تخليق الأوليغونوكليوتيدات

📅 آخر تحديث: ٢٦ يوليو ٢٠٢٦
✍️ نُشر في: ٢٦ يوليو ٢٠٢٦
📷 يحتوي على 13 صور
الموسوعة الحرة

تُعرف عملية تخليق الأوليغونوكليوتيدات بأنها التخليق الكيميائي لقطع قصيرة نسبيًا من الأحماض النووية ذات بنية كيميائية محددة ( تسلسل ). تُعد هذه التقنية بالغة الأهمية في الممارسات المختبرية الحالية، إذ تُتيح الوصول السريع وغير المكلف إلى أوليغونوكليوتيدات مُصممة خصيصًا بالتسلسل المطلوب. في حين أن الإنزيمات تُخلّق الحمض النووي DNA والحمض النووي الريبي RNA في اتجاه 5' إلى 3' فقط ، فإن التخليق الكيميائي للأوليغونوكليوتيدات لا يتقيد بهذا القيد، على الرغم من أنه يُجرى غالبًا في الاتجاه المعاكس، من 3' إلى 5'. حاليًا، تُنفذ هذه العملية كتخليق على الطور الصلب باستخدام طريقة الفوسفوراميديت ووحدات بناء الفوسفوراميديت المُشتقة من 2'-ديوكسي نيوكليوزيدات محمية ( dA ، dC ، dG ، و T )، أو ريبونيوكليوزيدات ( A ، C ، G ، و U )، أو نيوكليوزيدات مُعدلة كيميائيًا، مثل LNA أو BNA .

للحصول على الأوليغونوكليوتيد المطلوب، تُربط الوحدات البنائية تباعًا بسلسلة الأوليغونوكليوتيد المتنامية وفقًا لتسلسل المنتج (انظر دورة التخليق أدناه). وقد أصبحت هذه العملية مؤتمتة بالكامل منذ أواخر سبعينيات القرن الماضي. عند اكتمال تجميع السلسلة، يُفصل المنتج من الحالة الصلبة إلى المحلول، ويُزال منه مجموعات الحماية، ثم يُجمع. يفرض حدوث التفاعلات الجانبية قيودًا عملية على طول الأوليغونوكليوتيدات المُصنّعة (حتى حوالي 200 نيوكليوتيد ) نظرًا لتزايد الأخطاء مع ازدياد طول الأوليغونوكليوتيد المُصنّع. [ 1 ] غالبًا ما تُفصل المنتجات باستخدام كروماتوغرافيا السائل عالي الأداء (HPLC) للحصول على الأوليغونوكليوتيدات المطلوبة بنقاوة عالية. عادةً ما تكون الأوليغونوكليوتيدات المُصنّعة جزيئات DNA أو RNA أحادية السلسلة يتراوح طولها بين 15 و25 قاعدة.

تُستخدم قليل النوكليوتيدات في تطبيقات متنوعة في البيولوجيا الجزيئية والطب. وتُستخدم بشكل شائع كقليل النوكليوتيدات المضاد ، والحمض النووي الريبوزي المتداخل الصغير ، والبادئات لتسلسل الحمض النووي وتضخيمه ، والمجسات للكشف عن الحمض النووي أو الحمض النووي الريبوزي التكميلي عبر التهجين الجزيئي ، وأدوات لإدخال الطفرات ومواقع التقييد بشكل مُستهدف ، ولتخليق الجينات الاصطناعية . ومن التطبيقات الناشئة لتخليق قليل النوكليوتيدات إعادة إنتاج الفيروسات من التسلسل وحده، سواءً كانت غير ضارة، مثل فيروس Phi X 174 ، أو خطيرة، مثل فيروس إنفلونزا 1917 أو فيروس SARS-CoV-2 .

تاريخ

شهد تطور عملية تصنيع الأوليغونوكليوتيدات أربع طرق رئيسية لتكوين الروابط بين النيوكليوسيدات، وقد تمت مراجعتها في الأدبيات العلمية بتفصيل كبير. [ 2 ] [ 3 ] [ 4 ]

الأعمال المبكرة وتخليق الفوسفونات الهيدروجينية المعاصر

المخطط 1. i : N- كلوروسكسينيميد؛ Bn = -CH₂Ph

في أوائل الخمسينيات من القرن العشرين، كان فريق ألكسندر تود رائدًا في طرق تخليق الأوليغونوكليوتيدات باستخدام الفوسفونات الهيدروجينية وثلاثي إسترات الفوسفات . [ 5 ] [ 6 ] يُعد تفاعل المركبين 1 و 2 لتكوين ثنائي إستر الفوسفونات الهيدروجينية 3 تفاعل اقتران فوسفونات هيدروجينية في المحلول، بينما يُعد تفاعل المركبين 4 و 5 لتكوين المركب 6 تفاعل اقتران ثلاثي إستر الفوسفات (انظر تخليق ثلاثي إستر الفوسفات أدناه).

المخطط 2. تخليق قليل النوكليوتيدات بطريقة الفوسفونات الهيدروجينية

بعد ثلاثين عامًا، ألهم هذا العمل مجموعتين بحثيتين، كلٌ على حدة، لتطبيق كيمياء الفوسفونات الهيدروجينية في التخليق على الطور الصلب باستخدام أحادي إسترات الفوسفونات الهيدروجينية للنيوكليوزيد 7 كوحدات بناء، وكلوريد البيفالويل، وكلوريد 2،4،6-ثلاثي إيزوبروبيل بنزين سلفونيل (TPS-Cl)، ومركبات أخرى كمنشطات. [ 7 ] [ 8 ] أدى التطبيق العملي لطريقة الفوسفونات الهيدروجينية إلى دورة تخليقية قصيرة وبسيطة للغاية تتكون من خطوتين فقط: إزالة مجموعة التريتيل والاقتران (المخطط 2). تتم أكسدة روابط ثنائي إستر الفوسفونات الهيدروجينية بين النيوكليوزيدات في المركب 8 إلى روابط فوسفودايستر في المركب 9 باستخدام محلول اليود في البيريدين المائي في نهاية تجميع السلسلة، وليس كخطوة في الدورة التخليقية. ويمكن إجراء الأكسدة، عند الرغبة، في ظروف لا مائية. [ 9 ] بدلاً من ذلك، يمكن تحويل المركب 8 إلى فوسفوروثيوات 10 [ 10 ] [ 11 ] [ 12 ] [ 13 ] أو فوسفوروسيلينوات 11 (حيث X = Se)، [ 14 ] أو أكسدته بواسطة رابع كلوريد الكربون (CCl4 ) بوجود أمينات أولية أو ثانوية إلى نظائر فوسفوراميدات 12. [ 15 ] [ 16 ] تتميز هذه الطريقة بسهولة استخدامها ، إذ تسمح بإدخال أنواع مختلفة من تعديلات الفوسفات (فوسفات/فوسفوروثيوات/فوسفوراميدات) إلى نفس الأوليغونوكليوتيد لتعديل خصائصه. [ 17 ] [ 18 ] [ 19 ]

في أغلب الأحيان، تُحمى وحدات بناء الفوسفونات الهيدروجينية عند مجموعة الهيدروكسيل 5' ومجموعة الأمين في القواعد النيتروجينية A وC وG بنفس طريقة حماية وحدات بناء الفوسفوراميديت (انظر أدناه). مع ذلك، فإن الحماية عند مجموعة الأمين ليست إلزامية. [ 9 ] [ 20 ]

تخليق الفوسفوديستر

المخطط 3: اقتران الأوليغونوكليوتيدات بطريقة الفوسفودايستر؛ Tr = -CPh 3

في خمسينيات القرن العشرين، طوّر هار غوبيند خورانا وزملاؤه طريقة الفوسفودايستر، حيث تم تنشيط 3'- O- أسيتيل نيوكليوزيد-5'- O- فوسفات 2 (المخطط 3) باستخدام N ، N'- ثنائي سيكلوهكسيل كاربودي إيميد (DCC) أو كلوريد 4-تولوين سلفونيل (Ts-Cl). ثم تفاعلت الأنواع المنشطة مع نيوكليوزيد 1 المحمي عند 5'- O لإنتاج ثنائي نيوكليوزيد أحادي الفوسفات المحمي 3. [ 21 ] بعد إزالة مجموعة 3'- O- أسيتيل باستخدام التحلل المائي المحفز بالقاعدة ، تم إجراء إطالة إضافية للسلسلة. وباتباع هذه المنهجية، تم تصنيع مجموعات من ثلاثي ورباعي ديوكسي ريبونوكليوتيدات، ثم تم تحويلها إنزيميًا إلى قليل النوكليوتيدات أطول، مما سمح بكشف الشفرة الوراثية . تمثلت أبرز عيوب طريقة الفوسفودايستر في تكوين قليل الوحدات من البيروفوسفات وقليل النوكليوتيدات المتفرعة عند مجموعة الفوسفات بين النوكليوزيدات. ويبدو أن هذه الطريقة تمثل تراجعًا عن الكيمياء الأكثر انتقائية التي وُصفت سابقًا؛ إلا أنه في ذلك الوقت، لم تكن معظم مجموعات حماية الفوسفات المتاحة حاليًا قد طُورت بعد. وقد استلزم غياب استراتيجية حماية ملائمة اللجوء إلى كيمياء أبطأ وأقل انتقائية لتحقيق الهدف النهائي للدراسة. [ 2 ]

تخليق الفوسفوتريستر

المخطط 4. اقتران الأوليغونوكليوتيد بطريقة الفوسفوتريستر؛ MMT = -CPh 2 (4-MeOC 6 H 4 ).

في ستينيات القرن الماضي، طوّرت مجموعات بقيادة ر. ليتسينجر [ 22 ] و س. ريس [ 23 ] طريقةً تعتمد على فوسفات ثلاثي الإستر. وكان الاختلاف الجوهري عن طريقة فوسفات ثنائي الإستر هو حماية مجموعة الفوسفات في الوحدة البنائية 1 (المخطط 4) وفي الناتج 3 بمجموعة 2-سيانوإيثيل . وقد حال ذلك دون تكوين قليل النوكليوتيدات المتفرعة عند الفوسفات بين النيوكليوسيدات. وسمحت الانتقائية العالية لهذه الطريقة باستخدام عوامل ربط ومحفزات أكثر كفاءة [ 24 ] [ 25 ] ، مما قلل بشكل كبير من طول عملية التخليق. تم تطبيق الطريقة، التي تم تطويرها في البداية للتخليق في الطور السائل، أيضًا على البوليسترين "الفشار" منخفض التشابك، [ 26 ] وفي وقت لاحق على الزجاج المسامي المتحكم فيه (CPG، انظر "مادة الدعم الصلبة" أدناه)، مما أدى إلى جهد بحثي هائل في التخليق في الطور الصلب للأوليغونوكليوتيدات وأدى في النهاية إلى أتمتة تجميع سلسلة الأوليغونوكليوتيدات.

تخليق ثلاثي إسترات الفوسفيت

في سبعينيات القرن العشرين، استُخدمت بنجاح مشتقات الفوسفور الثلاثي (P(III)) الأكثر تفاعلية من النيوكليوسيدات، وهي 3'- O- كلوروفوسفيت، لتكوين روابط بين النيوكليوسيدات. [ 27 ] أدى ذلك إلى اكتشاف منهجية إستر الفوسفيت الثلاثي . استغل الفريق بقيادة م. كاروثرز مركبات 1H- تترازوليدوفوسفيت الأقل عدوانية والأكثر انتقائية، وطبقوا الطريقة على الطور الصلب. [ 28 ] بعد ذلك بوقت قصير، حسّن باحثون من نفس المجموعة الطريقة باستخدام فوسفوراميديتات النيوكليوسيد الأكثر استقرارًا كوحدات بناء. [ 29 ] أدى استخدام مجموعة 2-سيانوإيثيل فوسفيت الواقية [ 30 ] بدلًا من مجموعة الميثيل الأقل سهولة في الاستخدام [ 31 ] [ 32 ] إلى فوسفوراميديتات النيوكليوسيد المستخدمة حاليًا في تخليق قليل النوكليوتيدات (انظر وحدات بناء الفوسفوراميديت أدناه). أدت العديد من التحسينات اللاحقة في تصنيع الوحدات البنائية، وأجهزة تركيب الأوليغونوكليوتيدات، والبروتوكولات التركيبية إلى جعل كيمياء الفوسفوراميديت طريقة موثوقة وسريعة للغاية لتحضير الأوليغونوكليوتيدات الاصطناعية. [ 1 ]

التخليق بطريقة الفوسفوراميديت

لبنات البناء

فوسفوراميديتات النيوكليوزيد

فوسفوراميديتات 2'-ديوكسي نيوكليوزيد المحمية.

