التقنية من حيث المبدأ تقنية التداخل الريبوزي (RNAi) ، حيث يتم تعديل التعبير الجيني على مستوى الحمض النووي الريبوزي. مع ذلك، اكتسب نهج dCas9 زخمًا كبيرًا نظرًا لقلة التأثيرات الجانبية غير المستهدفة، وبشكل عام، تأثيرات إسكات أكبر وأكثر قابلية للتكرار عند استخدام dCas9 مقارنةً بفحوصات التداخل الريبوزي. [ 89 ] إضافةً إلى ذلك، ولأن نهج dCas9 لإسكات الجينات قابل للتحكم الكمي، يُمكن للباحث الآن التحكم بدقة في مدى تثبيط جين مُستهدف، مما يُتيح الإجابة على المزيد من التساؤلات حول تنظيم الجينات ونسبها .

إلى جانب ارتباط dCas9 المباشر بالمواقع الحساسة للنسخ في الجينات، يمكن دمج dCas9 مع مجموعة متنوعة من نطاقات البروتينات المنظمة لأداء وظائف متعددة. مؤخرًا، تم دمج dCas9 مع بروتينات إعادة تشكيل الكروماتين (HDACs/HATs) لإعادة تنظيم بنية الكروماتين حول مواقع جينية مختلفة. [ 88 ] يُعد هذا الأمر مهمًا في استهداف العديد من الجينات حقيقية النواة ذات الأهمية، حيث تعيق بنى الكروماتين المغاير ارتباط Cas9. علاوة على ذلك، نظرًا لقدرة Cas9 على التفاعل مع الكروماتين المغاير ، يُفترض إمكانية استخدام هذا الإنزيم لدراسة بنية الكروماتين في مواقع جينية مختلفة. [ 88 ] بالإضافة إلى ذلك، استُخدم dCas9 في عمليات المسح الجينومي الشامل لكبح الجينات. وباستخدام مكتبات كبيرة من الحمض النووي الريبوزي الدليلي القادر على استهداف آلاف الجينات، أُجريت عمليات مسح جيني جينومي شامل باستخدام dCas9. [ 37 ]

تتمثل إحدى طرق تثبيط النسخ باستخدام Cas9 في قطع منتجات mRNA مباشرةً بواسطة إنزيم Cas9 النشط تحفيزيًا. [ 38 ] تُصبح هذه الطريقة ممكنةً من خلال تهجين الحمض النووي أحادي السلسلة (ssDNA) مع تسلسل PAM المكمل لـ ssRNA، مما يُتيح موقع ارتباط PAM ثنائي السلسلة (dsDNA-RNA) لـ Cas9. تُتيح هذه التقنية إمكانية عزل نسخ RNA الذاتية في الخلايا دون الحاجة إلى إجراء تعديلات كيميائية على RNA أو استخدام طرق وسم RNA.

تنشيط النسخ بواسطة بروتينات اندماج dCas9

على عكس إسكات الجينات، يمكن استخدام dCas9 أيضًا لتنشيط الجينات عند دمجه مع عوامل تنشيط النسخ. [ 88 ] تشمل هذه العوامل وحدات فرعية من بوليميراز الحمض النووي الريبي II البكتيري وعوامل النسخ التقليدية في حقيقيات النوى. ومؤخرًا، أُجريت أيضًا عمليات مسح على مستوى الجينوم لتنشيط النسخ باستخدام اندماجات dCas9 المسماة "CRISPRa" للتنشيط. [ 37 ]

انظر أيضاً

مراجع

  1. 1 2 3 4 5 نيشيماسو هـ، ران ف.أ، هسو ب.د، كونرمان س، شحاتة س.إ، دوهماي ن، وآخرون  . (فبراير 2014). "البنية البلورية لبروتين Cas9 في مركب مع الحمض النووي الريبوزي الدليل والحمض النووي المستهدف" . مجلة Cell . 156 (5): 935-949 . doi : 10.1016/ j.cell.2014.02.001 . PMC 4139937. PMID 24529477 .  
  2. ↑ أودين ف، رودين س م، سين ت (أغسطس 2020). " العلاج الجيني بتقنية كريسبر: التطبيقات، والقيود، والآثار المستقبلية" . مجلة فرونتيرز إن أونكولوجي . 10 : 1387. doi : 10.3389/fonc.2020.01387 . PMC 7427626. PMID 32850447 .  
  3. ↑ موجيكا إف جيه، مونتوليو إل (2016). "حول أصل تقنية كريسبر-كاس: من بدائيات النوى إلى الثدييات". اتجاهات في علم الأحياء الدقيقة . 24 (10): 811-820 . doi : 10.1016/j.tim.2016.06.005 . PMID 27401123 . 
  4. ↑ ديلتشيفا إي، تشيلينسكي ك، شارما سي إم، غونزاليس ك، تشاو واي، بيرزادا زد إيه، وآخرون . (مارس 2011). "نضج الحمض النووي الريبوزي CRISPR بواسطة الحمض النووي الريبوزي الصغير المشفر عبريًا وعامل المضيف RNase III" . مجلة Nature . 471 (7340): 602-607 . Bibcode : 2011Natur.471..602D . doi : 10.1038/nature09886 . PMC 3070239. PMID 21455174 .   
  5. ↑ بارانجو ر (نوفمبر 2015). "تنوع أنظمة المناعة والآليات الجزيئية لتقنية كريسبر-كاس" . علم الأحياء الجينومي . 16 247. doi : 10.1186/s13059-015-0816-9 . PMC 4638107. PMID 26549499 .  
