Cryo-electron microscopy

In the 1960s, transmission electron microscopy of biological samples was limited because of radiation damage from the high energy electron beams. Scientists hypothesized that examining specimens at low temperatures would reduce beam-induced radiation damage.^[6] Both liquid helium (−269 °C or 4 K or −452 °F) and liquid nitrogen (−195.79 °C or 77 K or −320 °F) were considered as cryogens,^[7] however high stability was never achieved. In 1980, Erwin Knapek and Jacques Dubochet published comments on beam damage at cryogenic temperatures sharing observations that:

Thin crystals mounted on carbon film were found to be from 30 to 300 times more beam-resistant at 4 K than at room temperature... Most of our results can be explained by assuming that cryoprotection in the region of 4 K is strongly dependent on the temperature.^[8]

مع ذلك، لم تُكرر هذه النتائج. نُشرت تعديلات بعد عامين، ^{[ 9 ]} مصحوبة بتعليق في مجلة Nature ، ^{[ 10 ]} تشير إلى أن مقاومة الشعاع كانت أقل أهمية مما كان متوقعًا. كانت الحماية المُكتسبة عند 4  كلفن أقرب إلى "عشرة أضعاف للعينات القياسية من L- فالين " مما ذُكر سابقًا. ^{[ 10 ]} في حين تُجمع عينات المجهر الإلكتروني فائق البرودة بشكل روتيني عند درجات حرارة النيتروجين السائل، ^{[ 11 ]} استمر العمل لفهم سلوك العينة عند درجات حرارة الهيليوم السائل. ^{[ 12 ] [ 13 ] [ 11 ]}

في عام ١٩٨١، أعلن علماء في مختبر البيولوجيا الجزيئية الأوروبي عن أول نجاح لتقنية المجهر الإلكتروني فائق البرودة (cryo-EM). ^{[ ١٤ ]} قام الباحثون برش الماء النقي على غشاء كربوني محب للماء، ثم غُمر الغشاء بسرعة في مادة مبردة (بروبان سائل أو إيثان سائل مُبرد إلى ٧٧  كلفن). كانت طبقة الجليد غير المتبلور الرقيقة المتكونة على الغشاء أقل من ١  ميكرومتر، وأكد نمط حيود الإلكترون وجود الجليد غير المتبلور/الزجاجي. في عام ١٩٨٤، أثبت الفريق فعالية تقنية المجهر الإلكتروني فائق البرودة في البيولوجيا التركيبية من خلال تحليل فيروسات غدية من النوع ٢، وبكتيريوفاج T4 ، وفيروس غابة سيمليكي ، وبكتيريوفاج CbK ، وفيروس التهاب الفم الحويصلي، بعد تجميدها . ^{[ ١٥ ]} شكلت هذه الورقة البحثية بداية تقنية المجهر الإلكتروني فائق البرودة، وأصبحت هذه التقنية إجراءً روتينياً في المختبرات حول العالم.

يمكن لطاقة الإلكترونات المستخدمة في التصوير (80-300 كيلو فولت) أن تكسر الروابط التساهمية في العينات العضوية والبيولوجية. ^{[ 16 ]} يتطلب تصوير العينات البيولوجية تقليل التعرض للإلكترونات إلى أدنى حد. ويتطلب التعرض المنخفض اختيار صور لآلاف أو ملايين الجزيئات المجمدة، ومحاذاتها، وحساب متوسطها للحصول على خرائط عالية الدقة، باستخدام برامج متخصصة. وقد أدى إدخال كاشفات الإلكترونات المباشرة في عام 2012 وخوارزميات حسابية محسّنة إلى تحسين الخصائص الهيكلية بشكل ملحوظ. ^{[ 17 ]}

تتيح كواشف الإلكترونات المباشرة، وخوارزميات التصوير الأكثر تطورًا، تحديد بنى الجزيئات الكبيرة بدقة تقارب الدقة الذرية. ^{[ 18 ]} تشمل الجزيئات الكبيرة التي تم تصويرها الفيروسات ، والريبوسومات ، والميتوكوندريا ، وقنوات الأيونات ، ومعقدات الإنزيمات . بدءًا من عام 2018، أصبح بالإمكان تطبيق المجهر الإلكتروني فائق البرودة (cryo-EM) على بنى صغيرة مثل الهيموجلوبين (64 كيلو دالتون ) ^{[ 19 ]} بدقة تصل إلى 1.8 أنغستروم . ^{[ 20 ]} في عام 2019، ارتفعت نسبة البنى التي تم تصويرها باستخدام المجهر الإلكتروني فائق البرودة إلى 2.5% من البنى المودعة في بنك بيانات البروتين . ^{[ 21 ] [ 22 ]} يمكن استخدام المجهر الإلكتروني فائق البرودة في التصوير المقطعي الإلكتروني فائق البرودة (cryo-ET)، مما يُتيح إنشاء نماذج ثلاثية الأبعاد للعينات من صور ثنائية الأبعاد مائلة. 