كما ذُكر سابقًا، فإن النيوكليوتيدات الطبيعية (فوسفات النيوكليوزيد-3' أو 5') ونظائرها من الفوسفودايستر غير نشطة بما يكفي لتحضير قليل النيوكليوتيدات بسرعة وبمردود عالٍ. تتحسن انتقائية وسرعة تكوين الروابط بين النيوكليوزيدات بشكل ملحوظ باستخدام مشتقات 3'- O- ( N , N- ثنائي إيزوبروبيل فوسفوراميديت) من النيوكليوزيدات (فوسفوراميديتات النيوكليوزيد) التي تُستخدم كوحدات بناء في منهجية ثلاثي إستر الفوسفيت. ولمنع التفاعلات الجانبية غير المرغوب فيها، يجب جعل جميع المجموعات الوظيفية الأخرى الموجودة في النيوكليوزيدات غير نشطة (محمية) عن طريق إضافة مجموعات حماية . عند اكتمال تجميع سلسلة قليل النيوكليوتيدات، تُزال جميع مجموعات الحماية للحصول على قليل النيوكليوتيدات المطلوبة. فيما يلي، يتم استعراض موجز للمجموعات الواقية المستخدمة حاليًا في الوحدات البنائية الأكثر شيوعًا من الفوسفوراميديت المتوفرة تجاريًا [ 33 ] [ 34 ] [ 35 ] [ 36 ] :

  • يتم حماية مجموعة الهيدروكسيل 5' بواسطة مجموعة DMT (4,4'-dimethoxytrityl) غير المستقرة في الوسط الحمضي.
  • لا يحتوي الثايمين واليوراسيل ، وهما قاعدتان نوويتان للثايميدين واليوريدين على التوالي، على مجموعات أمينية خارجية ، وبالتالي لا يتطلبان أي حماية.
  • على الرغم من احتواء القاعدة النووية للجوانوزين و2'-ديوكسي جوانوزين على مجموعة أمينية خارجية، إلا أن قاعديتها منخفضة لدرجة أنها لا تتفاعل مع الفوسفوراميديتات في ظروف تفاعل الاقتران . مع ذلك، فإن الفوسفوراميديت المشتق من 5'- O -DMT-2'-ديوكسي جوانوزين غير المحمي عند ذرة النيتروجين N2 ضعيف الذوبان في الأسيتونيتريل ، وهو المذيب الشائع استخدامه في تخليق قليل النوكليوتيدات. [ 37 ] في المقابل، تذوب النسخ المحمية عند ذرة النيتروجين N2 من المركب نفسه جيدًا في الأسيتونيتريل، ولذا فهي شائعة الاستخدام. تحمل قاعدتا الأدينين والسيتوزين النوويتان مجموعات أمينية خارجية تتفاعل مع الفوسفوراميديتات المنشطة في ظروف تفاعل الاقتران. باستخدام خطوات إضافية في دورة التخليق [ 38 ] [ 39 ] أو عوامل ربط وأنظمة مذيبات بديلة [ 37 ] ، يمكن تجميع سلسلة الأوليغونوكليوتيدات باستخدام فوسفوراميديتات dA وdC ذات مجموعات أمينية غير محمية. مع ذلك، لا تزال هذه الأساليب في طور البحث. في التخليق الروتيني للأوليغونوكليوتيدات، تُحفظ المجموعات الأمينية الخارجية في النيوكليوسيدات محمية بشكل دائم على طول سلسلة الأوليغونوكليوتيدات.

يجب أن تكون حماية مجموعات الأمين الخارجية متعامدة مع حماية مجموعة الهيدروكسيل 5'، لأن الأخيرة تُزال في نهاية كل دورة تركيبية. وأبسط استراتيجية للتطبيق، وبالتالي الأكثر شيوعًا، هي إضافة مجموعة حماية حساسة للقواعد على مجموعات الأمين الخارجية. في أغلب الأحيان، تُستخدم طريقتان للحماية.

2'- O -protected ribonucleoside phosphoramidites.
  • في عملية تخليق الحمض النووي الريبي (RNA)، تتم حماية مجموعة الهيدروكسيل 2' بمجموعة TBDMS ( ثلاثي بوتيل ثنائي ميثيل سيليل). [ 46 ] [ 47 ] [ 48 ] [ 49 ] أو بمجموعة TOM (ثلاثي أيزو بروبيل سيليلوكسي ميثيل)، [ 50 ] [ 51 ] وكلاهما قابل للإزالة عن طريق المعالجة بأيون الفلوريد.
  • يحتوي جزء الفوسفيت أيضًا على مجموعة ثنائي إيزوبروبيل أمينو ( iPr2N ) تتفاعل في الظروف الحمضية. عند التنشيط، تنفصل مجموعة ثنائي إيزوبروبيل أمينو ليتم استبدالها بمجموعة 5'-هيدروكسي للأوليغونوكليوتيد المرتبط بالدعامة (انظر "الخطوة 2: الاقتران" أدناه).

فوسفوراميديت غير نيوكليوزيد

فوسفوراميديتات غير نيوكليوزيدية لتعديل الطرف 5' للأوليغونوكليوتيدات الاصطناعية. MMT = أحادي ميثوكسي تريتيل، (4-ميثوكسي فينيل) ثنائي فينيل ميثيل.

الفوسفوراميديتات غير النيوكليوزيدية هي كواشف فوسفوراميديتية مصممة لإدخال وظائف متنوعة في نهايات قليل النوكليوتيدات الاصطناعية أو بين بقايا النوكليوتيدات في منتصف التسلسل. ولإدخالها داخل التسلسل، يجب أن تحتوي المُعدِّلات غير النيوكليوزيدية على مجموعتي هيدروكسيل على الأقل، إحداهما غالبًا ما تكون محمية بمجموعة DMT، بينما تحمل الأخرى جزء الفوسفوراميديت التفاعلي.

تُستخدم الفوسفوراميديتات غير النيوكليوزيدية لإدخال مجموعات مرغوبة غير موجودة في النيوكليوزيدات الطبيعية أو التي يمكن إدخالها بسهولة أكبر باستخدام تصميمات كيميائية أبسط. يوضح المخطط مجموعة مختارة من كواشف الفوسفوراميديت التجارية لتوضيح التنوع الهيكلي والوظيفي المتاح. تُستخدم هذه الكواشف لربط الفوسفات الطرفي 5' ( 1 )، [ 52 ] و NH2 ( 2 )، [ 53 ] وSH ( 3 )، [ 54 ] والألدهيد ( 4 )، [ 55 ] ومجموعات الكربوكسيل ( 5 )، [ 56 ] والروابط الثلاثية CC ( 6 )، [ 57 ] والعلامات غير المشعة والمثبطات (كما هو الحال مع 6-FAM amidite 7 [ 58 ] لربط الفلورسين وdabcyl amidite 8 ، [ 59 ] على التوالي)، والمعدلات المحبة للماء والكارهة للماء (كما هو الحال مع hexaethyleneglycol amidite 9 [ 60 ] [ 61 ] و colleture amidite 10 ، [ 62 ] على التوالي) ، و biotin amidite 11. [ 63 ]

دورة التخليق

المخطط 5. دورة التخليق لتحضير قليل النوكليوتيدات بطريقة الفوسفوراميديت.

يتم تصنيع الأوليغونوكليوتيدات عن طريق إضافة بقايا النيوكليوتيدات تدريجيًا إلى الطرف 5' للسلسلة النامية حتى يتم تجميع التسلسل المطلوب. تُعرف كل إضافة بدورة تصنيع (المخطط 5) وتتكون من أربعة تفاعلات كيميائية:

الخطوة 1: إزالة الحجب (إزالة مجموعة التريتيل)

تُزال مجموعة DMT باستخدام محلول حمضي، مثل حمض ثلاثي كلورو الأسيتيك (TCA) بتركيز 2% أو حمض ثنائي كلورو الأسيتيك (DCA) بتركيز 3%، في مذيب خامل ( ثنائي كلورو الميثان أو التولوين ). يُغسل كاتيون DMT ذو اللون البرتقالي الناتج؛ وتنتج عن هذه الخطوة طليعة أوليغونوكليوتيد مرتبطة بدعامة صلبة تحمل مجموعة هيدروكسيل حرة في الطرف 5'. تجدر الإشارة إلى أن إجراء عملية إزالة مجموعة التريتيل لفترة طويلة أو باستخدام محاليل حمضية أقوى من الموصى بها يؤدي إلى إزالة البيورين من الأوليغونوكليوتيد المرتبط بالدعامة الصلبة، وبالتالي يقلل من كمية المنتج الكامل المطلوب.

الخطوة الثانية: الربط

يُفعَّل محلولٌ بتركيز 0.02-0.2 مولار من فوسفوراميديت النيوكليوزيد (أو خليط من عدة فوسفوراميديتات) في الأسيتونيتريل بواسطة محلول بتركيز 0.2-0.7 مولار من محفز أزول حمضي ، مثل 1H- تترازول ، أو 5-إيثيل ثيو-1H-تترازول، [ 64 ] أو 2-بنزيل ثيوتترازول، [ 65 ] [ 66 ] أو 4،5-ثنائي سيانو إيميدازول ، [ 67 ] أو عدد من المركبات المشابهة. يمكن الاطلاع على معلومات أكثر تفصيلًا حول استخدام عوامل الربط المختلفة في تخليق قليل النوكليوتيدات في مراجعة حديثة. [ 68 ] عادةً ما يكون الخلط سريعًا جدًا ويحدث في خطوط السوائل لأجهزة تخليق قليل النوكليوتيدات (انظر أدناه) أثناء توصيل المكونات إلى المفاعلات التي تحتوي على دعامة صلبة. يُوضع الفوسفوراميديت المُنشَّط،  بزيادة تتراوح بين 1.5 و20 ضعفًا عن المادة المرتبطة بالدعامة، في تماس مع الدعامة الصلبة الأولية (الاقتران الأول) أو مع طليعة أوليغونوكليوتيد مرتبطة بالدعامة (الاقترانات اللاحقة)، حيث تتفاعل مجموعة الهيدروكسيل 5' الخاصة به مع جزء الفوسفوراميديت المُنشَّط في فوسفوراميديت النيوكليوزيد الداخل لتكوين رابطة ثلاثية الفوسفيت. يتميز اقتران فوسفوراميديت 2'-ديوكسي نيوكليوزيد بسرعة فائقة، ويستغرق حوالي 20  ثانية لإتمامه على نطاق صغير. في المقابل، يتطلب اقتران فوسفوراميديت 2'- O- المحمي، ذي الإعاقة الفراغية، من 5 إلى 15 دقيقة للحصول على مردود عالٍ. [ 47 ] [ 69 ] [ 70 ] [ 71 ] يتأثر التفاعل بشدة بوجود الماء، خاصةً عند استخدام محاليل مخففة من الفوسفوراميديت، ويُجرى عادةً في أسيتونيتريل لا مائي. عمومًا، كلما زاد حجم التفاعل، قلّت كمية الفوسفوراميديت الزائدة وزاد تركيزها. في المقابل، يتحدد تركيز المنشط أساسًا بذوبانيته في الأسيتونيتريل، وهو مستقل عن حجم التفاعل. بعد اكتمال عملية الاقتران، تُزال أي كواشف غير مرتبطة ونواتج ثانوية بالغسل.

الخطوة 3: التغطية

يتم تنفيذ خطوة التغطية عن طريق معالجة المادة الصلبة المرتبطة بالدعامة بمزيج من أنهيدريد الخل و1 -ميثيل إيميدازول أو، في حالات أقل، DMAP كمحفزات، وفي طريقة الفوسفوراميديت، تخدم غرضين.

  • بعد اكتمال تفاعل الاقتران، تبقى نسبة ضئيلة من مجموعات 5'-OH المرتبطة بالدعامة الصلبة (من 0.1 إلى 1%) غير متفاعلة، ويجب منعها نهائيًا من استطالة السلسلة لمنع تكوين قليل النوكليوتيدات ذي حذف قاعدة داخلية، والذي يُشار إليه عادةً باسم (n-1) shortmers. وتُؤَسْتَل مجموعات 5'-هيدروكسي غير المتفاعلة، إلى حد كبير، بواسطة خليط التغطية.
  • أُفيد أيضًا أن الفوسفوراميديتات المنشطة بواسطة 1H- تترازول تتفاعل، بدرجة طفيفة، مع الموقع O6 من الجوانوزين. [ 72 ] عند الأكسدة باستخدام اليود / الماء، يخضع هذا الناتج الجانبي، ربما عبر هجرة O6-N7، لإزالة البيورين . تُكسر المواقع الخالية من البيورين المتكونة بسهولة أثناء عملية إزالة الحماية النهائية للأوليغونوكليوتيد في ظل الظروف القاعدية (انظر أدناه) لإنتاج أوليغونوكليوتيدين أقصر، مما يقلل من مردود الناتج كامل الطول. تُزال تعديلات O6 بسرعة عن طريق المعالجة بكاشف التغطية، شريطة أن تتم خطوة التغطية قبل الأكسدة باستخدام اليود / الماء.
  • لا تتضمن عملية تصنيع فوسفوروثيوات الأوليغونوكليوتيد (OPS، انظر أدناه) الأكسدة باستخدام اليود / الماء، وبالتالي لا تعاني من التفاعل الجانبي المذكور أعلاه. من ناحية أخرى، إذا أُجريت خطوة التغطية قبل الكبرتة، فقد يحتوي الدعامة الصلبة على بقايا أنهيدريد الخل وN-ميثيل إيميدازول المتبقية بعد خطوة التغطية. يتداخل خليط التغطية مع تفاعل نقل الكبريت، مما يؤدي إلى تكوين واسع النطاق لروابط الفوسفات ثلاثية الإستر بين النيوكليوسيدات بدلاً من روابط PS ثلاثية الإستر المطلوبة. لذلك، يُنصح بإجراء خطوة الكبرتة قبل خطوة التغطية لتصنيع OPS. [ 73 ]

الخطوة الرابعة: الأكسدة

إن رابطة الفوسفيت ثلاثية التناسق المتشكلة حديثًا ليست طبيعية، كما أنها ذات استقرار محدود في ظروف تصنيع قليل النوكليوتيدات. يؤدي معالجة المادة المرتبطة بالدعامة باليود والماء في وجود قاعدة ضعيفة (البيريدين، أو اللوتيدين ، أو الكوليدين ) إلى أكسدة رابطة الفوسفيت ثلاثية التناسق إلى رابطة فوسفات رباعية التناسق، وهي طليعة محمية لرابطة الفوسفات ثنائية النوكليوزيد الطبيعية. يمكن إجراء الأكسدة في ظروف لا مائية باستخدام بيروكسيد الهيدروجين ثالثي البوتيل [ 74 ] ، أو بكفاءة أعلى، باستخدام (1S)-(+)-(10-كامفور سلفونيل)-أوكسازيريدين (CSO). [ 75 ] [ 76 ] [ 77 ] يمكن استبدال خطوة الأكسدة بخطوة الكبرتة للحصول على فوسفوروثيوات قليل النوكليوتيدات (انظر فوسفوروثيوات قليل النوكليوتيدات وتخليقها أدناه). في الحالة الأخيرة، يُفضل إجراء خطوة الكبرتة قبل عملية التغطية.