  6. ↑ هسو ، ب. د.، لاندر، إ. س.، تشانغ، ف. (يونيو 2014). "تطوير وتطبيقات تقنية كريسبر-كاس9 في هندسة الجينوم" . مجلة سيل . 157 (6): 1262-1278 . doi : 10.1016/j.cell.2014.05.010 . PMC 4343198. PMID 24906146 .  
  7. ↑ كونغ إل، ران إف إيه، كوكس دي، لين إس، باريتو آر، حبيب إن، وآخرون . (فبراير 2013). " الهندسة الجينية المتعددة باستخدام أنظمة CRISPR/Cas" . مجلة ساينس . 339 (6121): 819-823 . Bibcode : 2013Sci...339..819C . doi : 10.1126/science.1231143 . PMC 3795411. PMID 23287718 .   
  8. ↑ مالي ف، يانغ إل، إسفلت كم، آتش جي، غويل إم، ديكارلو جي، وآخرون . (فبراير 2013). "هندسة الجينوم البشري الموجهة بالـ RNA عبر Cas9" . علوم . 339 (6121): 823–826 . بيب كود : 2013Sci...339..823M . دوى : 10.1126/science.1232033 . بمك 3712628 . بميد 23287722 .   
  9. ↑ مالي ب، إسفلت ك م، تشيرش ج م (أكتوبر 2013). "كاس9 كأداة متعددة الاستخدامات لهندسة الأحياء" . نيتشر ميثودز . 10 (10): 957-963 . doi : 10.1038/nmeth.2649 . PMC 4051438. PMID 24076990 .  
  10. 1 2 3 غوستيمسكايا، إي. (أغسطس 2022). "تقنية كريسبر-كاس9: تاريخ اكتشافها والاعتبارات الأخلاقية لاستخدامها في تحرير الجينوم" . الكيمياء الحيوية. بيوكيميا . 87 (8): 777-788 . doi : 10.1134/S0006297922080090 . ISSN 1608-3040 . PMC 9377665. PMID 36171658 .   
  11. ↑ ديلتشيفا إي، تشيلينسكي ك، شارما سي إم، غونزاليس ك، تشاو واي، بيرزادا زد إيه، وآخرون . (مارس 2011). "نضج الحمض النووي الريبوزي CRISPR بواسطة الحمض النووي الريبوزي الصغير المشفر عبريًا وعامل المضيف RNase III" . مجلة نيتشر . 471 (7340): 602-607 . doi : 10.1038/nature09886 . ISSN 0028-0836 . PMC 3070239 .   
  12. 1 2 جينك م، تشيلينسكي ك، فونفارا إ، هاور م، دودنا ج.أ ، شاربنتييه إ (أغسطس 2012). "إنزيم نووي داخلي قابل للبرمجة موجه بواسطة الحمض النووي الريبي المزدوج في المناعة البكتيرية التكيفية" . مجلة ساينس . 337 (6096): 816-821 . Bibcode : 2012Sci...337..816J . doi : 10.1126/science.1225829 . PMC 6286148. PMID 22745249 .  
  13. ↑ هسو ، ب. د.، لاندر، إ. س.، تشانغ، ف. (يونيو 2014). "تطوير وتطبيقات تقنية كريسبر-كاس9 في هندسة الجينوم" . مجلة سيل . 157 (6): 1262-1278 . doi : 10.1016/j.cell.2014.05.010 . PMC 4343198. PMID 24906146 .  
  14. ↑ كونغ إل، ران إف إيه، كوكس دي، لين إس، باريتو آر، حبيب إن، وآخرون . (فبراير 2013). " الهندسة الجينية المتعددة باستخدام أنظمة CRISPR/Cas" . مجلة ساينس . 339 (6121): 819-823 . Bibcode : 2013Sci...339..819C . doi : 10.1126/science.1231143 . PMC 3795411. PMID 23287718 .   
  15. ↑ مالي ف، يانغ إل، إسفلت كم، آتش جي، غويل إم، ديكارلو جي، وآخرون . (فبراير 2013). "هندسة الجينوم البشري الموجهة بالـ RNA عبر Cas9" . علوم . 339 (6121): 823–826 . بيب كود : 2013Sci...339..823M . دوى : 10.1126/science.1232033 . بمك 3712628 . بميد 23287722 .   
  16. ↑ موجيكا إف جيه، مونتوليو إل (2016). "حول أصل تقنية كريسبر-كاس: من بدائيات النوى إلى الثدييات". اتجاهات في علم الأحياء الدقيقة . 24 (10): 811-820 . doi : 10.1016/j.tim.2016.06.005 . PMID 27401123 . 
  17. ↑ لارسون إم إتش، جيلبرت إل إيه، وانغ إكس، ليم دبليو إيه، وايزمان جيه إس، تشي إل إس (نوفمبر 2013). " تداخل كريسبر (CRISPRi) للتحكم في التعبير الجيني بشكل محدد التسلسل" . بروتوكولات الطبيعة . 8 (11): 2180-2196 . doi : 10.1038/nprot.2013.132 . PMC 3922765. PMID 24136345 .  
  18. 1 2 3 4 ديلتشيفا إي، تشيلينسكي ك، شارما سي إم، غونزاليس ك، تشاو واي، بيرزادا زد إيه، وآخرون . (مارس 2011). "نضج الحمض النووي الريبوزي CRISPR بواسطة الحمض النووي الريبوزي الصغير المشفر عبريًا وعامل المضيف RNase III" . نيتشر . 471 (7340): 602-607 . Bibcode : 2011Natur.471..602D . doi : 10.1038/nature09886 . PMC 3070239. PMID 21455174 .   
