مقدمة (علم الأحياء الجزيئي)

بعد إدخال قطع أوكازاكي ، تُزال بادئات الحمض النووي الريبي (تختلف آلية الإزالة بين بدائيات النوى وحقيقيات النوى ) وتُستبدل بنوكليوتيدات ديوكسي ريبونوكليوتيدية جديدة تملأ الفراغات التي كانت تشغلها بادئات الحمض النووي الريبي. ثم يقوم إنزيم ربط الحمض النووي بربط الخيوط المجزأة معًا، مُكملاً بذلك عملية تخليق الخيط المتأخر. ^{[ 1 ]}

في بدائيات النوى، يقوم بوليميراز الحمض النووي الأول بتخليق قطعة أوكازاكي حتى تصل إلى بادئ الحمض النووي الريبي السابق. ثم يعمل الإنزيم في الوقت نفسه كإنزيم نوكلياز خارجي 5′→3′ ، حيث يزيل نيوكليوتيدات البادئ من الأمام ويضيف نيوكليوتيدات الديوكسي ريبونوكليوتيدات من الخلف. تحدث كلتا عمليتي البلمرة واستئصال بادئ الحمض النووي الريبي في الاتجاه 5′→3′ ، ويمكن لبوليميراز الحمض النووي الأول القيام بهاتين العمليتين في آن واحد؛ وهذا ما يُعرف باسم "ترجمة الشق". ^{[ 1 ]} تشير ترجمة الشق إلى النشاط المتزامن لبوليميراز الحمض النووي الأول في إزالة بادئ الحمض النووي الريبي وإضافة نيوكليوتيدات الديوكسي ريبونوكليوتيدات . لاحقًا، تتشكل فجوة بين السلسلتين تُسمى شقًا، والتي تُغلق باستخدام إنزيم ربط الحمض النووي .

في حقيقيات النوى، يُعدّ إزالة بادئات الحمض النووي الريبوزي (RNA) من السلسلة المتأخرة أمرًا ضروريًا لإتمام عملية التضاعف. فعندما يقوم بوليميراز الحمض النووي δ بتخليق السلسلة المتأخرة في الاتجاه 5′→3′ ، تتشكل قطع أوكازاكي ، وهي عبارة عن سلاسل غير متصلة من الحمض النووي. وعندما يصل بوليميراز الحمض النووي إلى الطرف 5′ لبادئ الحمض النووي الريبوزي من قطعة أوكازاكي السابقة، فإنه يُزيح الطرف 5′ للبادئ إلى رفرف أحادي السلسلة من الحمض النووي الريبوزي، والذي يُزال عن طريق التحلل بواسطة النيوكلياز. يتضمن تحلل رفرف الحمض النووي الريبوزي ثلاث طرق لإزالة البادئات. ^{[ 3 ]} تتمثل الطريقة الأولى في تكوين رفرف قصير يُزال مباشرةً بواسطة إنزيم نوكلياز داخلي متخصص في بنية الرفرف 1 (FEN-1)، والذي يقطع الرفرف المتدلي من الطرف 5′. تُعرف هذه الطريقة بمسار الرفرف القصير لإزالة بادئات الحمض النووي الريبوزي. ^{[ 4 ]} الطريقة الثانية لقطع بادئ الحمض النووي الريبي (RNA) هي تحليل سلسلة الحمض النووي الريبي باستخدام إنزيم RNase ، المعروف في حقيقيات النوى باسم RNase H2. يُحلل هذا الإنزيم معظم بادئ الحمض النووي الريبي المُلتحم، باستثناء النيوكليوتيدات القريبة من الطرف 5' للبادئ. بالتالي، تظهر النيوكليوتيدات المتبقية في شكل طية تُقطع بواسطة FEN-1. تُعرف الطريقة الأخيرة لإزالة بادئ الحمض النووي الريبي بمسار الطية الطويلة. ^{[ 4 ]} في هذا المسار، يتم استقطاب عدة إنزيمات لإطالة بادئ الحمض النووي الريبي ثم قطعه. تُطال الطيات بواسطة إنزيم هيليكاز من 5' إلى 3' ، يُعرف باسم Pif1 . بعد إضافة النيوكليوتيدات إلى الطية بواسطة Pif1، يتم تثبيت الطية الطويلة بواسطة بروتين التضاعف A (RPA). يُثبّط الحمض النووي المرتبط بـ RPA نشاط أو استقطاب FEN1، مما يستدعي استقطاب نوكلياز آخر لقطع الطرف. ^{[ 3 ]} هذا النوكلياز الثاني هو نوكلياز DNA2 ، الذي يمتلك نشاطًا نوكليازيًا حلزونيًا، ويقوم بقطع الطرف الطويل من بادئ الحمض النووي الريبي، تاركًا وراءه بضعة نيوكليوتيدات يتم قطعها بواسطة FEN1. في النهاية، بعد إزالة جميع بوادئ الحمض النووي الريبي، تتشكل فجوات بين قطع أوكازاكي ، تُملأ بالديوكسي ريبونوكليوتيدات باستخدام إنزيم يُعرف باسم ليغاز 1 ، من خلال عملية تُسمى الربط .