دعامات صلبة

في التخليق على الطور الصلب، يرتبط قليل النوكليوتيدات المُجمَّع تساهميًا ، عبر مجموعة الهيدروكسيل الطرفية 3' ، بمادة داعمة صلبة، ويبقى مرتبطًا بها طوال عملية تجميع السلسلة. توضع المادة الداعمة الصلبة في أعمدة تختلف أبعادها حسب حجم التخليق، وقد تتراوح بين 0.05 مل وعدة لترات. تُصنَّع الغالبية العظمى من قليلات النوكليوتيدات على نطاق صغير يتراوح بين 10 نانومول و1 ميكرومول. ومؤخرًا، أصبح التخليق عالي الإنتاجية لقليلات النوكليوتيدات، حيث توضع المادة الداعمة الصلبة في آبار لوحات متعددة الآبار (غالبًا 96 أو 384 بئرًا لكل لوحة) ، الطريقة المُفضَّلة للتخليق المتوازي لقليلات النوكليوتيدات على نطاق صغير. [ 78 ] في نهاية عملية تجميع السلسلة، يُحرَّر قليل النوكليوتيدات من المادة الداعمة الصلبة ويُغسل من العمود أو البئر.   

مادة داعمة صلبة

على عكس التخليق العضوي في الطور الصلب وتخليق الببتيدات ، فإن تخليق قليل النوكليوتيدات يتم على أفضل وجه على دعامات صلبة غير قابلة للانتفاخ أو ذات انتفاخ منخفض. وأكثر مادتين استخداماً في الطور الصلب هما الزجاج ذو المسام المتحكم بها (CPG) والبوليسترين ذو المسام الكبيرة ( MPPS). [ 79 ]

  • يُعرَّف CPG عادةً بحجم مسامه. في كيمياء الأوليغونوكليوتيدات، تُستخدم أحجام مسام تبلغ 500، 1000، 1500، 2000، و3000 أنغستروم لتحضير أوليغونوكليوتيدات بأطوال 50، 80، 100، 150، و200 وحدة على التوالي. ولجعل CPG الأصلي مناسبًا لمزيد من المعالجة، يُعالج سطح المادة بـ(3-أمينوبروبيل)تريثوكسيسيلان لإنتاج أمينوبروبيل CPG. ويمكن إطالة ذراع الأمينوبروبيل للحصول على أمينو ألكيل طويل السلسلة (LCAA) CPG. ثم تُستخدم مجموعة الأمين كنقطة تثبيت للروابط المناسبة لتخليق الأوليغونوكليوتيدات (انظر أدناه). 
  • يُعدّ MPPS، المناسب لتخليق قليل النوكليوتيدات، بوليسترين منخفض الانتفاخ وعالي التشابك، يُحضّر عن طريق بلمرة ثنائي فينيل بنزين (بنسبة 60% كحد أدنى)، والستايرين ، و4- كلوروميثيل ستايرين بوجود عامل مُولّد للمسام. ثم يُحوّل MPPS الكلوروميثيلي ذو المسام الكبيرة الناتج إلى MPPS أمينوميثيل.

كيمياء الرابط

دعامات صلبة تجارية لتخليق قليل النوكليوتيدات.
المخطط 6. آلية إزالة الفوسفات من 3' للأوليغونوكليوتيدات المجمعة على دعامات صلبة عالمية.

لجعل مادة الدعم الصلبة مناسبة لتخليق قليل النوكليوتيدات، تُربط روابط غير نوكليوزيدية أو سكسينات نوكليوزيدية تساهميًا بمجموعات الأمين التفاعلية في أمينوبروبيل CPG أو LCAA CPG أو أمينوميثيل MPPS. تُغطى مجموعات الأمين المتبقية غير المتفاعلة بأنهيدريد الخل . عادةً، تُستخدم ثلاث مجموعات مختلفة من حيث المفهوم من مواد الدعم الصلبة.

  • الدعامات العامة . في طريقة أحدث وأكثر ملاءمة وانتشارًا، تبدأ عملية التخليق بالدعامة العامة حيث يتم ربط رابط غير نيوكليوزيدي بمادة الدعامة الصلبة (المركبان 1 و 2 ). يتم ربط فوسفوراميديت، الموافق لبقايا النيوكليوزيد الطرفية 3'، بالدعامة الصلبة العامة في الدورة التركيبية الأولى لتجميع سلسلة الأوليغونوكليوتيد باستخدام البروتوكولات القياسية. ثم يستمر تجميع السلسلة حتى اكتماله، وبعد ذلك تتم إزالة الحماية عن الأوليغونوكليوتيد المرتبط بالدعامة الصلبة. السمة المميزة للدعامات الصلبة العامة هي أن إطلاق الأوليغونوكليوتيدات يحدث عن طريق التحلل المائي لرابطة PO التي تربط ذرة الأكسجين الطرفية 3' لبقايا النيوكليوتيد بالرابط العام، كما هو موضح في المخطط 6. الميزة الأساسية لهذه الطريقة هي استخدام نفس الدعامة الصلبة بغض النظر عن تسلسل الأوليغونوكليوتيد المراد تخليقه. لإزالة الرابط والفوسفات الطرفي 3' بالكامل من الأوليغونوكليوتيد المُجمَّع، يتطلب الدعامة الصلبة 1 والعديد من الدعامات الصلبة المماثلة [ 80 ] غاز الأمونيا، [ 81 ] أو محلول هيدروكسيد الأمونيوم المائي، أو محلول ميثيل أمين المائي، [ 82 ] أو مزيج منها [ 83 ] ، وهي متوفرة تجاريًا. [ 84 ] [ 85 ] أما الدعامة الصلبة 2 [ 86 ] فتتطلب محلولًا من الأمونيا في الميثانول اللامائي ، وهي متوفرة تجاريًا أيضًا. [ 87 ] [ 88 ]
  • الدعامات الصلبة النيوكليوزيدية . في نهج تاريخي رائد ولا يزال شائعًا، تُربط مجموعة الهيدروكسيل 3' لبقايا النيوكليوزيد الطرفية 3' بالدعامة الصلبة، غالبًا عبر ذراع 3'- O- سكسينيل كما في المركب 3. يبدأ تجميع سلسلة الأوليغونوكليوتيد بربط وحدة بناء الفوسفوراميديت الخاصة ببقايا النيوكليوتيد الثانية من الطرف 3'. تُزال حماية مجموعة الهيدروكسيل الطرفية 3' في الأوليغونوكليوتيدات المُصنّعة على دعامات صلبة نيوكليوزيدية في ظروف أقل قسوة من تلك المُطبقة على الدعامات الصلبة العامة. مع ذلك، فإن ضرورة اختيار الدعامة الصلبة النيوكليوزيدية بطريقة مُحددة للتسلسل تُقلل من إنتاجية عملية التخليق بأكملها وتزيد من احتمالية الخطأ البشري.
  • تُستخدم دعامات صلبة خاصة لربط المجموعات الوظيفية أو مجموعات الإبلاغ المطلوبة بالطرف 3' للأوليغونوكليوتيدات الاصطناعية. على سبيل المثال، تسمح الدعامة الصلبة التجارية [ 89 ] 4 [ 90 ] بتحضير أوليغونوكليوتيدات تحمل رابط 3-أمينوبروبيل في الطرف 3'. وعلى غرار الفوسفوراميديتات غير النيوكليوزيدية، تتوفر تجاريًا العديد من الدعامات الصلبة الخاصة الأخرى المصممة لربط المجموعات الوظيفية التفاعلية، ومجموعات الإبلاغ غير المشعة، والمعدلات الطرفية ( مثل الكوليسترول أو غيره من الروابط الكارهة للماء)، والمناسبة لتطبيقات متنوعة. يمكن الاطلاع على معلومات أكثر تفصيلًا حول مختلف الدعامات الصلبة لتخليق الأوليغونوكليوتيدات في مراجعة حديثة. [ 78 ]

تخليق فوسفوروثيوات الأوليغونوكليوتيد

روابط الفوسفوروثيوات بين النيوكليوسيدات S p و R p المتماثلة فراغياً.

تُعدّ فوسفوروثيوات الأوليغونوكليوتيدات (OPS) أوليغونوكليوتيدات مُعدّلة، حيث تُستبدل إحدى ذرات الأكسجين في مجموعة الفوسفات بذرة كبريت. وتتشابه عملية تصنيع OPS إلى حد كبير مع عملية تصنيع الأوليغونوكليوتيدات الطبيعية، إلا أن الاختلاف يكمن في استبدال خطوة الأكسدة بتفاعل نقل الكبريت (الكبرتة)، وأن خطوة التغطية تُجرى بعد الكبرتة.

الأتمتة

في الماضي، كان يتم تصنيع الأوليغونوكليوتيدات يدويًا في المحلول أو على الطور الصلب. وكان تصنيع الطور الصلب يُنفذ باستخدام أعمدة زجاجية مصغرة، تشبه في شكلها أعمدة كروماتوغرافيا الضغط المنخفض، أو محاقن مزودة بمرشحات مسامية، كحاويات للطور الصلب. [ 91 ] أما الآن، فيتم تصنيع الأوليغونوكليوتيدات على الطور الصلب تلقائيًا باستخدام أجهزة يتم التحكم فيها بواسطة الحاسوب (أجهزة تصنيع الأوليغونوكليوتيدات)، ويتم تنفيذه تقنيًا في صيغ الأعمدة، والصفائح متعددة الآبار، والمصفوفات. وتُعد صيغة الأعمدة الأنسب للأبحاث والتطبيقات واسعة النطاق التي لا تتطلب إنتاجية عالية. [ 92 ] أما صيغة الصفائح متعددة الآبار، فقد صُممت خصيصًا لتصنيع الأوليغونوكليوتيدات الاصطناعية على نطاق صغير وبإنتاجية عالية، وذلك لتلبية الطلب المتزايد من الصناعة والأوساط الأكاديمية على الأوليغونوكليوتيدات الاصطناعية. [ 93 ]

تاريخ تصنيع قليل النوكليوتيدات على نطاق متوسط ​​إلى كبير

غالبًا ما طُوّرت أجهزة تركيب الأوليغونوكليوتيدات واسعة النطاق من خلال تعزيز قدرات منصة أجهزة موجودة مسبقًا. ظهر أحد أوائل أجهزة التركيب متوسطة الحجم في أواخر ثمانينيات القرن الماضي، من إنتاج شركة Biosearch في نوفاتو، كاليفورنيا (جهاز 8800). صُممت هذه المنصة في الأصل كجهاز لتركيب الببتيدات، واستخدمت مفاعلًا ذو طبقة مميعة، وهو ضروري لاستيعاب خصائص انتفاخ دعامات البوليسترين المستخدمة في منهجية ميريفيلد. تضمن تركيب الأوليغونوكليوتيدات استخدام زجاج CPG (الزجاج ذو المسام المتحكم بها)، وهو دعامة صلبة وأكثر ملاءمة لمفاعلات الأعمدة كما ذُكر سابقًا. كان حجم جهاز 8800 محدودًا بمعدل التدفق المطلوب لتمييع الدعامة. مكّنت بعض تصميمات المفاعلات المبتكرة، بالإضافة إلى الضغوط الأعلى من المعتاد، جهاز 8800 من الوصول إلى أحجام تُنتج 1  مليمول من الأوليغونوكليوتيد. في منتصف التسعينيات، طورت عدة شركات منصات تعتمد على أجهزة كروماتوغرافيا سائلة شبه تحضيرية وتحضيرية. كانت هذه الأنظمة ملائمة تمامًا لنهج المفاعل العمودي. في معظم الحالات، كان المطلوب فقط زيادة عدد السوائل التي يمكن توصيلها إلى العمود. يتطلب تخليق الأوليغونوكليوتيدات 10 على الأقل، بينما تستوعب أجهزة الكروماتوغرافيا السائلة عادةً 4 فقط. كانت هذه مهمة تصميم سهلة، وقد نجحت بعض الاستراتيجيات شبه الآلية دون أي تعديلات على معدات الكروماتوغرافيا السائلة الموجودة مسبقًا. كانت شركتا PerSeptive Biosystems وPharmacia (GE) من بين العديد من الشركات التي طورت أجهزة تخليق باستخدام أجهزة الكروماتوغرافيا السائلة. وكانت شركة Genomic Technologies, Inc. [ 94 ] من الشركات القليلة التي طورت جهازًا لتخليق الأوليغونوكليوتيدات على نطاق واسع، مصممًا خصيصًا لهذا الغرض منذ البداية. استخدمت المنصة الأولية، المسماة VLSS (المُركِّب واسع النطاق جدًا)، أعمدة كروماتوغرافيا سائلة كبيرة من شركة فارماسيا كمفاعلات، وكانت قادرة على تصنيع ما يصل إلى 75  مليمول من المادة. صممت العديد من مصانع تصنيع الأوليغونوكليوتيدات منصاتها الخاصة، ولا يُعرف عنها الكثير نظرًا لخصوصية هذه التصاميم. استمر تطوير تصميم VLSS، وهو ما يُستكمل في مُركِّب QMaster [ 95 ] ، وهو منصة مُصغَّرة تُنتج كميات تتراوح من المليغرام إلى الغرام من الأوليغونوكليوتيدات الاصطناعية.