  19. ↑ مالي ب، آخ ج، سترانجيس ب ب، إسفلت ك م، موسبرنر م، كوسوري س، وآخرون (سبتمبر 2013). "منشطات النسخ CAS9 لفحص خصوصية الهدف والنيكازات المزدوجة للهندسة الجينية التعاونية" . مجلة Nature Biotechnology . 31 (9): 833-838 . doi : 10.1038/nbt.2675 . PMC 3818127. PMID 23907171 .   
  20. ↑ بيكارد د، جيانغ و، ساماي ب، هوخشيلد أ، تشانغ ف، مارافيني ل أ (أغسطس 2013). " البرمجة لكبح وتنشيط التعبير الجيني البكتيري باستخدام نظام CRISPR-Cas مُهندس" . مجلة أبحاث الأحماض النووية . 41 (15): 7429-737 . doi : 10.1093/nar/gkt520 . PMC 3753641. PMID 23761437 .  
  21. 1 2 إسفلت كيه إم، سميدلر إيه إل، كاتيروتشيا إف، تشيرش جي إم (يوليو 2014). " حول محركات الجينات الموجهة بالحمض النووي الريبي لتغيير التجمعات البرية" . إي لايف . 3. doi : 10.7554/eLife.03401 . PMC 4117217. PMID 25035423 .  
  22. 1 2 لي هـ، شينغ سي، وانغ إس، يانغ إل، ليانغ واي، هوانغ واي، وآخرون . (22-03-2017). " إزالة الحمض النووي لفيروس التهاب الكبد ب المدمج باستخدام تقنية كريسبر-كاس9" . مجلة فرونتيرز في علم الأحياء الخلوي والميكروبيولوجيا المعدية . 7 : 91. doi : 10.3389/fcimb.2017.00091 . PMC 5360708. PMID 28382278 .   
  23. ↑ جنسن إد، فيريرا آر، جاكوسيناس تي، أرسوفسكا د، تشانغ جيه، دينغ إل، وآخرون . (مارس 2017). "إعادة البرمجة النسخية في الخميرة باستخدام dCas9 واستراتيجيات gRNA التوافقية" . مصانع الخلايا الميكروبية . 16 (1) 46. دوى : 10.1186/s12934-017-0664-2 . بمك 5353793 . بميد 28298224 .   
  24. ↑ أوجين إتش، رين سي، نيكوليه سي إم، بيريز إيه إيه، هالماي جيه، لي في إم، وآخرون (سبتمبر 2017). "يشير تحرير الإبيجينوم باستخدام dCas9 إلى أن اكتساب مثيلة الهيستون غير كافٍ لكبح الجينات المستهدفة" . مجلة أبحاث الأحماض النووية . 45 (17): 9901-9916 . doi : 10.1093/nar/ gkx578 . PMC 5622328. PMID 28973434 .   
  25. ↑ لودر إل جي، بول جيه دبليو، تشي واي (2017). "التنشيط أو التثبيط النسخي المتعدد في النباتات باستخدام أنظمة CRISPR-dCas9". شبكات تنظيم الجينات النباتية . طرق في البيولوجيا الجزيئية. المجلد 1629. الصفحات 167-184 . doi : 10.1007/978-1-4939-7125-1_12 . ISBN   978-1-4939-7124-4PMID 28623586​​ 
  26. 1 2 لي جيه كيه، جيونغ إي، لي جيه، جونغ إم، شين إي، كيم واي إتش، وآخرون . (أغسطس 2018). "التطور الموجه لتقنية كريسبر-كاس9 لزيادة دقتها" . نيتشر كوميونيكيشنز . 9 (1) 3048. Bibcode : 2018NatCo...9.3048L . doi : 10.1038/s41467-018-05477- x . PMC 6078992. PMID 30082838 .   
  27. ↑ تشين و، بيج-مكاو ب.س. (مارس 2019). "تعديل الجينات بتقنية كريسبر/كاس9". أكسس ساينس . ماكجرو هيل للتعليم. doi : 10.1036/1097-8542.168060 .
  28. ↑ أودين ف، رودين س م، سين ت (أغسطس 2020). " العلاج الجيني بتقنية كريسبر: التطبيقات، والقيود، والآثار المستقبلية" . مجلة فرونتيرز إن أونكولوجي . 10 : 1387. doi : 10.3389/fonc.2020.01387 . PMC 7427626. PMID 32850447 .  
  29. 1 2 Zhou X, Diao R, Li X, et al. (3 سبتمبر 2025). "يستشعر Cas9 وفرة الحمض النووي الريبوزي CRISPR لتنظيم اكتساب فواصل CRISPR" . Nature . 647 ( 8091): 1054–1062 . doi : 10.1038/s41586-025-09577-9 . PMC 12477760. PMID 40902823 .   
  30. ١ ٢ ٣ هورفاث ب، بارانجو ر (يناير ٢٠١٠). "كريسبر/كاس، الجهاز المناعي للبكتيريا والعتائق". مجلة ساينس . ٣٢٧ (٥٩٦٢): ١٦٧-١٧٠ . رمز Bibcode : 2010Sci...327..167H . doi : 10.1126/science.1179555 . PMID 20056882. S2CID 17960960 .  