يستخدم تفاعل البوليميراز المتسلسل ( PCR) زوجًا من البادئات المصممة خصيصًا لتوجيه استطالة الحمض النووي باتجاه بعضها البعض عند طرفي التسلسل المراد تضخيمه. يتراوح طول هذه البادئات عادةً بين 18 و24 قاعدة، وهي مكملة للمواقع المحددة في اتجاهي 5' و3' من التسلسل المراد تضخيمه. ^{[ 1 ]}

صُممت أزواج البادئات بحيث يكون لها درجات انصهار متقاربة ، لأن عملية التزاوج أثناء تفاعل البلمرة المتسلسل (PCR) تحدث لكلا السلسلتين في آنٍ واحد. يجب ألا تكون درجة الانصهار أعلى أو أقل بكثير من درجة حرارة التزاوج . فإذا كانت درجات حرارة التزاوج منخفضة جدًا، فقد تتشكل تراكيب غير محددة، مما يقلل من كفاءة التفاعل. ^{[ 5 ]}

بالإضافة إلى ذلك، يجب اختيار تسلسلات البادئات بحيث تستهدف منطقة محددة من الحمض النووي، متجنبةً احتمالية التهجين مع تسلسل مشابه مجاور. إحدى الطرق الشائعة لاختيار موقع البادئ هي البحث باستخدام برنامج BLAST ، حيث يمكن من خلاله رؤية جميع المناطق المحتملة التي قد يرتبط بها البادئ. ويمكن البحث باستخدام BLAST عن كل من تسلسل النيوكليوتيدات والبادئ نفسه. تدمج أداة Primer-BLAST المجانية من NCBI تصميم البادئات والبحث باستخدام BLAST في تطبيق واحد، ^{[ 6 ]} كما تفعل برامج تجارية مثل ePrime و Beacon Designer . ويمكن إجراء تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR) الحاسوبي لتقييم خصوصية البادئات المصممة. ^{[ 7 ]}

يتطلب اختيار منطقة محددة من الحمض النووي (DNA) لربط البادئات مراعاة بعض الجوانب الإضافية. ينبغي تجنب المناطق الغنية بتكرارات النيوكليوتيدات الأحادية والثنائية، إذ قد تتشكل حلقات فيها، مما يُسهم في حدوث تهجين خاطئ. كما أن البادئات المتكاملة مع بعضها البعض قد تؤدي إلى تكوين ثنائيات البادئات، مما يُقلل من كفاءة التفاعل المطلوب. ^{[ 8 ]} أما البادئات القادرة على الارتباط بنفسها، فقد تُشكل حلقات داخلية تُعيق التهجين مع قالب الحمض النووي. ^{[ 8 ]}

عند تصميم البادئات، يمكن إضافة قواعد نيوكليوتيدية إضافية إلى نهايات كل بادئة، مما ينتج عنه تسلسل غطاء مخصص على كل طرف من المنطقة المُضخّمة. أحد تطبيقات هذه الممارسة هو استخدامها في استنساخ TA ، وهي تقنية استنساخ فرعي خاصة مشابهة لتفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR)، حيث يمكن زيادة الكفاءة بإضافة ذيول AG إلى نهايتي 5′ و3′. ^{[ 9 ]}

قد تتطلب بعض الحالات استخدام البادئات المتغيرة. وهي عبارة عن مزيج من البادئات المتشابهة، ولكنها ليست متطابقة. قد تكون هذه البادئات ملائمة عند تضخيم نفس الجين من كائنات حية مختلفة ، حيث من المحتمل أن تكون التسلسلات متشابهة ولكنها ليست متطابقة. تُعد هذه التقنية مفيدة لأن الشفرة الوراثية نفسها متغيرة ، مما يعني أن العديد من الكودونات المختلفة يمكن أن تشفر لنفس الحمض الأميني . وهذا يسمح للكائنات الحية المختلفة بامتلاك تسلسل وراثي مختلف بشكل كبير يشفر بروتينًا شديد التشابه. لهذا السبب، تُستخدم البادئات المتغيرة أيضًا عندما يعتمد تصميم البادئات على تسلسل البروتين ، حيث أن التسلسل المحدد للكودونات غير معروف. لذلك، قد يكون تسلسل البادئ المقابل للحمض الأميني إيزولوسين هو "ATH"، حيث يرمز A إلى الأدينين ، وT إلى الثايمين ، وH إلى الأدينين أو الثايمين أو السيتوزين ، وفقًا للشفرة الوراثية لكل كودون ، باستخدام رموز الاتحاد الدولي للكيمياء البحتة والتطبيقية (IUPAC) للقواعد المتغيرة . قد لا تتهجن البادئات المتدهورة بشكل مثالي مع التسلسل المستهدف، مما قد يقلل بشكل كبير من خصوصية تضخيم تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR).

تُستخدم البادئات المتغيرة على نطاق واسع وتُعدّ بالغة الأهمية في مجال البيئة الميكروبية . فهي تُتيح تضخيم الجينات من الكائنات الدقيقة التي لم تُستزرع بعد، أو استعادة الجينات من الكائنات التي لا تتوفر معلومات جينومية عنها. عادةً ما تُصمّم البادئات المتغيرة عن طريق محاذاة تسلسل الجينات الموجود في بنك الجينات (GenBank) . وتُراعى الاختلافات بين التسلسلات باستخدام تعدد القواعد وفقًا لتسمية الاتحاد الدولي للكيمياء البحتة والتطبيقية (IUPAC). ثم تُصنّع بادئات تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR) كمزيج من البادئات التي تُطابق جميع تباديل تسلسل الكودونات.