تمت مراجعة الممارسات الحالية لتخليق النيوكليوتيدات المعدلة كيميائياً على نطاق واسع مؤخراً. [ 96 ]

تركيب المصفوفات الدقيقة للأوليغونوكليوتيدات

يمكن تصور مصفوفة الأوليغونوكليوتيدات الدقيقة على أنها صفيحة مصغرة متعددة الآبار، حيث تُزال الفواصل المادية بين الآبار (الجدران البلاستيكية) عمدًا. أما من الناحية الكيميائية، فإن تصنيع مصفوفات الأوليغونوكليوتيدات الدقيقة يختلف عن تصنيع الأوليغونوكليوتيدات التقليدي في جانبين:

5'- O -MeNPOC-protected nucleoside phosphoramidite.
  • تبقى النيوكليوتيدات قليلة العدد مرتبطة بشكل دائم بالطور الصلب، الأمر الذي يتطلب استخدام روابط مستقرة في ظل ظروف إجراء إزالة الحماية النهائي.
  • يُحتّم غياب الفواصل المادية بين المواقع التي تشغلها جزيئات الأوليغونوكليوتيدات الفردية، والمساحة المحدودة للغاية على سطح المصفوفة الدقيقة (يشغل تسلسل أوليغونوكليوتيد واحد مساحة مربعة قدرها 25×25  ميكرومترًا) [ 97 ] ، وضرورة دقة عالية في تخليق الأوليغونوكليوتيدات، استخدام تقنيات إزالة الحماية الانتقائية للموقع 5'. في إحدى الطرق، تتم إزالة مجموعة 5'- O -DMT عن طريق التوليد الكهروكيميائي للحمض في الموقع (المواقع) المطلوب. [ 98 ] وتستخدم طريقة أخرى مجموعة الحماية 5'- O- (α-ميثيل-6-نيتروبيبيرونيلوكسي كربونيل) (MeNPOC)، والتي يمكن إزالتها عن طريق التشعيع بضوء فوق بنفسجي بطول  موجي 365 نانومترًا. [ 97 ]

المعالجة بعد التركيب

بعد اكتمال تجميع السلسلة، تتم حماية الأوليغونوكليوتيد المرتبط بالدعامة الصلبة بشكل كامل:

  • تتم حماية مجموعة الهيدروكسيل الطرفية 5' بمجموعة DMT؛
  • تتم حماية أجزاء الفوسفات أو الفوسفوروثيوات بين النيوكليوسيدات بمجموعات 2-سيانوإيثيل؛
  • تتم حماية مجموعات الأمين الخارجية في جميع القواعد النووية باستثناء T و U بمجموعات حماية أسيل.

للحصول على أوليغونوكليوتيد وظيفي، يجب إزالة جميع مجموعات الحماية. يمكن إزالة حماية قاعدة N-أسيل وحماية فوسفات 2-سيانوإيثيل في آنٍ واحد، وغالبًا ما تُزالان معًا، بمعالجة الأوليغونوكليوتيد بقواعد أو أمينات غير عضوية. مع ذلك، فإن تطبيق هذه الطريقة محدودٌ نظرًا لأن إزالة حماية فوسفات 2-سيانوإيثيل ينتج عنه الأكريلونيتريل كمنتج جانبي. في ظل الظروف القاعدية القوية اللازمة لإزالة حماية N-أسيل، يكون الأكريلونيتريل قادرًا على ألكلة القواعد النيوكليوتيدية، وخاصةً عند الموضع N3 لبقايا الثايمين واليوراسيل، ليعطي نواتج إضافة N3-(2-سيانوإيثيل) المقابلة عبر تفاعل مايكل . يمكن تجنب تكوّن هذه النواتج الجانبية بمعالجة قليل النوكليوتيدات المرتبط بالدعامة الصلبة بمحاليل قواعد في مذيب عضوي، على سبيل المثال، باستخدام 50% من ثلاثي إيثيل أمين في الأسيتونيتريل [ 99 ] أو 10% من ثنائي إيثيل أمين في الأسيتونيتريل. [ 100 ] يُوصى بشدة بهذه المعالجة للتحضيرات متوسطة وكبيرة الحجم، وهي اختيارية للتخليق على نطاق صغير حيث يكون تركيز الأكريلونيتريل الناتج في خليط إزالة الحماية منخفضًا.

بغض النظر عما إذا تمت إزالة مجموعات الحماية الفوسفاتية أولاً، يتم إزالة الحماية عن النيوكليوتيدات المرتبطة بالدعامة الصلبة باستخدام أحد النهجين العامين.

  • (1) في أغلب الأحيان، تُزال مجموعة 5'-DMT من نهاية سلسلة الأوليغونوكليوتيد. ثم تُحرر الأوليغونوكليوتيدات من الحالة الصلبة وتُزال عنها مجموعات الحماية (القاعدة والفوسفات) بمعالجتها بمحلول هيدروكسيد الأمونيوم المائي، أو محلول ميثيل أمين المائي ، أو خليط منهما، [ 40 ] أو غاز الأمونيا أو ميثيل أمين [ 101 ] أو، في حالات أقل شيوعًا، بمحاليل أمينات أولية أو قلويات أخرى في درجة حرارة الغرفة أو درجة حرارة مرتفعة. يؤدي ذلك إلى إزالة جميع مجموعات الحماية المتبقية من 2'-ديوكسي أوليغونوكليوتيدات، مما ينتج عنه خليط تفاعل يحتوي على المنتج المطلوب. إذا كان الأوليغونوكليوتيد يحتوي على أي بقايا ريبونوكليوتيد محمية بمجموعة 2'- O ، فإن بروتوكول إزالة الحماية يتضمن الخطوة الثانية حيث تُزال مجموعات السيليل الواقية لمجموعة 2'- O بمعالجتها بأيون الفلوريد باستخدام طرق مختلفة. [ 102 ] يُستخدم المنتج بعد إزالة جميع مجموعات الحماية كما هو، أو يمكن تنقية الأوليغونوكليوتيد المطلوب بعدة طرق. في أغلب الأحيان، يُزال الملح من المنتج الخام باستخدام الترسيب بالإيثانول ، أو كروماتوغرافيا الاستبعاد الحجمي ، أو كروماتوغرافيا السائل عالي الأداء ذي الطور العكسي . وللتخلص من نواتج القطع غير المرغوب فيها، يمكن تنقية الأوليغونوكليوتيدات عن طريق الفصل الكهربائي الهلامي متعدد الأكريلاميد أو كروماتوغرافيا السائل عالي الأداء لتبادل الأنيونات متبوعة بإزالة الملح.
  • (2) يُستخدم الأسلوب الثاني فقط عندما تكون طريقة التنقية المُرادة هي كروماتوغرافيا السائل عالي الأداء ذو ​​الطور العكسي (HPLC) . في هذه الحالة، تُحفظ مجموعة DMT الطرفية 5'، التي تعمل كعامل كاره للماء للتنقية، في نهاية عملية التخليق. يُزال غطاء الحماية من الأوليغونوكليوتيد في ظروف قاعدية كما هو موضح أعلاه، وبعد التبخير، يُنقى باستخدام كروماتوغرافيا السائل عالي الأداء ذو ​​الطور العكسي. ثم تُزال مجموعة التريتيل من المادة المُجمعة في ظروف حمضية مائية. على نطاق صغير (أقل من 0.01-0.02  مليمول)، يُستخدم غالبًا المعالجة بحمض الخليك المائي بنسبة 80% لمدة 15-30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة، يليها تبخير خليط التفاعل حتى الجفاف تحت فراغ . أخيرًا، يُزال الملح من المنتج كما هو موضح أعلاه.
  • بالنسبة لبعض التطبيقات، يمكن ربط مجموعات مراسلة إضافية بـ oligonucleotide باستخدام مجموعة متنوعة من الإجراءات اللاحقة للتخليق.

توصيف

تم فك تشفير ES MS لـ oligonucleotide الخام 5'-DMT-T 20 (الكتلة المحسوبة 6324.26 Da).

كما هو الحال مع أي مركب عضوي آخر، يُنصح بتوصيف الأوليغونوكليوتيدات الاصطناعية فور تحضيرها. في الحالات الأكثر تعقيدًا (البحوث وعمليات التخليق واسعة النطاق)، يتم توصيف الأوليغونوكليوتيدات بعد إزالة مجموعات الحماية وبعد تنقيتها. على الرغم من أن التسلسل هو الأسلوب الأمثل للتوصيف ، وهو إجراء روتيني وغير مكلف نسبيًا، إلا أن اعتبارات خفض التكلفة تحول دون استخدامه في التصنيع الروتيني للأوليغونوكليوتيدات. في الممارسة اليومية، يكفي الحصول على الكتلة الجزيئية للأوليغونوكليوتيد من خلال تسجيل طيف كتلته . هناك طريقتان شائعتان حاليًا لتوصيف الأوليغونوكليوتيدات: مطيافية الكتلة بالرذاذ الإلكتروني (ESI MS) ومطيافية الكتلة بتقنية التأين بالليزر بمساعدة المصفوفة/ زمن الطيران ( MALDI-TOF ). للحصول على أطياف مفيدة، من المهم جدًا استبدال جميع أيونات المعادن التي قد تكون موجودة في العينة بأيونات الأمونيوم أو ثلاثي ألكيل الأمونيوم [ ec ثلاثي إيثيل الأمونيوم ، ( C2H5 ) 3NH + ] قبل إخضاع العينة للتحليل بأي من الطريقتين.

  • في أطياف مطياف الكتلة بالترذيذ الأيوني الكهربائي (ESI MS)، يُنتج قليل النوكليوتيدات مجموعة من الأيونات التي تُقابل حالات تأين مختلفة للمركب. فعلى سبيل المثال، يُنتج قليل النوكليوتيدات ذو الكتلة الجزيئية M أيونات بكتل (M  – nH )/ n ، حيث M هي الكتلة الجزيئية لقليل النوكليوتيدات في صورة حمض حر (حيث تُعادل جميع الشحنات السالبة لمجموعات الفوسفودايستر بين النوكليوزيدات بواسطة H + )، و n هي حالة التأين، وH هي الكتلة الذرية للهيدروجين (1 دالتون ). وتُعد الأيونات ذات n التي تتراوح بين 2 و5 الأكثر فائدةً في عملية التوصيف. يُمكن للبرامج المُرفقة بالأجهزة المُصنّعة حديثًا إجراء عملية فك التشفير ، أي أنها تُحدد قمم الأيونات التي تنتمي إلى المجموعة نفسها، وتستنتج الكتلة الجزيئية لقليل النوكليوتيدات.
  • للحصول على معلومات أكثر تفصيلاً حول ملف تعريف الشوائب للأوليغونوكليوتيدات، يتم استخدام كروماتوغرافيا السائل-مطياف الكتلة (LC-MS أو HPLC-MS) [ 103 ] أو مطياف الكتلة بالرحلان الكهربائي الشعري (CEMS) [ 104 ] .

أساليب التغلب على قيود الحجم

يُعدّ الانخفاض التدريجي في المردود مع زيادة عدد النيوكليوتيدات المُضافة إلى السلسلة عاملًا رئيسيًا مُحددًا في تخليق الأوليغونوكليوتيدات. ولأن كفاءة كل إضافة نيوكليوتيد تقل عن 100%، فإن التأثير التراكمي لكفاءة الاقتران يُقيّد التخليق عالي المردود بـ 13-200 نيوكليوتيد. [ 105 ] تُوصف العلاقة بين كفاءة الاقتران والمردود الإجمالي بالمعادلة Y=CE^(n-1)، حيث CE هي كفاءة الاقتران، مُعبرًا عنها كنسبة مئوية، وn يُمثل عدد النيوكليوتيدات، وn-1 يُمثل عدد خطوات الاقتران. [ 106 ] مع ازدياد عدد خطوات الاقتران، يتناقص المردود التراكمي أُسّيًا. واستجابةً لقيود المردود، ظهرت تحسينات منهجية متنوعة واستراتيجيات تخليق بديلة لتعزيز كفاءة الاقتران وإطالة أطوال الأوليغونوكليوتيدات.

طريقة إنزيمية لتخليق قليل النوكليوتيدات من الحمض النووي الريبي

إحدى الطرق قيد الدراسة للتغلب على قيود الطول في تخليق قليل النوكليوتيدات تتضمن استخدام إنزيمات مُهندسة لبناء تسلسلات الحمض النووي الريبي [ 107 ] ، بدلاً من الاعتماد فقط على الطرق الكيميائية التقليدية. ومن الإنزيمات الرئيسية التي دُرست [ 108 ] في هذا السياق إنزيم بوليميراز عديد اليوريدين CID1 (PUP) [ 109 ] ، الذي يحفز بشكل طبيعي إضافة النوكليوتيدات إلى الطرف 3′ من سلسلة الحمض النووي الريبي.