  31. 1 2 ديفو إتش، غارنو جيه إي، موينو إس (13 أكتوبر 2010). "نظام كريسبر/كاس ودوره في تفاعلات العاثيات والبكتيريا". المراجعة السنوية لعلم الأحياء الدقيقة . 64 (1): 475-493 . doi : 10.1146/annurev.micro.112408.134123 . PMID 20528693 . 
  32. 1 2 3 جارنو جي إي، دوبوي مي، فيليون إم، روميرو دا، بارانغو آر، بويافال بي، وآخرون . (نوفمبر 2010). “جهاز المناعة البكتيري كريسبر / كاس يشق البكتيريا والحمض النووي البلازميد”. طبيعة . 468 (7320): 67–71 . بيب كود : 2010Natur.468...67G . سيتيسيركس 10.1.1.451.9645 . دوى : 10.1038 / طبيعة 09523 . بميد 21048762 . S2CID 205222849 .    
  33. 1 2 3 4 هيلر ر، ساماي ب، موديل جيه دبليو، وينر س، غولدبيرغ جي دبليو، بيكارد د، وآخرون . (مارس 2015). "يحدد Cas9 أهدافًا فيروسية وظيفية أثناء تكيف CRISPR-Cas" . نيتشر . 519 (7542): 199-202 . Bibcode : 2015Natur.519..199H . doi : 10.1038/nature14245 . PMC 4385744. PMID 25707807 .   
  34. 1 2 كارغينوف إف في، هانون جي جي (يناير 2010). "نظام كريسبر: الدفاع الموجه بواسطة الحمض النووي الريبي الصغير في البكتيريا والعتائق" . الخلية الجزيئية . 37 (1): 7-19 . doi : 10.1016/j.molcel.2009.12.033 . PMC 2819186. PMID 20129051 .  
  35. 1 2 ستيرنبرغ إس إتش، ريدينغ إس، جينك إم، غرين إي سي، دودنا جيه إيه (مارس 2014). "استجواب الحمض النووي بواسطة إنزيم كاس9 الداخلي الموجه بواسطة الحمض النووي الريبي بتقنية كريسبر" . نيتشر . 507 ( 7490): 62-67 . Bibcode : 2014Natur.507...62S . doi : 10.1038/nature13011 . PMC 4106473. PMID 24476820 .  
  36. ↑ جيلبرت إل إيه، لارسون إم إتش، مورسوت إل، ليو زد، برار جي إيه، توريس إس إي، وآخرون . (يوليو 2013). " تنظيم النسخ في حقيقيات النوى باستخدام تقنية كريسبر عبر الحمض النووي الريبوزي المعياري" . مجلة الخلية . 154 (2): 442-451 . doi : 10.1016/j.cell.2013.06.044 . PMC 3770145. PMID 23849981 .   
  37. 1 2 3 4 جيلبرت إل إيه، هورلبيك إم إيه، أدامسون بي، فيلالتا جيه إي، تشين واي، وايتهيد إي إتش، وآخرون . (أكتوبر 2014). "التحكم في كبت وتنشيط الجينات على نطاق الجينوم باستخدام تقنية كريسبر" . مجلة سيل . 159 (3): 647-661 . doi : 10.1016/j.cell.2014.09.029 . PMC 4253859. PMID 25307932 .   
  38. 1 2 أوكونيل إم آر، أوكس بي إل، ستيرنبرغ إس إتش، إيست-سيليتسكي إيه، كابلان إم، دودنا جيه إيه (ديسمبر 2014). "التعرف على الحمض النووي الريبي القابل للبرمجة وقطعه بواسطة CRISPR/Cas9" . نيتشر . 516 (7530): 263-266 . Bibcode : 2014Natur.516..263O . doi : 10.1038/nature13769 . PMC 4268322. PMID 25274302 .  
  39. 1 2 3 جينك م، جيانغ ف، تايلور د.و، ستيرنبرغ ش.ه، كايا إ، ما إ، وآخرون . (مارس 2014). "تكشف بنى إنزيمات Cas9 الداخلية عن التنشيط التوافقي بوساطة الحمض النووي الريبي" . مجلة ساينس . 343 (6176) 1247997. doi : 10.1126/science.1247997 . PMC 4184034. PMID 24505130 .   
  40. 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 جينك م، تشيلينسكي ك، فونفارا إ، هاور م، دودنا ج.أ، شاربنتييه إ (أغسطس 2012). "إنزيم نووي داخلي قابل للبرمجة موجه بواسطة الحمض النووي الريبي المزدوج في المناعة البكتيرية التكيفية" . مجلة ساينس . 337 (6096): 816-821 . Bibcode : 2012Sci...337..816J . doi : 10.1126 /science.1225829 . PMC 6286148. PMID 22745249 .  
  41. 1 2 كوسانو ك، نايتو ت، هاندا ن، كوباياشي إ (نوفمبر 1995). "أنظمة التقييد والتعديل كطفيليات جينومية تتنافس على تسلسلات محددة" . وقائع الأكاديمية الوطنية للعلوم في الولايات المتحدة الأمريكية . 92 (24): 11095-11099 . Bibcode : 1995PNAS...9211095K . doi : 10.1073/pnas.92.24.11095 . PMC 40578. PMID 7479944 .  
  42. ↑ ديكارلو، جيه إي، نورفيل، جيه إي، مالي، بي، ريوس، إكس، آخ، جيه، تشيرش، جي إم (أبريل 2013). "الهندسة الجينية في الخميرة Saccharomyces cerevisiae باستخدام أنظمة CRISPR-Cas" . مجلة أبحاث الأحماض النووية . 41 (7): 4336-4343 . doi : 10.1093/nar/gkt135 . PMC 3627607. PMID 23460208 .  