شهدت فترة العقد الثاني من القرن الحادي والعشرين تطورات هائلة في كاميرات الإلكترون، بما في ذلك أجهزة الكشف عن الإلكترونات المباشرة، مما أدى إلى "ثورة في الدقة" ^{[ 23 ]} حيث تم تجاوز حاجز الدقة إلى ما دون  الحد الحرج البالغ 2-3 أنغستروم تقريبًا لتحديد موقع واتجاه الأحماض الأمينية. ^{[ 24 ]}

شكّل ريتشارد هندرسون ( مختبر البيولوجيا الجزيئية التابع لمجلس البحوث الطبية ، كامبريدج، المملكة المتحدة) اتحادًا مع مهندسين من مختبر رذرفورد أبليتون وعلماء من جمعية ماكس بلانك لتمويل وتطوير نموذج أولي. ثم تعاون الاتحاد مع شركة FEI، المُصنّعة للمجاهر الإلكترونية ، لطرح التصميم الجديد وتسويقه. في الوقت نفسه تقريبًا، طرحت شركة Gatan Inc. في بليزانتون، كاليفورنيا، كاشفًا مشابهًا صممه بيتر دينيس ( مختبر لورانس بيركلي الوطني ) وديفيد أغارد ( جامعة كاليفورنيا، سان فرانسيسكو ). وطوّر نغوين-هوو شونغ نوعًا ثالثًا من الكاميرات في شركة Direct Electron ( سان دييغو، كاليفورنيا ). ^{[ 23 ]}

تُسهم التطورات الحديثة في هياكل التصوير القائمة على البروتينات في التغلب على تحيز توجيه العينة وحدود حجمها. ورغم أن الحد الأدنى لحجم البروتينات في المجهر الإلكتروني فائق البرودة (cryo-EM) لم يُحدد بعد، إلا أن البروتينات التي يقل حجمها عن 50  كيلو دالتون تقريبًا تتميز عمومًا بنسبة إشارة إلى ضوضاء منخفضة جدًا (SNR) بحيث لا تستطيع تمييز جزيئات البروتين، مما يجعل إعادة بناء ثلاثي الأبعاد أمرًا صعبًا أو مستحيلاً. ^{[ 25 ] [ 26 ]} وقد تم الإبلاغ عن تقنيات متعددة لتحسين نسبة الإشارة إلى الضوضاء عند تحديد بنى البروتينات الصغيرة. ^{[ 27 ] [ 28 ] وتعتمد هذه الطرق ،} التي تستخدم بروتينات DARPins عالية الألفة ، والأجسام النانوية ، وشظايا الأجسام المضادة ، ^{[ 29} ] على ربط البروتين المستهدف بشكل محكم، مما يزيد من حجم الجسيمات الفعال ويُضفي تناظرًا لتحسين نسبة الإشارة إلى الضوضاء لإعادة بناء خريطة cryo-EM. ومن مزايا cryo-EM على التبلور أنها تتطلب كمية أقل بكثير من مادة العينة، مما يُسهل تحديد بنى البروتينات التي لا يمكن عزلها بكفاءة عالية.

تقديراً لتأثير المجهر الإلكتروني فائق البرودة على الكيمياء الحيوية، مُنح ثلاثة علماء، هم جاك دوبوشيه ويواكيم فرانك وريتشارد هندرسون، جائزة نوبل في الكيمياء "لتطويرهم المجهر الإلكتروني فائق البرودة لتحديد البنية عالية الدقة للجزيئات الحيوية في المحلول". ^{[ 4 ]}

إضافةً إلى إمكانية تصوير العينات البيولوجية المُزجّجة، يُمكن استخدام المجهر الإلكتروني فائق البرودة (cryoTEM) لتصوير عينات المواد شديدة التطاير في الفراغ بحيث يتعذر تصويرها باستخدام المجهر الإلكتروني القياسي في درجة حرارة الغرفة. على سبيل المثال، يُمكن استخلاص مقاطع مُزجّجة من أسطح التماس بين السوائل والمواد الصلبة لتحليلها باستخدام cryoTEM، ^{[ 53 ]} كما يُمكن تثبيت الكبريت، المعرض للتسامي في فراغ المجاهر الإلكترونية، وتصويره باستخدام cryoTEM. ^{[ 54 ]}