في حالته الطبيعية، يعمل إنزيم PUP كبوليميراز مستقل عن القالب، حيث يضيف عادةً ذيولًا من النيوكليوتيدات المتكررة إلى جزيئات الحمض النووي الريبي (RNA). ولتمكين عملية تخليق تسلسل مُتحكم به، تم تكييف عملية تخليق الحمض النووي الريبي الإنزيمي [ 108 ] لتصبح عملية دورية من خطوتين، تتألف من إطالة النيوكليوتيدات وإزالة الحماية. خلال خطوة الإطالة، يُضاف نيوكليوتيد واحد إنزيميًا، بينما تزيل خطوة إزالة الحماية مجموعة الحماية للسماح بالدمج اللاحق.

تتضمن إحدى الطرق المدروسة [ 108 ] استخدام نيوكليوسيد ثلاثي الفوسفات المُعدَّل بمجموعة حجب 3′-O-أليل. تُصنَّع هذه النيوكليوتيدات المُعدَّلة وتُنقَّى باستخدام تقنيات مثل كروماتوغرافيا التبادل الأيوني والكروماتوغرافيا السائلة عالية الأداء التحضيرية (HPLC). عند دمجها بواسطة PUP، تمنع مجموعة 3′-O-أليل المزيد من التمديد، مما يسمح بإضافة نيوكليوتيد واحد في كل دورة. ثم يسمح الإزالة الكيميائية لمجموعة الحجب بالجولة التالية من التمديد.

أظهرت الدراسات [ 108 ] أن إنزيم PUP من النوع البري يُظهر كفاءة محدودة عند دمج النيوكليوتيدات المعدلة. ونتيجة لذلك، تم تطوير نسخ مُهندسة من الإنزيم تتميز بتحمل أفضل للركائز وكفاءة دمج أعلى، مما يعزز ملاءمتها لتخليق قليل النيوكليوتيدات الإنزيمي المُتحكم فيه.

ربط الحمض النووي المعتمد على القالب

يُعدّ ربط الحمض النووي المعتمد على القالب طريقةً لتجميع النيوكليوتيدات قليلة السلسلة تعتمد على القطع، حيث تُحاذى قطعٌ أقصر من النيوكليوتيدات قليلة السلسلة، مُصنّعة كيميائيًا، على قالب حمض نووي مُكمّل، ثم تُربط عبر الربط الإنزيمي. وقد طوّر هذه الطريقة فريق بحثي في ​​معهد باستور [ 110 ] ، وهي تُشكّل بديلًا للتغلب على قيود الطول التي تُعيق الطرق التقليدية.

في إحدى الدراسات [ 110 ] ، صُممت شظايا قليلة النوكليوتيدات، أو ما يُعرف بـ"القصيرة"، لتُكمّل سلسلة قالب مُحددة، مع تحديد موضعها واتجاهها بدقة. بعد ذلك، يُمكن استخدام إنزيمات ربط الحمض النووي لتحفيز تكوين روابط فوسفاتية ثنائية الإستر بين القصائر المتجاورة، مما يُنتج سلسلة أوليغونوكليوتيدية متصلة. يُحسّن دمج سلسلة القالب من دقة الطريقة من خلال تعزيز اقتران القواعد بدقة، بالإضافة إلى تقليل أخطاء الربط التي تحدث أثناء التخليق التدريجي.

يُمكّن الربط المعتمد على القالب أيضًا من دمج النيوكليوتيدات المُعدّلة كيميائيًا [ 110 ] ، وهو أمرٌ قد يكون أكثر صعوبة باستخدام تقنيات التخليق التقليدية. ولأنّ الوحدات القصيرة الفردية تُصنّع وتُنقّى قبل تجميع السلسلة، فإنّ هذه الطريقة تُقلّل من فقدان المردود التراكمي والخطأ التراكمي مقارنةً بالتخليق التدريجي للسلاسل الطويلة. هذه المزايا تُعزّز هذه الطريقة كنهجٍ معياري مُحتمل لبناء قليل النيوكليوتيدات أطول وأكثر تعقيدًا.

على الرغم من هذه المزايا، لا تزال عملية ربط الحمض النووي المعتمدة على القالب تعاني من قيود متعددة. تتفاوت كفاءة تفاعلات الربط تبعًا للتسلسل المحدد وأنواع التعديلات التي تُجرى على الوحدات الفرعية، فضلًا عن الصعوبات المحتملة في إنشاء سلسلة قالب مناسبة [ 110 ] . وكما هو الحال مع العديد من الطرق التجريبية، توجد أيضًا مشكلات تتعلق بقابلية التوسع والتكلفة. في هذه المرحلة، تمنع هذه القيود اعتماد هذه الطريقة كطريقة أساسية لتخليق قليل النوكليوتيدات.

التخليق الكيميائي المباشر  

على الرغم من أن التركيز انصبّ في المقام الأول على الأساليب الإنزيمية للتغلب على قيود الطول في تخليق الأوليغونوكليوتيدات، إلا أن التخليق الكيميائي المباشر يُعدّ بديلاً مقترحاً. يُجرى تخليق الأوليغونوكليوتيدات القياسي على مواد مسامية، مثل الزجاج ذي المسام المُتحكَّم بها (CPG) [ 111 ] . مع ذلك، تُثير هذه البيئة تحديات مع ازدياد طول التسلسل. فالسلاسل الأطول تشغل حيزاً أكبر داخل المسام، مما يُحدّ من وصول الكواشف، وينتج عنه انخفاض في كفاءة الاقتران وزيادة في عدد التسلسلات المبتورة في المحلول.  

يتضمن أحد الأساليب المبتكرة تصنيع الأوليغونوكليوتيدات كيميائيًا على سطح أملس، بدلًا من مادة مسامية، لتحسين كفاءة الربط، مع الاستفادة أيضًا من استراتيجية التنقية المعروفة باسم "التقاط بالبلمرة" (CBP) لعزل الأوليغونوكليوتيدات كاملة الطول بشكل انتقائي في المحلول. يُقلل إجراء التصنيع الكيميائي على سطح أملس، مثل الصوف الزجاجي أو الخرز الزجاجي، من الإجهاد الفراغي والازدحام [ 111 ] ، مما يوفر دعامة صلبة بديلة تُفيد الأوليغونوكليوتيدات الطويلة.  

تزيد تنقية محلول التخليق الخام من قابلية استخدام المنتجات عن طريق تحسين فرص الحصول على تسلسلات أوليغونوكليوتيدات كاملة الطول بنجاح. تُعدّ التسلسلات الطويلة المُصنّعة بنجاح نادرة، إذ يحتوي المحلول في الغالب على تسلسلات مبتورة أو غير مكتملة. من خلال وسم الأوليغونوكليوتيدات كاملة الطول فقط باستخدام فوسفوراميديت قابل للبلمرة (PTP) [ 111 ] ودمجها في هلام بولي أكريلاميد، تُغسل التسلسلات المبتورة أو غير الموسومة، وتُحتفظ بالتسلسلات المطلوبة. تُعرف طريقة التنقية هذه باسم "التقاط بالبلمرة" (CBP) [ 111 ] ، وتتيح استعادة التسلسلات المُصنّعة بنجاح. باستخدام هذه الطرق، تم تحقيق تخليق كيميائي مباشر ناجح لأوليغونوكليوتيدات فائقة الطول (800 و1728 وحدة) [ 112 ] .