  43. ↑ فياس، في. ك.، باراسا، م. إ.، فينك، ج. ر. (2015). " نظام كريسبر في المبيضات البيضاء يسمح بالهندسة الوراثية للجينات الأساسية وعائلات الجينات" . مجلة ساينس أدفانسز . 1 (3) e1500248. رمز Bibcode : 2015SciA....1E0248V . doi : 10.1126/sciadv.1500248 . PMC 4428347. PMID 25977940 .  
  44. ↑ هوانغ واي واي، فو واي، ريون دي، مايدر إم إل، تساي إس كيو، ساندر جيه دي، وآخرون (مارس 2013). "تحرير جينومي فعال في سمك الزيبرا باستخدام نظام كريسبر-كاس" . مجلة نيتشر للتكنولوجيا الحيوية . 31 (3): 227-229 . doi : 10.1038/nbt.2501 . PMC 3686313. PMID 23360964 .   
  45. ↑ غراتز إس جيه، كامينغز إيه إم، نغوين جيه إن، هام دي سي، دونوهيو إل كيه، هاريسون إم إم، وآخرون . (أغسطس 2013). "الهندسة الجينية لذبابة الفاكهة باستخدام نوكلياز Cas9 الموجه بواسطة الحمض النووي الريبي CRISPR" . علم الوراثة . 194 (4): 1029-1035 . doi : 10.1534/genetics.113.152710 . PMC 3730909. PMID 23709638 .   
  46. ↑ يان هـ، أوباشالومفان س، مانشيني ج، يانغ هـ، غاليتو م، ملينيك ج، وآخرون . (أغسطس 2017). "طفرة هندسية في جين orco تُنتج سلوكًا اجتماعيًا شاذًا وتطورًا عصبيًا معيبًا في النمل" . مجلة Cell . 170 (4): 736–747.e9. doi : 10.1016/j.cell.2017.06.051 . PMC 5587193. PMID 28802043 .   
  47. ↑ تريبل دبليو، أوليفوس-سيسنيروس إل، ماكنزي إس كيه، ساراغوستي جيه، تشانغ إن سي، ماثيوز بي جيه، وآخرون . (أغسطس 2017). "الطفرات الوراثية في جين orco تُسبب فقدان كبيبات الفص الهوائي واضطراب السلوك الاجتماعي لدى النمل" . مجلة Cell . 170 (4): 727–735.e10. doi : 10.1016/j.cell.2017.07.001 . PMC 5556950. PMID 28802042 .   
  48. ↑ كيستلر ، ك. إي.، فوشال، ل. ب.، ماثيوز، ب. ج. (أبريل 2015). "الهندسة الجينية باستخدام تقنية كريسبر-كاس9 في بعوضة الزاعجة المصرية" . تقارير الخلية . 11 (1): 51-60 . doi : 10.1016/j.celrep.2015.03.009 . PMC 4394034. PMID 25818303 .  
  49. ↑ فريدلاند إيه إي، تزور واي بي، إسفلت كيه إم، كولاياكوفو إم بي، تشيرش جي إم، كالاركو جيه إيه (أغسطس 2013). "تعديل الجينوم الوراثي في ​​الدودة الأسطوانية C. elegans باستخدام نظام CRISPR-Cas9" . مجلة Nature Methods . 10 (8): 741-743 . doi : 10.1038/nmeth.2532 . PMC 3822328. PMID 23817069 .  
  50. ↑ جيانغ و، تشو هـ، بي هـ، فروم م، يانغ ب، ويكس د.ب. (نوفمبر 2013). "إثبات تعديل الجينات المستهدفة بواسطة تقنية CRISPR/Cas9/sgRNA في نبات الرشاد، والتبغ، والذرة الرفيعة، والأرز" . مجلة أبحاث الأحماض النووية . 41 (20): e188. doi : 10.1093/nar/ gkt780 . PMC 3814374. PMID 23999092 .  
  51. ↑ وانغ هـ، يانغ هـ، شيفاليلا س.س، دولاتي م.م، تشنغ أ.و، تشانغ ف، وآخرون . (مايو 2013). "إنتاج فئران تحمل طفرات في جينات متعددة بخطوة واحدة باستخدام هندسة الجينوم بوساطة CRISPR/Cas" . مجلة Cell . 153 (4): 910-918 . doi : 10.1016/j.cell.2013.04.025 . PMC 3969854. PMID 23643243 .   
  52. ↑ غو إكس، لي إكس جيه (يوليو 2015). " التعديل الجيني الموجه في أجنة الرئيسيات" . أبحاث الخلية . 25 (7): 767-768 . doi : 10.1038/cr.2015.64 . PMC 4493275. PMID 26032266 .  
  53. ↑ مالي ب، آخ ج، سترانجيس ب ب، إسفلت ك م، موسبرنر م، كوسوري س، وآخرون (سبتمبر 2013). "منشطات النسخ CAS9 لفحص خصوصية الهدف والنيكازات المزدوجة للهندسة الجينية التعاونية" . مجلة Nature Biotechnology . 31 (9): 833-838 . doi : 10.1038/nbt.2675 . PMC 3818127. PMID 23907171 .   
  54. 1 2 جيلبرت إل إيه، لارسون إم إتش، مورسوت إل، ليو زد، برار جي إيه، توريس إس إي، وآخرون . (يوليو 2013). " تنظيم النسخ في حقيقيات النوى باستخدام تقنية كريسبر عبر توجيه الحمض النووي الريبوزي المعياري" . مجلة الخلية . 154 (2): 442-451 . doi : 10.1016/j.cell.2013.06.044 . PMC 3770145. PMID 23849981 .   
  55. ↑ أوه إتش إس، دياز إف إم، تشو سي، كاربنتر إن، نيب دي إم (2022-01-01). "يعزز التعبير عن CRISPR-Cas9 في خطوط الخلايا المحولة وراثيًا بشكل مستقر إعادة التركيب ويختار فيروسات الهربس البسيط المُعاد تركيبها" . البحوث الحالية في علم الفيروسات . 3 100023. doi : 10.1016/j.crviro.2022.100023 . PMC 9629518. PMID 36330462 .  
  56. ↑ بارانجو ر، فريمو س، ديفو هـ، ريتشاردز م، بويفال ب، موينو س، وآخرون (مارس 2007). "تقنية كريسبر توفر مقاومة مكتسبة ضد الفيروسات في بدائيات النوى". مجلة ساينس . 315 (5819): 1709-1712 . Bibcode : 2007Sci...315.1709B . doi : 10.1126/science.1138140 . hdl : 20.500.11794/38902 . PMID 17379808. S2CID 3888761 .   
  57. ↑ أودين ف، رودين س م، سين ت (أغسطس 2020). " العلاج الجيني بتقنية كريسبر: التطبيقات، والقيود، والآثار المستقبلية" . مجلة فرونتيرز إن أونكولوجي . 10 : 1387. doi : 10.3389/fonc.2020.01387 . PMC 7427626. PMID 32850447 .  
  58. ↑ مالي ب، إسفلت ك م، تشيرش ج م (أكتوبر 2013). "كاس9 كأداة متعددة الاستخدامات لهندسة الأحياء" . نيتشر ميثودز . 10 (10): 957-963 . doi : 10.1038/nmeth.2649 . PMC 4051438. PMID 24076990 .  
  59. ↑ سيرانوسكي د، ريردون س (22 أبريل 2015). "علماء صينيون يُعدّلون وراثيًا أجنة بشرية". مجلة نيتشر . doi : 10.1038/nature.2015.17378 . S2CID 87604469 . 
  60. ↑ دودنا، جيه إيه، ومالي، بي (2016). كريسبر-كاس: دليل المختبر . كولد سبرينغ هاربور، نيويورك. ISBN 978-1-62182-130-4. OCLC 922914104 . {{cite book}}: CS1 maint: موقع الناشر مفقود ( رابط )
  61. ↑ تشين و، بيج-مكاو ب.س. (مارس 2019). "تعديل الجينات بتقنية كريسبر/كاس9". أكسس ساينس . ماكجرو هيل للتعليم. doi : 10.1036/1097-8542.168060 .
  62. ^ إبينا إتش، ميساوا إن، كانيمورا واي، كوياناجي واي (26/08/2013). "تسخير نظام كريسبر/كاس9 لتعطيل فيروس نقص المناعة البشرية-1 الكامن" . التقارير العلمية . 3 (1) 2510. بيب كود : 2013NatSR...3.2510E . دوى : 10.1038/srep02510 . بمك 3752613 . بميد 23974631 .  
  63. ↑ ديفو إتش، غارنو جيه إي، موينو إس (13 أكتوبر 2010). "نظام كريسبر/كاس ودوره في تفاعلات العاثيات والبكتيريا". المراجعة السنوية لعلم الأحياء الدقيقة . 64 (1). المراجعات السنوية: 475-493 . doi : 10.1146/annurev.micro.112408.134123 . PMID 20528693 . 
  64. ↑ جنسن إد، فيريرا آر، جاكوسيناس تي، أرسوفسكا د، تشانغ جيه، دينغ إل، وآخرون . (مارس 2017). "إعادة البرمجة النسخية في الخميرة باستخدام dCas9 واستراتيجيات gRNA التوافقية" . مصانع الخلايا الميكروبية . 16 (1) 46. دوى : 10.1186/s12934-017-0664-2 . بمك 5353793 . بميد 28298224 .   
  65. ↑ بينتو بي إس، ساكسينا تي، أوليفيرا آر، مينديز-غوميز إتش آر، كليري جيه دي، دينيس إل تي، وآخرون . (نوفمبر 2017). "إعاقة نسخ تكرارات الميكروساتلايت المتوسعة بواسطة كاس9 المعطل" . الخلية الجزيئية . 68 (3): 479-490.e5. doi : 10.1016/j.molcel.2017.09.033 . PMC 6013302. PMID 29056323 .   
  66. ↑ أوجين إتش، رين سي، نيكوليه سي إم، بيريز إيه إيه، هالماي جيه، لي في إم، وآخرون (سبتمبر 2017). "يشير تحرير الإبيجينوم باستخدام dCas9 إلى أن اكتساب مثيلة الهيستون غير كافٍ لكبح الجينات المستهدفة" . مجلة أبحاث الأحماض النووية . 45 (17): 9901-9916 . doi : 10.1093/nar/ gkx578 . PMC 5622328. PMID 28973434 .   