انظر أيضاً

مراجع

  1. 1 2 Beaucage, SL; Iyer, RP (1992). "Advances in the Synthesis of Oligonucleotides by the Phosphoramidite Approach" . Tetrahedron . 48 (12): 2223. doi : 10.1016/S0040-4020(01)88752-4 .
  2. 1 2 براون، دي إم. تاريخ موجز لتخليق قليل النوكليوتيدات. طرق في البيولوجيا الجزيئية (توتوا، نيوجيرسي، الولايات المتحدة) (1993)، 20 (بروتوكولات قليل النوكليوتيدات ونظائرها)، 1-17.
  3. ↑ ريس، كولين ب. (2005). "الأوليغودندروغليوتيدات والمتعددة النوكليوتيدات: 50 عامًا من التخليق الكيميائي". الكيمياء العضوية والبيولوجية الجزيئية . 3 (21): 3851-3868 . doi : 10.1039/b510458k . PMID 16312051 . 
  4. ↑ آير، آر بي؛ بيوكاج، إس إل 7.05. تخليق قليل النوكليوتيدات. في: الكيمياء الشاملة للمنتجات الطبيعية، المجلد 7: الحمض النووي وجوانب البيولوجيا الجزيئية . كول، إريك تي؛ محرر. هولندا (1999)، إلسيفير، أمستردام، ص 105-152.
  5. ↑ ميكلسون، أ.م.؛ تود، أ.ر. (1955). "النيوكليوتيدات، الجزء الثاني والثلاثون. تخليق ثنائي نيوكليوتيد ثنائي الثيميدين الذي يحتوي على رابطة بين النيوكليوتيدات 3′: 5′". مجلة الجمعية الكيميائية : 2632. doi : 10.1039/JR9550002632 .
  6. ↑ هول، آر إتش؛ تود، أ؛ ويب، آر إف (1957). "644. النيوكليوتيدات. الجزء الحادي والأربعون. الأنهيدريدات المختلطة كمركبات وسيطة في تخليق فوسفات ثنائي النوكليوزيد". مجلة الجمعية الكيميائية : 3291. doi : 10.1039/JR9570003291 .
  7. ↑ فروهلر، بي سي؛ نغ، بي جي؛ ماتيوتشي، إم دي (1986). "تخليق الحمض النووي الريبوزي منقوص الأكسجين عبر وسائط فوسفونات الهيدروجين من ديوكسي نيوكليوزيد" . أبحاث الأحماض النووية . 14 (13): 5399-5407 . doi : 10.1093/nar/14.13.5399 . PMC 311548. PMID 3737406 .  
  8. ↑ غاريغ، بي جيه؛ ليند، آي؛ ريغبيرغ، تي؛ ستاوينسكي، جيه؛ سترومبيرغ، آر. (1986). "فوسفونات الهيدروجين للنيوكليوزيد. الجزء الثالث: التخليق الكيميائي للأوليغوديوكسي ريبونوكليوتيدات باستخدام منهج فوسفونات الهيدروجين". رسائل رباعي السطوح . 27 (34): 4051. doi : 10.1016/S0040-4039(00)84908-4 .
  9. وادا ، ت .؛ ساتو، ي.؛ هوندا، ف.؛ كاواهارا، س.؛ سيكين، م. (1997). "التخليق الكيميائي للأوليغوديوكسي ريبونوكليوتيدات باستخدام مونومرات الفوسفونات الهيدروجينية غير المحمية عند ذرة النيتروجين وكواشف تكثيف الكربونيوم والفوسفونيوم: الفسفرة الانتقائية عند ذرة الأكسجين والتكثيف". مجلة الجمعية الكيميائية الأمريكية . 119 (52): 12710-12721 . Bibcode : 1997JAChS.11912710W . doi : 10.1021/JA9726015 .
  10. ↑ أغراوال، س.؛ غودتشايلد، ج.؛ سيفيرا، م.ب.؛ ثورنتون، أ.هـ.؛ سارين، ب.س.؛ زاميكنيك، ب.س. (1988). "فوسفوراميدات وفوسفوروثيوات أوليغوديوكسي نيوكليوتيد كمثبطات لفيروس نقص المناعة البشرية" . وقائع الأكاديمية الوطنية للعلوم في الولايات المتحدة الأمريكية . 85 (19): 7079-7083 . Bibcode : 1988PNAS...85.7079A . doi : 10.1073 / pnas.85.19.7079 . PMC 282127. PMID 3174622 .  
  11. ^ كامر، PCJ. رولين، HCPF؛ فان دن إلست، هـ؛ فان دير ماريل، GA وفان بوم، JH (1989). "نهج فعال نحو تخليق ديسترات الفوسفوروثيوات عبر تفاعل شوينبيرج". رباعي الاسطح ليت . 30 (48): 6757–6760 . دوى : 10.1016/S0040-4039(00)70669-1 .
  12. ↑ أغراوال، س.؛ تانغ، ج.ي. (1990). "تخليق فعال للأوليغوريبونوكليوتيد ونظيره الفوسفوروثيواتي باستخدام نهج الفوسفونات الهيدروجيني". رسائل رباعي السطوح . 31 (52): 7541-7544 . doi : 10.1016/S0040-4039(00)97293-9 .
  13. ↑ ألمر، هـ.؛ ستاوينسكي، ج.؛ سترومبيرغ، ر. (1996). "تخليق أوليغو (ريبونوكليوزيد فوسفوروثيوات) على دعامة صلبة" . مجلة أبحاث الأحماض النووية . 24 (19): 3811-3820 . doi : 10.1093 / nar/24.19.3811 . PMC 146170. PMID 8871563 .  
  14. ↑ ترام، ك.؛ وانغ، إكس.؛ يان، هـ. (2007). "تخليق سهل لفوسفوروسيلينوات قليل النوكليوتيدات". رسائل عضوية 9 ( 24): 5103-5106 . doi : 10.1021/ol702305v . PMID 17973486 . 
  15. ↑ فروهلر، بي سي (1986). "مركبات وسيطة من ثنائي إستر فوسفونات الهيدروجين من ديوكسي نيوكليوزيد في تخليق نظائر الفوسفات بين النيوكليوتيدات". رسائل رباعي السطوح . 27 (46): 5575-5578 . doi : 10.1016/S0040-4039(00)85269-7 .
  16. ↑ فروهلر، بي سي؛ نغ، بي جي؛ ماتيوتشي، إم دي (1988). "نظائر الفوسفوراميدات للحمض النووي: تخليق واستقرار حراري للهيترودوبلكسات" . أبحاث الأحماض النووية . 16 (11): 4831-4839 . doi : 10.1093/nar/ 16.11.4831 . PMC 336699. PMID 3387210 .  
  17. ↑ داغل، جيه إم؛ أندراكي، إم إي؛ ديفاين، آر جيه؛ والدر، جيه. (1991). "الخواص الفيزيائية للأوليغونوكليوتيدات التي تحتوي على روابط بين النيوكليوسيدات المعدلة بالفوسفوراميدات" . مجلة أبحاث الأحماض النووية . 19 (8): 1805-1810 . doi : 10.1093 / nar/19.8.1805 . PMC 328108. PMID 2030962 .  
  18. ↑ ماير، م.أ؛ غوزاييف، أ.ب؛ مانوهاران، م. (2000). "تخليق قليل النوكليوتيدات الكيميرية التي تحتوي على روابط فوسفودايستر، وفوسفوروثيوات، وفوسفوراميدات". رسائل عضوية 2 ( 13): 1819-1822 . doi : 10.1021/ol005842h . PMID 10891166 . 
  19. ↑ موهي، ن. يو.؛ باديا، ك. ج.؛ سالونكي، م. م. (2003). "عامل مؤكسد فعال لتخليق قليل النوكليوتيدات ذات الهيكل المختلط عبر طريقة الفوسفونات الهيدروجينية". الكيمياء العضوية الطبية الحيوية. 11 ( 7): 1419-1431 . doi : 10.1016/S0968-0896(02)00615-6 . PMID 12628668 . 
  20. ↑ كونغ، ب.ب. وجونز، ر.أ. (1992). "تخليق الحمض النووي باستخدام فوسفونات الهيدروجين بدون حماية أمينية". رسائل رباعي السطوح . 33 (40): 5869-5872 . doi : 10.1016/S0040-4039(00)61075-4 .
  21. ↑ جيلهام، بي تي؛ خورانا، إتش جي (1958). "دراسات حول عديدات النوكليوتيدات. 1. طريقة جديدة وعامة للتخليق الكيميائي للرابطة بين النوكليوتيدات C5'-C3'. تخليق ثنائيات النوكليوتيدات منزوعة الأكسجين". مجلة الجمعية الكيميائية الأمريكية 80 (23): 6212. doi : 10.1021/ja01556a016 .
  22. ↑ ليتسينجر، آر إل؛ أوجيلفي، كيه كيه (1969). "كيمياء النيوكليوتيدات. الثالث عشر. تخليق أوليغوثيميديلات عبر وسائط فوسفوتريستر". مجلة الجمعية الكيميائية الأمريكية . 91 (12): 3350. Bibcode : 1969JAChS..91.3350L . doi : 10.1021/ja01040a042 .
  23. ↑ ريس، سي بي (1978). "التخليق الكيميائي للأوليغو- والبولي-نوكليوتيدات باستخدام طريقة الفوسفوتريستر". تيتراهيدرون . 34 (21): 3143. doi : 10.1016/0040-4020(78)87013-6 .
  24. ↑ إيفيموف، ف.أ.؛ بورياكوفا، أ.أ.؛ ريفيرداتو، س.ف.؛ تشاخماخشيفا، أ.ج.؛ أوفشينيكوف، يو. أ. (1983). " التخليق السريع لسلاسل طويلة من ديوكسي ريبوليغونوكليوتيدات باستخدام طريقة فوسفوتريستر N-ميثيل إيميدازوليد" . مجلة أبحاث الأحماض النووية . 11 (23): 8369-8387 . doi : 10.1093/nar/11.23.8369 . PMC 326588. PMID 6324083 .  
  25. ↑ إيفيموف، ف. أ؛ مولتشانوفا، ن. س؛ تشاخماخشيفا، أ. ج (2007). "نهج لتخليق قليل النوكليوتيدات الطبيعية والمعدلة بطريقة الفوسفوتريستر باستخدام التحفيز الجزيئي الداخلي المحب للأكسجين". النيوكليوسيدات ، والنيوكليوتيدات، والأحماض النووية . 26 ( 8-9 ): 1087-1093 . doi : 10.1080/15257770701516268 . PMID 18058542. S2CID 34548367 .  
  26. ↑ ليتسينجر، آر إل؛ ماهاديفان، في. (1966). "تخليق تدريجي للأوليغوديوكسي ريبونوكليوتيدات على دعامة بوليمرية غير قابلة للذوبان". مجلة الجمعية الكيميائية الأمريكية . 88 (22): 5319-24 . Bibcode : 1966JAChS..88.5319L . doi : 10.1021/ja00974a053 . PMID 5979268 . 
  27. ↑ ليتسينجر، آر إل؛ فينان، جيه إل؛ لونسفورد، إن بي (1975). "كيمياء النيوكليوتيدات. 20. إجراء اقتران الفوسفيت لتوليد روابط بين النيوكليوتيدات". مجلة الجمعية الكيميائية الأمريكية . 97 (11): 3278-3279 . Bibcode : 1975JAChS..97.3278L . doi : 10.1021/ja00844a090 . PMID 1133350 . 
  28. ↑ ماتيوتشي، دكتور في الطب؛ كاروثرز، م.هـ. (1981). "تخليق ديوكسي أوليغونوكليوتيدات على دعامة بوليمرية". مجلة الجمعية الكيميائية الأمريكية . 103 (11): 3185. Bibcode : 1981JAChS.103.3185M . doi : 10.1021/ja00401a041 .
  29. ↑ بيوكيج، إس إل؛ كاروثرز، إم إتش (1981). "فوسفوراميديتات ديوكسي نيوكليوزيد - فئة جديدة من الوسائط الرئيسية لتخليق ديوكسي بولي نيوكليوتيد". رسائل رباعي السطوح . 22 (20): 1859. رمز Bibcode : 1981TetL...22.1859B . doi : 10.1016/S0040-4039(01)90461-7 .
  30. سينها ، ن.د .؛ بيرنات، ج.؛ ماكمانوس، ج.؛ كوستر، هـ. (1984). "تخليق قليل النوكليوتيدات المدعوم بالبوليمر. الجزء الثامن عشر: استخدام β-سيانوإيثيل-N،N-ثنائي ألكيل أمينو/N-مورفولينو فوسفوراميديت من ديوكسي نيوكليوزيدات لتخليق شظايا الحمض النووي DNA ، مما يبسط عملية إزالة الحماية وعزل المنتج النهائي" . مجلة أبحاث الأحماض النووية . 12 (11): 4539-4557 . doi : 10.1093/nar/12.11.4539 . PMC 318857. PMID 6547529 .  
  31. ↑ ماكبرايد، إل جيه؛ كاروثرز، إم إتش (1983). "كيمياء النيوكليوتيدات. العاشر. دراسة لعدة فوسفوراميديتات ديوكسي نيوكليوزيد مفيدة لتخليق ديوكسي أوليغونوكليوتيدات". رسائل رباعي السطوح . 24 (3): 245-248 . doi : 10.1016/S0040-4039(00)81376-3 .
  32. ↑ آدامز، إس بي؛ كافكا، كيه إس؛ ويكس، إي جيه؛ هولدر، إس بي؛ غالوبي، جي آر (1983). "كواشف فوسفيت النيوكليوزيد ثنائي ألكيل أمينو المعاقة في تخليق اثنين من الحمض النووي DNA 51-mers". مجلة الجمعية الكيميائية الأمريكية 105 (3): 661-663 . Bibcode : 1983JAChS.105..661A . doi : 10.1021/ja00341a078 .
  33. ↑ "بيتا-سيانوإيثيل فوسفوراميديتس" . Products.appliedbiosystems.com . تم الاطلاع عليه بتاريخ 12-05-2009 .
  34. ↑ "تقنيات البحث الحيوي" . Biosearchtech.com . تم الاطلاع عليه بتاريخ 12-05-2009 .
  35. ↑ "شركة ChemGenes، وهي شركة للتكنولوجيا الحيوية" . Chemgenes.com . تم الاطلاع عليه بتاريخ 12-05-2009 .
  36. ↑ باول، م. (17 يناير 2008). "أجهزة أبلايد بيوسيستمز" . Glenresearch.com. مؤرشف من الأصل في 14 مارس 2012. تم الاطلاع عليه في 12 مايو 2009 .
  37. 1 2 سيكين، م. تخليق الحمض النووي الريبوزي منقوص الأكسجين (DNA) بدون حماية القواعد. في : البروتوكولات الحالية في كيمياء الأحماض النووية. بيوكيج، إس إل، محرر (جون وايلي وأولاده) (2004)، الفصل 3، الوحدة 3.10، الصفحات 3.10.1-3.10.15. معرف PubMed: 18428925
  38. ↑ غريازنوف، إس إم؛ ليتسينغر، آر إل (1991). "تخليق قليل النوكليوتيدات عبر مونومرات ذات قواعد غير محمية". مجلة الجمعية الكيميائية الأمريكية 113 (15): 5876-5877 . Bibcode : 1991JAChS.113.5876G . doi : 10.1021/ja00015a059 .
  39. ↑ سيكين، م.، أوهكوبو، أ.، وسيو، ك. (2003). "استراتيجية حجب البروتون لتخليق قليل النيوكليوتيدات منزوعة الأكسجين دون حماية القاعدة، أو تفاعل التغطية، أو تفاعل كسر رابطة PN". مجلة الكيمياء العضوية . 68 (14): 5478-5492 . doi : 10.1021/jo034204k . PMID 12839438 . {{cite journal}}: صيانة CS1: أسماء متعددة: قائمة المؤلفين ( رابط )
  40. ريدي ، إم بي ؛ حنا، إن بي؛ فاروقي، إف (1997). "القطع فائق السرعة وإزالة الحماية من الأوليغونوكليوتيدات: تخليق واستخدام مشتقات أسيتات الكربون " . النيوكليوسيدات والنيوكليوتيدات . 16 (7): 1589-1598 . doi : 10.1080/07328319708006236 .
  41. ↑ ماكمين، د. ل.؛ غرينبيرغ، م. م. (1997). "تخليق قليل النوكليوتيدات المحتوية على أمينات 3'-ألكيل باستخدام فوسفوراميديت ديوكسي أدينوزين المحمي بـ N-أيزوبوتيريل". رسائل رباعي السطوح . 38 (18): 3123. doi : 10.1016/S0040-4039(97)00568-6 .
  42. ↑ شولهوف، جيه سي؛ مولكو، دي؛ تيول، آر. (1987). "تُختزل خطوة إزالة الحماية النهائية في تخليق قليل النوكليوتيدات إلى معالجة سريعة وخفيفة بالأمونيا باستخدام مجموعات حماية قاعدية غير مستقرة" . مجلة أبحاث الأحماض النووية . 15 (2): 397-416 . doi : 10.1093/nar/15.2.397 . PMC 340442. PMID 3822812 .  
  43. ↑ تشو، كيو؛ ديلاني، إم أو؛ غرينبيرغ، إم إم (2001). "ملاحظة وإزالة أستلة النيتروجين للأوليغونوكليوتيدات المحضرة باستخدام الفوسفوراميديتات سريعة الإزالة للحماية وإزالة الحماية فائقة اللطف". رسائل الكيمياء الطبية الحيوية العضوية . 11 (9): 1105-1107 . doi : 10.1016/S0960-894X(01)00161-5 . PMID 11354354 . 
  44. ↑ ماكبرايد، إل جيه؛ كيرزيك، آر؛ بيوكيج، إس إل؛ كاروثرز، إم إتش (1986). "كيمياء النيوكليوتيدات. 16. مجموعات حماية الأميدين لتخليق قليل النيوكليوتيدات". مجلة الجمعية الكيميائية الأمريكية . 108 (8): 2040-2048 . Bibcode : 1986JAChS.108.2040M . doi : 10.1021/ja00268a052 .
  45. ↑ غوزاييف، أ.ب.؛ مانوهاران، م. (2001). "اقتران الفوسفوراميديت مع قليل النوكليوتيدات الحاملة لمجموعات فوسفات بين النوكليوزيدات غير المحمية". مجلة الكيمياء العضوية . 66 (5): 1798-1804 . doi : 10.1021/jo001591e . PMID 11262130 . 
  46. ↑ أوجيلفي، ك.ك.؛ ثيريولت، ن.؛ سادانا، ك.ل. (1977). "تخليق قليل النوكليوتيدات الريبية". مجلة الجمعية الكيميائية الأمريكية 99 (23): 7741-7743 . Bibcode : 1977JAChS..99.7741O . doi : 10.1021/ja00465a073 . PMID 915168 . 
  47. 1 2 عثمان، ن.؛ أوجيلفي، ك.ك.؛ جيانغ، م.ي.؛ سيدرغرين، ر.ج. (1987). "التخليق الكيميائي الآلي لسلاسل قليلة النوكليوتيدات الطويلة باستخدام ريبونوكليوزيد 2'-O-سيليليتد 3'-O-فوسفوراميديت على دعامة زجاجية ذات مسام مضبوطة: تخليق تسلسل مكون من 43 نيوكليوتيدًا مشابهًا للنصف 3' من جزيء tRNA فورميل ميثيونين في الإشريكية القولونية". مجلة الجمعية الكيميائية الأمريكية 109 (25): 7845-7854 . Bibcode : 1987JAChS.109.7845U . doi : 10.1021/ja00259a037 .
  48. ↑ عثمان، ن.؛ بون، ر. ت.؛ أوجيلفي، ك. ك. (1985). "تحضير ريبونوكليوزيد 3'-O-فوسفوراميديت وتطبيقه في التخليق الآلي للأوليغونوكليوتيدات على الطور الصلب". رسائل رباعي السطوح . 26 (38): 4567-4570 . doi : 10.1016/S0040-4039(00)98753-7 .
  49. ↑ سكارنج، إس. أ.؛ فرانكلين، سي.؛ عثمان، ن. (1990). "التخليق الكيميائي للأوليغوريبونوكليوتيدات النشطة بيولوجيًا باستخدام فوسفوراميديتات الريبونوكليوزيد المحمية بمجموعة بيتا-سيانوإيثيل" . مجلة أبحاث الأحماض النووية . 18 (18): 5433-5441 . doi : 10.1093/nar/18.18.5433 . PMC 332221. PMID 2216717 .  
  50. ↑ بيتسش، س.؛ فايس، ب.أ.؛ وو، ش.؛ أكرمان، د.؛ هونغر، ت. (1999). "تخليق آلي سريع وموثوق للحمض النووي الريبي (RNA) وسلائف محمية جزئيًا بمجموعة 2'-O ("RNA المحجوز") بالاعتماد على مجموعتين جديدتين ومتعامدتين لحماية مجموعة 2'-O". مجلة هيلفيتيكا شيميكا أكتا . 82 (10): 1753-1761 . doi : 10.1002/(SICI)1522-2675(19991006)82:10 < 1753::AID-HLCA1753 > 3.0.CO ; 2-Y .
  51. ↑ بيتسش، س.؛ فايس، ب.أ.؛ جيني، ل.؛ ستوتز، أ.؛ وو، ش. (2001). "تخليق كيميائي موثوق به للأوليغوريبونوكليوتيدات (RNA) باستخدام فوسفوراميديتات محمية بـ 2'-O-[(ثلاثي إيزوبروبيل سيليل)أوكسي]ميثيل(2'-O-tom)". مجلة هيلفيتيكا كيميكا أكتا . 84 (12): 3773-3795 . doi : 10.1002/1522-2675(20011219)84:12 < 3773::AID-HLCA3773 > 3.0.CO ; 2-E .
  52. ↑ غوزاييف، أ.؛ سالو، هـ.؛ أزهاييف، أ.؛ لونبيرغ، هـ. (1995). "نهج جديد للفسفرة الكيميائية للأوليغوديوكسي ريبونوكليوتيدات عند الطرف 5'". تيتراهيدرون . 51 (34): 9375-9384 . doi : 10.1016/0040-4020(95)00544-I .
  53. ↑ سينها، ن.د.؛ كوك، ر.م. (1988). "تحضير وتطبيق قليل النوكليوتيدات الاصطناعية الوظيفية: الجزء الثالث. استخدام مشتقات الفوسفونات الهيدروجينية للأمينو-هكسانول المحمي ومركابتوبروبانول أو-هكسانول" . مجلة أبحاث الأحماض النووية . 16 (6): 2659-2669 . doi : 10.1093/nar/16.6.2659 . PMC 336396. PMID 3362678 .  
  54. ↑ جونز، دي إس؛ هاشمان، جيه بي؛ كونراد، إم جيه؛ كوتس، إس؛ ليفينغستون، دي إيه. وسائط لتوفير مجموعات وظيفية على الطرف 5' من النيوكليوتيدات، (1995) براءة اختراع أمريكية رقم 5,391,785 .
  55. ↑ بوديمينوجين، م.أ.؛ لوختانوف، إ.أ.؛ ريد، م.و. (2001). "ربط مجسات أوليغوديوكسي نيوكليوتيد معدلة بالبنزالدهيد بزجاج مطلي بالسيميكاربازيد" . مجلة أبحاث الأحماض النووية . 29 (24): 5090-5098 . doi : 10.1093/nar/29.24.5090 . PMC 97543. PMID 11812841 .  
  56. ↑ ليبيديف، أ.ف.؛ كومبس، د.؛ هوغريف، ر.إ. (2007). "رابط كربوكسيلي مُنشَّط مسبقًا للربط السريع للألكيل أمينات مع قليل النوكليوتيدات على دعامة صلبة". كيمياء الاقتران الحيوي . 18 (5): 1530-1536 . doi : 10.1021/bc0603891 . PMID 17877414 . 
  57. ↑ ألفيرا، م.؛ إريتجا، ر. (2007). "تخليق قليل النوكليوتيدات الحاملة لروابط 5'-5' باستخدام تفاعلات الإضافة الحلقية المحفزة بالنحاس" ( ملف PDF) . الكيمياء والتنوع البيولوجي . 4 (12): 2798-2809 . doi : 10.1002/cbdv.200790229 . hdl : 10261/124969 . PMID 18081090. S2CID 25051865 .  
  58. ↑ براش، سي كيه "فوسفوراميدات موسومة بالفلوريسين". (1996) براءة اختراع أمريكية رقم 5,583,236 .
  59. ↑ Pitner, JB; Linn, CP "تخليق واستخدام تركيبات الفوسفوراميديت الموسومة". (2000) براءة اختراع أمريكية رقم 6,114,518 .
  60. ↑ ليفنسون؛ سي.؛ تشانغ؛ سي.-أ؛ أوكس؛ إف تي "كواشف وظيفية للأوليغونوكليوتيدات". (1990) براءة اختراع أمريكية رقم 4,914,210 .
  61. ↑ دوراند، م.؛ شيفري، ك.؛ شاسينول، م.؛ ثونغ، ن. ت.؛ موريزو، ج. س. (1990). " دراسات ثنائية اللون الدائرية لقليل النيوكليوتيدات منزوعة الأكسجين التي تحتوي على حلقة دبوسية مصنوعة من سلسلة سداسي إيثيلين جليكول: التكوين والاستقرار" . أبحاث الأحماض النووية . 18 (21): 6353-6359 . doi : 10.1093/nar/18.21.6353 . PMC 332506. PMID 2243780 .  
  62. ↑ كريستيانو، أ.؛ ماكسويجين، ج. "تثبيط التعبير الجيني لجين الورم الشبكي (RB1) بواسطة تداخل الحمض النووي الريبوزي باستخدام الحمض النووي المتداخل القصير" . طلب ​​براءة اختراع دولي (2006)، WO 2006078798 A2.
  63. ↑ بون، آر تي (1991). "كاشف فوسفوراميديت البيوتين ذو السلسلة الطويلة للتخليق الآلي للأوليغونوكليوتيدات البيوتينيلية 5'". رسائل رباعي السطوح . 32 (14): 1715-1718 . doi : 10.1016/S0040-4039(00)74311-5 .
  64. ↑ سبراوت، ب.؛ كولونا، ف.؛ مولاه، ب.؛ تسو، د.؛ أندروس، أ.؛ هامبل، أ.؛ فيناياك، ر. (1995). "طريقة فعالة لعزل وتنقية قليل النوكليوتيدات الريبية". النيوكليوسيدات والنيوكليوتيدات . 14 (1 و2): 255-273 . doi : 10.1080/15257779508014668 .
  65. ↑ ستوتز، أ.؛ هوبارتنر، س.؛ بيتسش، س. (2000). "مجموعات حماية قواعد نووية جديدة حساسة للفلورايد لتخليق تسلسلات الحمض النووي الريبي 3'(2')-O-أمينو-أسيل". مجلة هيلفيتيكا كيميكا أكتا . 83 (9): 2477-2503 . doi : 10.1002/1522-2675(20000906)83:9 < 2477::aid-hlca2477 > 3.0.co ; 2-9 .
  66. ↑ ويلز، ر.؛ مولر، س. (2002). "5-(بنزيل مركابتو)-1H-تترازول كمنشط لوحدات بناء فوسفوراميديت 2'-O-TBDMS في تخليق الحمض النووي الريبي". رسائل رباعي السطوح . 43 (5): 795-797 . doi : 10.1016/S0040-4039(01)02274-2 .
  67. ↑ فارغيز، سي.؛ كارتر، ج.؛ ييغي، ج.؛ كريفيجانسكي، س.؛ سيتل، أ.؛ كروب، إ.؛ بيترسون، ك.؛ بيكن، و. (1998). "التنشيط الفعال لفوسفوراميديتات النيوكليوزيد باستخدام 4،5-ثنائي سيانو إيميدازول أثناء تخليق قليل النوكليوتيدات" . مجلة أبحاث الأحماض النووية . 26 (4): 1046-1050 . doi : 10.1093/nar/26.4.1046 . PMC 147346. PMID 9461466 .  
  68. ↑ وي، شيا (2013). "ربط المنشطات لتخليق قليل النوكليوتيدات عبر نهج الفوسفوراميديت". تيتراهيدرون . 69 (18): 3615-3637 . doi : 10.1016/j.tet.2013.03.001 .
  69. ↑ أوجيلفي، ك.ك.؛ عثمان، ن.؛ نيكوغوسيان، ك.؛ سيدرغرين، ر.ج. (1988). "التخليق الكيميائي الكامل لتسلسل RNA بطول 77 نيوكليوتيدًا يتمتع بنشاط استقبال الميثيونين" . وقائع الأكاديمية الوطنية للعلوم في الولايات المتحدة الأمريكية . 85 ( 16): 5764-5768 . Bibcode : 1988PNAS...85.5764O . doi : 10.1073/pnas.85.16.5764 . PMC 281845. PMID 3413059 .  
  70. ↑ وو، ت.؛ أوجيلفي، ك.ك.؛ بيرو، ج. بيير؛ سيدرغرين، ر.ج. (1989). "إجراء ملائم لتحضير بوليمرات DNA-RNA مختلطة محددة". مجلة الجمعية الكيميائية الأمريكية 111 (22): 8531-8533 . Bibcode : 1989JAChS.111.8531W . doi : 10.1021/ja00204a043 .
  71. ↑ بون، آر تي (1987). "تحسين كفاءة الاقتران باستخدام 4-ثنائي ميثيل أمينو بيريدين (DMAP) مع إما تترازول، أو 5-(أو-نيتروفينيل) تترازول، أو 5-(بارا-نيتروفينيل) تترازول في التخليق الصلب للأوليغوريبونوكليوتيدات باستخدام طريقة الفوسفوراميديت". رسائل رباعي السطوح . 28 (32): 3643-3646 . doi : 10.1016/S0040-4039(00)96344-5 .
  72. ↑ بون، ر. ت.؛ عثمان، ن.؛ دامها، م. ج.؛ أوجيلفي، ك. ك. (1986). " منع تعديل الجوانين وانشطار السلسلة أثناء التخليق الصلب للأوليغونوكليوتيدات باستخدام مشتقات الفوسفوراميديت" . مجلة أبحاث الأحماض النووية . 14 (16): 6453-6470 . doi : 10.1093/nar/14.16.6453 . PMC 311657. PMID 3748816 .  
  73. ↑ غوزاييف، أ.ب. (2011). "تفاعل 3H-1,2,4-ديثيازول-3-ثيونات و3H-1,2-ديثيول-3-ثيونات كعوامل كبرتة لتخليق قليل النوكليوتيدات". رسائل رباعي السطوح . 52 (3): 434-437 . doi : 10.1016/j.tetlet.2010.11.086 .
  74. ↑ ألول، ر.هـ؛ سينغمان، س.ن؛ تشانغ، ج.؛ ليتسينغر، ر.ل (1991). "أوكساليل-CPG : دعامة غير مستقرة لتخليق مشتقات قليلة النوكليوتيدات الحساسة" . أبحاث الأحماض النووية . 19 (7): 1527-1532 . doi : 10.1093/nar/19.7.1527 . PMC 333911. PMID 2027761 .  