  67. ↑ لودر إل جي، بول جيه دبليو، تشي واي (2017). "التنشيط أو التثبيط النسخي المتعدد في النباتات باستخدام أنظمة CRISPR-dCas9". شبكات تنظيم الجينات النباتية . طرق في البيولوجيا الجزيئية. المجلد 1629. الصفحات 167-184 . doi : 10.1007/978-1-4939-7125-1_12 . ISBN   978-1-4939-7124-4PMID 28623586​​ 
  68. ↑ بارانجو ر، هورفاث ب (يونيو 2017). "عقد من الاكتشاف: وظائف وتطبيقات تقنية كريسبر". مجلة نيتشر مايكروبيولوجي . 2 (7) 17092. doi : 10.1038/nmicrobiol.2017.92 . PMID 28581505. S2CID 19072900 .  
  69. ↑ ويدنهيفت ب، ستيرنبرغ ش.هـ، دودنا ج.أ (فبراير 2012). "أنظمة إسكات الجينات الموجهة بالحمض النووي الريبي في البكتيريا والعتائق". نيتشر . 482 ( 7385): 331-338 . Bibcode : 2012Natur.482..331W . doi : 10.1038/nature10886 . PMID 22337052. S2CID 205227944 .  
  70. ↑ ران إف إيه، هسو بي دي، رايت جيه، أغاروالا في، سكوت دي إيه، تشانغ إف (نوفمبر 2013). " الهندسة الجينية باستخدام نظام CRISPR-Cas9" . بروتوكولات الطبيعة . 8 (11): 2281-2308 . doi : 10.1038/nprot.2013.143 . PMC 3969860. PMID 24157548 .  
  71. 1 2 أندرس سي، نيوهونر أو، دورست أ، جينك إم (سبتمبر 2014). "الأساس البنيوي للتعرف على الحمض النووي المستهدف بواسطة إنزيم Cas9 الداخلي المعتمد على PAM" . نيتشر . 513 ( 7519): 569-573 . Bibcode : 2014Natur.513..569A . doi : 10.1038/nature13579 . PMC 4176945. PMID 25079318 .  
  72. ↑ ماكاروفا ك.س، غريشين ن.ف، شابالينا س.أ، وولف ي.إ، كونين إ.ف (مارس 2006). "نظام مناعي افتراضي قائم على تداخل الحمض النووي الريبوزي في بدائيات النوى: تحليل حاسوبي للآلية الإنزيمية المتوقعة، والتشابهات الوظيفية مع تداخل الحمض النووي الريبوزي في حقيقيات النوى، وآليات العمل الافتراضية" . بيولوجي دايركت . 1 (1) 7. doi : 10.1186/1745-6150-1-7 . PMC 1462988. PMID 16545108 .  
  73. ↑ ماجوريك، ك. أ.، دونين-هوركافيتش، س.، ستيتشكيفيتش، ك.، موسزيفسكا، أ.، نوفوتني، م.، جينالسكي، ك.، وآخرون . (أبريل 2014). "عائلة RNase H الفائقة: أعضاء جدد، تحليل بنيوي مقارن، وتصنيف تطوري" . مجلة أبحاث الأحماض النووية . 42 (7): 4160-4179 . doi : 10.1093/nar/gkt1414 . ISSN 1362-4962 . PMC 3985635. PMID 24464998 .    
  74. ↑ سونداريسان ر، باراميشواران هـ ب، يوجيشا س د، كيلبارث م و، راجان ر (ديسمبر 2017). "أنشطة قطع الحمض النووي المستقلة عن الحمض النووي الريبي لـ Cas9 و Cas12a" . تقارير الخلية . 21 (13): 3728-3739 . doi : 10.1016/j.celrep.2017.11.100 . PMC 5760271. PMID 29281823 .  
  75. ↑ كيم ن، كيم هـ ك، لي س، سيو ج هـ، تشوي ج و، بارك ج، وآخرون . (نوفمبر 2020). "توقع نشاط الانقسام المحدد للتسلسل لمتغيرات Cas9". مجلة Nature Biotechnology . 38 (11): 1328-1336 . doi : 10.1038/s41587-020-0537-9 . PMID 32514125. S2CID 219542792 .   
  76. 1 2 3 كورسي جي آي، كو كيه، ألكان إف، بان إكس، لو واي، غورودكين جيه (مايو 2022). " يعتمد نشاط CRISPR/Cas9 gRNA على تغيرات الطاقة الحرة وسياق PAM المستهدف" . نيتشر كوميونيكيشنز . 13 (1) 3006. Bibcode : 2022NatCo..13.3006C . doi : 10.1038/s41467-022-30515-0 . PMC 9151727. PMID 35637227 .  
  77. ↑ ريبر إيه تي، ستيفنسون إيه إيه، سو زد (فبراير 2018). "رؤى وظيفية كشفت عنها الآلية الحركية لـ CRISPR/Cas9". مجلة الجمعية الكيميائية الأمريكية . 140 (8): 2971-2984 . Bibcode : 2018JAChS.140.2971R . doi : 10.1021/jacs.7b13047 . PMID 29442507 . 
  78. ↑ سينغ د، وانغ ي، مالون ج، يانغ أ، فاي ج، بودار أ، وآخرون (أبريل 2018). "آليات تحسين خصوصية بروتينات Cas9 المُهندسة كما كُشِف عنها بواسطة تحليل نقل طاقة الرنين الفلوري لجزيء واحد" . مجلة Nature Structural & Molecular Biology . 25 (4): 347–354 . doi : 10.1038/s41594-018-0051-7 . PMC 6195204. PMID 29622787 .   