  75. ↑ "منتج جديد: 0.5 مولار من CSO للأكسدة غير المائية في تخليق الحمض النووي" . Glenres.com . تم الاطلاع عليه بتاريخ 28 يناير 2013 .
  76. ↑ مانوهاران، م.؛ لو، ي.؛ كاسبر، م.د.؛ جست، ج. (2000). "مجموعة الأليل كمجموعة حماية لروابط الفوسفات والثيوفوسفات بين النيوكليوتيدات في تخليق قليل النيوكليوتيدات: ظروف أكسدة وإزالة حماية سهلة". رسائل عضوية 2 ( 3): 243-246 . doi : 10.1021/ol9910518 . PMID 10814292 . 
  77. ↑ براكاش، تي بي؛ جونستون، جيه إف؛ غراهام، إم جيه؛ كوندون، تي بي؛ مانوهاران، إم. (2004). "تثبط قليل النوكليوتيدات المعدلة بـ 2'-O- [ 2- [ (N,N-ثنائي ميثيل أمينو)أوكسي ] إيثيل ] التعبير عن الحمض النووي الريبوزي الرسول في المختبر وفي الجسم الحي" . مجلة أبحاث الأحماض النووية . 32 (2): 828-833 . doi : 10.1093/nar/gkh220 . PMC 373344. PMID 14762210 .  
  78. 1 2 غوزاييف، أ.ب. دعامات الطور الصلب لتخليق قليل النوكليوتيدات. في : البروتوكولات الحالية في كيمياء الأحماض النووية. (جون وايلي وأولاده، 2013)، الفصل 3، الوحدة 3.1، الصفحات 3.1.1-3.1.60. doi : 10.1002/0471142700.nc0301s53
  79. ↑ بون، آر تي. دعامات الطور الصلب لتخليق قليل النوكليوتيدات. طرق في البيولوجيا الجزيئية (توتوا، نيوجيرسي، الولايات المتحدة) (1993)، 20 (بروتوكولات قليل النوكليوتيدات ونظائرها)، 465-496 doi : 10.1385/0-89603-281-7:465 .
  80. ↑ غوزاييف، أ.ب.؛ مانوهاران، م. (2003). "دعامة صلبة عالمية مُهيأة بنيويًا لتخليق قليل النوكليوتيدات بكفاءة". مجلة الجمعية الكيميائية الأمريكية . 125 (9): 2380-2381 . Bibcode : 2003JAChS.125.2380G . doi : 10.1021/ja0284613 . PMID: 12603111 . 
  81. ↑ جينسن، إم إيه؛ أندرسون، كيه إم؛ ديفيس، آر دبليو (2010). "التحلل وإزالة الفسفرة في الطور الغازي للأوليغوديوكسينوكليوتيدات المرتبطة برابط عالمي" . النيوكليوسيدات والنيوكليوتيدات والأحماض النووية . 29 (11): 867-878 . doi : 10.1080/15257770.2010.534757 . PMC 6815660. PMID 21128173 .  
  82. ↑ «تقرير جلين للأبحاث حول منتجات تخليق وتعديل ووسم قليل النوكليوتيدات من الحمض النووي الريبي والحمض النووي الريبوزي منقوص الأكسجين» . Glenresearch.com. 17 يناير 2008. تاريخ الاطلاع: 12 مايو 2009 .
  83. ↑ "شركة AM Chemicals، LLC، موردة للدعامات الصلبة والكواشف لتخليق قليل النوكليوتيدات والمواد العضوية على الطور الصلب" . Amchemicals.com. مؤرشف من الأصل بتاريخ 7 يوليو 2011. تم الاطلاع عليه بتاريخ 12 مايو 2009 .
  84. ↑ "شركة AM Chemicals، LLC، موردة للدعامات الصلبة والكواشف لتخليق قليل النوكليوتيدات والمواد العضوية على الطور الصلب" . Amchemicals.com. مؤرشف من الأصل بتاريخ 7 يوليو 2011. تم الاطلاع عليه بتاريخ 12 مايو 2009 .
  85. ↑ باول، م. (17 يناير 2008). "الدعامات" . Glenresearch.com. مؤرشف من الأصل في 6 يناير 2009. تم الاطلاع عليه في 12 مايو 2009 .
  86. ↑ أزهاييف، أ.ف.؛ أنتوبولسكي، م.ل. (2001). "إزالة الفوسفات من الطرف 3' للأوليغونوكليوتيدات المصنعة على دعامات A عالمية بمساعدة مجموعة الأميد". Tetrahedron . 57 (23): 4977–4986 . doi : 10.1016/S0040-4020(01)00409-4 .
  87. ↑ "Metkinen Universal Solid Support III" . Metkinenchemistry.com . تم الاطلاع عليه بتاريخ 4 أبريل 2012 .
  88. ↑ "منتجات شركة جلين للأبحاث لتخليق قليل النوكليوتيدات من الحمض النووي DNA والحمض النووي الريبي RNA - دعامة - 27-5010، دعامة عالمية III PS" . Glenresearch.com. 14 نوفمبر 2008. مؤرشف من الأصل في 2 ديسمبر 2008. تم الاطلاع عليه في 12 مايو 2009 .  
  89. ↑ «تقرير أبحاث غلين عن منتجات تخليق وتعديل ووسم قليل النوكليوتيدات من الحمض النووي الريبي والحمض النووي الريبوزي منقوص الأكسجين» . Glenres.com. ١٧ يناير ٢٠٠٨. مؤرشف من الأصل بتاريخ ١٣ أغسطس ٢٠٠٧. تم الاطلاع عليه بتاريخ ١٢ مايو ٢٠٠٩ .
  90. ↑ بيتري، سي آر؛ ريد، إم دبليو؛ آدامز، إيه دي؛ ماير الابن، آر بي (1992). "دعامة CPG محسّنة لتخليق قليل النوكليوتيدات ذات الذيل الأميني 3'". كيمياء الاقتران الحيوي . 3 (1): 85-87 . doi : 10.1021/bc00013a014 . PMID 1616954 . 
  91. ↑ تاناكا، توشيكي؛ ليتسينجر، آر إل (1982). "طريقة الحقنة للتخليق الكيميائي التدريجي للأوليغونوكليوتيدات" . أبحاث الأحماض النووية . 10 (10): 3249-3259 . doi : 10.1093/nar/ 10.10.3249 . PMC 320704. PMID 7099961 .  
  92. ↑ "أوليجو ماستر LS2" . Azcobiotech.com. مؤرشف من الأصل بتاريخ 10 نوفمبر 2011. تم الاطلاع عليه بتاريخ 18 أكتوبر 2011 .
  93. ↑ "جهاز تركيب أوليغونوكليوتيدات الحمض النووي DNA/RNA: MerMade 384" . Bioautomation.com. مؤرشف من الأصل بتاريخ 30 سبتمبر 2011. تم الاطلاع عليه بتاريخ 18 أكتوبر 2011 .
  94. ↑ "جهاز QMaster لتخليق الحمض النووي DNA/RNA" . Genomictechnologies.com.
  95. ↑ "جهاز QMaster لتخليق الحمض النووي DNA/RNA" . www.genomictechnologies.com/QmasterII.shtml. مؤرشف من الأصل بتاريخ 2016-03-04 . تم الاطلاع عليه بتاريخ 2014-04-02 .
  96. ↑ سانغفي، واي إس (2011). "تحديث حالة النيوكليوتيدات المعدلة لتطبيقات العلاج الكيميائي". البروتوكولات الحالية في كيمياء الأحماض النووية . 46 (16): 4.1.1–4.1.22. doi : 10.1002/0471142700.nc0401s46 . ISBN 978-0471142706PMID 21901670 . S2CID 41903519 .​  
  97. 1 2 بيس إيه سي؛ سولاس دي؛ سوليفان إي جيه؛ كرونين إم تي؛ هولمز سي بي؛ فودور إس بي (1994). "مصفوفات قليلة النوكليوتيدات المُولَّدة ضوئيًا لتحليل تسلسل الحمض النووي السريع" . وقائع الأكاديمية الوطنية للعلوم في الولايات المتحدة الأمريكية . 91 ( 11): 5022-5026 . Bibcode : 1994PNAS...91.5022P . doi : 10.1073/pnas.91.11.5022 . PMC 43922. PMID 8197176 .  
  98. ↑ إيجلاند، ر. د.؛ ساوثرن، إي. إم. (2005). "التخليق الموجه كهروكيميائيًا للأوليغونوكليوتيدات لتصنيع مصفوفات الحمض النووي الدقيقة" ( نص كامل مجاني) . أبحاث الأحماض النووية . 33 (14): e125. doi : 10.1093/nar/gni117 . PMC 1183109. PMID 16085751 .  
  99. ↑ كابالدي، دي سي؛ جاوس، إتش؛ كروتز، إيه إتش؛ وآخرون (2003). "تخليق أدوية مضادة للجينات عالية الجودة. إضافة الأكريلونيتريل إلى قليل النوكليوتيدات الفوسفوروثيواتية: توصيف النواتج الإضافية وتجنبها". بحوث وتطوير العمليات العضوية . 7 (6): 832-838 . doi : 10.1021/op020090n . 
  100. ↑ المجلد 5: إزالة الحماية بالكامل في المذيبات العضوية . تقرير جلين 22 (2)
  101. ↑ بوال، جيه إتش؛ ويلك، إيه؛ هاريندراناث، إن؛ ماكس، إي إي؛ كيمبل، تي؛ بيوكاج، إس إل (1996). "انشطار قليل النيوكليوتيدات من دعامات زجاجية ذات مسام مضبوطة وإزالة الحماية السريعة عنها بواسطة الأمينات الغازية" . أبحاث الأحماض النووية . 24 (15): 3115-3117 . doi : 10.1093/nar/24.15.3115 . PMC 146024. PMID 8760903 .  
  102. ↑ ويستمان، إي.؛ سترومبيرغ، ر. (1994). "إزالة حماية تي-بوتيل ثنائي ميثيل سيليل في تخليق الحمض النووي الريبي. يُعد ثلاثي هيدروفلوريد ثلاثي إيثيل أمين (TEA، 3HF) بديلاً أكثر موثوقية لفلوريد رباعي بوتيل الأمونيوم (TBAF)" . مجلة أبحاث الأحماض النووية . 22 (12): 2430-2431 . doi : 10.1093 / nar/22.12.2430 . PMC 523709. PMID 7518583 .  
  103. ↑ كروتز، أ. هـ؛ جاوس، هـ؛ هاردي، ج. إي. (2005). "تكوين نواتج إضافة الأوليغونوكليوتيدات في التركيبات الصيدلانية". تطوير وتكنولوجيا المستحضرات الصيدلانية . 10 (2): 283-290 . doi : 10.1081/PDT-54464 . PMID 15926677. S2CID 34432071 .  
  104. ↑ ويليمز، أ.؛ ديفورس، د.ل.؛ فان بوكسلاير، ج. (2008). "تحليل قليل النوكليوتيدات باستخدام الفصل الكهربائي الشعيري النطاقي وقياس الطيف الكتلي بالرذاذ الإلكتروني، في طرق في البيولوجيا الجزيئية". الفصل الكهربائي الشعيري . 384. توتوا، نيوجيرسي: 401-414 . doi : 10.1007/978-1-59745-376-9_14 . PMID 18392576 . 
  105. ↑ كليفر، جيمس إي.؛ بوير، هربرت دبليو. (14 مارس 1972). "ذوبانية وحدود غسيل الكلى لجزيئات الحمض النووي قليلة النوكليوتيدات" . مجلة بيوكيميكا وبيوفيزيكا أكتا (BBA) - الأحماض النووية وتخليق البروتين . 262 (2): 116-124 . doi : 10.1016/0005-2787(72)90224-9 . ISSN 0005-2787 . PMID 4336092 .  
  106. ↑ "تخليق قليل النوكليوتيدات من الحمض النووي" . ميليبور سيجما . دارمشتات، ألمانيا: ميرك كيه جي إيه إيه.
  107. ^ بارتوسيك، كارولينا؛ ديبيك، كاتارزينا؛ تزارنيكا، آنا؛ سوتشاكا، الزبيتا؛ ليسزكزينسكا ، جرازينا (23/07/2020). "توليف أليغنوكليوتيدات الحمض النووي الريبي المعدلة بقاعدة نووية من خلال نهج ما بعد التخليق" . جزيئات . 25 (15): 3344. دوى : 10.3390 / جزيئات25153344 . ISSN 1420-3049 . بمك 7436257 . بميد 32717917 .   
  108. 1 2 3 4 ويجاند، دانيال ج.؛ ريتشيير، جوناثان. ماير، إيلا. لي هوون. كونواي، نيكولاس ج. أهلستيدت ، دانيال. يورتسيفر، زينب؛ رينوني، دومينيك؛ كورو، إركين؛ تشيرش ، جورج م. (مايو 2025). "التوليف الأنزيمي المستقل عن القالب لأليغنوكليوتيدات الحمض النووي الريبي" . التكنولوجيا الحيوية الطبيعية . 43 (5): 762-772 . دوى : 10.1038 / s41587-024-02244-ث . ISSN 1546-1696 . بمك 12084152 . بميد 38997579 .   
  109. ↑ مونوز-تيلو، باولا؛ غابوس، كارولين؛ ثور، ستيفان (يونيو 2012). "الآثار الوظيفية لبنية بلورة بوليميراز Cid1 بولي(U)" . ستراكشر . 20 (6): 977-986 . doi : 10.1016/j.str.2012.04.006 . PMID 22608966 . 
  110. 1 2 3 4 سابات، نازاري؛ ستامبفلي، أندرياس؛ هانلون، ستيفن؛ بيساجني، سيرينا؛ سلادويفيتش، فيليبو؛ بونتنر، كورت؛ هولنشتاين، مارسيل (2024-09-13). "ربط الحمض النووي المعتمد على القالب لتخليق قليل النوكليوتيدات المعدلة" . نيتشر كوميونيكيشنز . 15 (1): 8009. Bibcode : 2024NatCo..15.8009S . doi : 10.1038/ s41467-024-52141-8 . ISSN 2041-1723 . PMC 11399401. PMID 39271668 .   
  111. 1 2 3 4 يين، ييبنغ؛ تشيلار، كومال؛ الرسول الكسندر. حلمي، بهاسكار؛ إرياغاما، أديكاري م. دانانجاني ن؛ تاناسوفا، مارينا؛ فانغ ، شيوي (2024/10/01). "من أجل تنقية نسبة ضئيلة من البلمرة: توليف قابل للتطوير من السلائف إلى الفوسفوراميديتات القابلة للبلمرة" . PeerJ الكيمياء العضوية . 6 ه12. دوى : 10.7717/peerj-ochem.12 . ردمك 2831-6223 . بمك 11702508 . بميد 39764185 .   
  112. ↑ ين، ييبينغ؛ أرنيسون، ريد؛ يوان، يينان؛ فانغ، شيوي (22 يناير 2025). "أوليغومرات طويلة : التخليق الكيميائي المباشر للجينات التي يصل طولها إلى 1728 نيوكليوتيدًا" . العلوم الكيميائية . 16 (4): 1966-1973 . doi : 10.1039/D4SC06958G . ISSN 2041-6539 . PMC 11694485. PMID 39759933 .   

للمزيد من القراءة