  79. ↑ شو هـ، شياو ت، تشين تش، لي و، ماير سي أ، وو كيو، وآخرون . (أغسطس 2015). " محددات التسلسل لتصميم CRISPR sgRNA المحسّن" . أبحاث الجينوم . 25 (8): 1147-1157 . doi : 10.1101/gr.191452.115 . PMC 4509999. PMID 26063738 .   
  80. ↑ شيانغ إكس، كورسي جي آي، أنثون سي، كو كيه، بان إكس، ليانغ إكس، وآخرون . (مايو 2021). "تحسين التنبؤ بكفاءة استخدام الحمض النووي الريبوزي المرشد (gRNA) في تقنية كريسبر-كاس9 من خلال تكامل البيانات والتعلم العميق" . مجلة نيتشر كوميونيكيشنز . 12 (1) 3238. رمز Bibcode : 2021NatCo..12.3238X . doi : 10.1038/s41467-021-23576-0 . PMC 8163799. PMID 34050182 .   
  81. ↑ ألكان ف، وينزل أ، أنثون س، هافغارد جيه إتش، غورودكين جيه (أكتوبر 2018). "تقييم التأثيرات الجانبية لتقنية كريسبر-كاس9 باستخدام معايير طاقة الحمض النووي المزدوج" . علم الأحياء الجينومي . 19 (1) 177. doi : 10.1186/s13059-018-1534-x . PMC 6203265. PMID 30367669 .  
  82. ↑ ثايم إس بي، أحمدوفا إل، مونتاج تي جي، فالين إي، شير إيه إف (يونيو 2016). "تفاعلات الحمض النووي الريبوزي الدليل الداخلي تتداخل مع الانقسام بوساطة Cas9" . نيتشر كوميونيكيشنز . 7 (11750) 11750. Bibcode : 2016NatCo...711750T . doi : 10.1038/ncomms11750 . PMC 4906408. PMID 27282953 .  
  83. ↑ زو ز، ليو ج (نوفمبر 2016). "يؤدي انقسام الحمض النووي المحفز بواسطة Cas9 إلى توليد نهايات متداخلة: دليل من محاكاة الديناميكا الجزيئية" . التقارير العلمية . 5 (37584) 37584. Bibcode : 2016NatSR...537584Z . doi : 10.1038/srep37584 . PMC 5118739. PMID 27874072 .  
  84. ↑ شي إكس، شو جيه، مهريار إم إم، لي جيه، وانغ إل، تشانغ إم، وآخرون (أكتوبر 2019). "لا يمتلك Cas9 نشاطًا نوكليازيًا خارجيًا، مما يؤدي إلى انقسام متداخل مع نهايات بارزة وإدخالات متوقعة لثنائي وثلاثي النوكليوتيدات في تقنية CRISPR دون الحاجة إلى قالب مانح" . Cell Discovery . 5 (53) 53. doi : 10.1038/s41421-019-0120-z . PMC 6796948. PMID 31636963 .   
  85. ↑ شو جيه، لي جيه، ليو واي، وو كيو (أغسطس 2018). "إعادة ترتيب الكروموسومات بتقنية كريسبر الدقيقة والقابلة للتنبؤ تكشف مبادئ إدخال النيوكليوتيدات بوساطة كاس9" . الخلية الجزيئية . 71 (4): 498-509.e4. doi : 10.1016/j.molcel.2018.06.021 . PMID 30033371 . 
  86. 1 2 لونغو جي إم، سايولز إس، كوتيني إيه جي، هاينن إس، موكل إم إم، بيلي بي، وآخرون . (مايو 2024). "ربط أنماط انقطاع الحمض النووي المزدوج بتقنية كريسبر-كاس9 بدقة تحرير الجينات باستخدام بريك تاج" . مجلة نيتشر للتكنولوجيا الحيوية . 43 (4): 608-622 . doi : 10.1038/s41587-024-02238-8 . PMC 11994453. PMID 38740992 .   
  87. ↑ لونغو جي إم، سايولز إس، كوتيني إيه جي، هاينن إس، موكل إم إم، بيلي بي، وآخرون . (أبريل 2025). "ربط أنماط انقطاع الحمض النووي المزدوج بتقنية كريسبر-كاس9 بدقة تحرير الجينات باستخدام بريك تاج" . مجلة نيتشر للتكنولوجيا الحيوية . 43 (4): 608-622 . doi : 10.1038/s41587-024-02238-8 . ISSN 1546-1696 . PMC 11994453. PMID 38740992 .    
  88. 1 2 3 4 5 6 بيكارد د، جيانغ و، ساماي ب، هوتشيلد أ، تشانغ ف، مارافيني ل أ (أغسطس 2013). "البرمجة لكبح وتنشيط التعبير الجيني البكتيري باستخدام نظام CRISPR-Cas مُهندس" . مجلة أبحاث الأحماض النووية . 41 (15): 7429-7437 . doi : 10.1093/nar/ gkt520 . PMC 3753641. PMID 23761437 .  
  89. ↑ هاينتز جيه، لوفت سي، كيتيلر آر (2013). " حالة كريسبر لإسكات الجينات عالي الإنتاجية" . فرونتيرز إن جينيتكس . 4 : 193. doi : 10.3389/fgene.2013.00193 . PMC 3791873. PMID 24109485 .  

للمزيد من القراءة

  • نظرة عامة على جميع المعلومات الهيكلية المتاحة في PDB لـ UniProt : Q99ZW2 (Streptococcus pyogenes CRISPR-associated endonuclease Cas9/Csn1) في PDBe-KB .