الكروموسوم الدائري

يتكون منشأ تضاعف الحمض النووي في بكتيريا الإشريكية القولونية ، والذي يُسمى oriC ، من تسلسلات الحمض النووي التي يتعرف عليها بروتين DnaA ، وهو بروتين محفوظ للغاية بين أنواع البكتيريا المختلفة . يؤدي ارتباط DnaA بالمنشأ إلى بدء عملية استقطاب منظمة لأنزيمات وبروتينات أخرى، مما يؤدي في النهاية إلى تكوين اثنين من الريبليسومات الكاملة للتضاعف ثنائي الاتجاه. ^{[ 1 ]}

تتضمن عناصر تسلسل الحمض النووي داخل منطقة بدء التضاعف oriC، المهمة لوظيفتها، صناديق DnaA، وهي تكرار مكون من 9 نيوكليوتيدات بتسلسل توافقي محفوظ للغاية 5' – TTATCCACA – 3'، ^{[ 2 ]} والتي يتعرف عليها بروتين DnaA. يلعب بروتين DnaA دورًا حاسمًا في بدء تضاعف الحمض النووي الصبغي. ^{[ 3 ]} يرتبط بروتين DnaA بجزيء ATP، وبمساعدة بروتينات شبيهة بالهيستون البكتيرية [HU]، يقوم بفك منطقة غنية بالأدينين والثايمين بالقرب من الحد الأيسر لمنطقة بدء التضاعف oriC ، والتي تحمل ثلاثة أنماط مكونة من 13 نيوكليوتيدًا، ^{[ 4 ]} ويفتح الحمض النووي المزدوج لدخول بروتينات التضاعف الأخرى. ^{[ 5 ]}

تحتوي هذه المنطقة أيضًا على أربعة تسلسلات من عناصر فك التفاف الحمض النووي "GATC" التي يتعرف عليها إنزيم ميثيل أدينين الحمض النووي (Dam)، وهو إنزيم يُعدِّل قاعدة الأدينين عندما يكون هذا التسلسل غير مُمَثْيَل أو مُمَثْيَل جزئيًا. يُعدّ مَثْيَل الأدينين مهمًا لأنه يُغيّر بنية الحمض النووي لتعزيز فصل السلاسل، ^{[ 6 ]} ويبدو أن هذه المنطقة من ori C لديها ميل طبيعي للفك. ^{[ 7 ]}

ثم يقوم DnaA بتجنيد إنزيم الهيليكاز التضاعفي ، DnaB ، من معقد DnaB-DnaC إلى المنطقة غير الملتفة لتشكيل معقد ما قبل البدء. ^{[ 8 ]} بعد انتقال DnaB إلى قمة كل شوكة تضاعف، يقوم إنزيم الهيليكاز بفك الحمض النووي الأبوي ويتفاعل مؤقتًا مع إنزيم البرايميز . ^{[ 9 ]}

لضمان استمرار عملية تضاعف الحمض النووي، يلزم وجود بروتينات ربط أحادية السلسلة لمنع خيوط الحمض النووي المفردة من تكوين تراكيب ثانوية ومنعها من إعادة الارتباط . إضافةً إلى ذلك، يلزم وجود إنزيم DNA gyrase لتخفيف الإجهاد الطوبولوجي الناتج عن عمل إنزيم DnaB helicase.

عندما تتحرك شوكة التضاعف حول الدائرة، يتشكل تركيب على شكل الحرف اليوناني ثيتا ( θ). وقد أثبت جون كيرنز تركيب ثيتا لتضاعف كروموسومات الإشريكية القولونية عام 1963، باستخدام طريقة مبتكرة لتصوير تضاعف الحمض النووي. في تجربته، قام كيرنز بوسم الكروموسوم إشعاعيًا عن طريق زراعة مزارعه في وسط يحتوي على الثيميدين الموسوم بالتريتيوم (3H- thymidine ). تم دمج قاعدة النيوكليوزيد بشكل متجانس في كروموسوم البكتيريا. ثم قام بعزل الكروموسومات عن طريق تحليل الخلايا برفق ووضعها على شبكة مجهر إلكتروني ، ثم عرضها لفيلم الأشعة السينية لمدة شهرين. توضح هذه التجربة بوضوح نموذج تضاعف ثيتا للكروموسومات البكتيرية الدائرية. ^{[ 10 ]}

• انظر إلى الصورة الإشعاعية الذاتية للكروموسوم المتضاعف السليم لبكتيريا الإشريكية القولونية

كما ذُكر سابقًا، يحدث تضاعف الكروموسومات البكتيرية في اتجاهين. وقد تم إثبات ذلك لأول مرة من خلال وسم الكروموسومات البكتيرية المتضاعفة بنظائر مشعة . ثم تم تصوير مناطق الحمض النووي التي تخضع للتضاعف أثناء التجربة باستخدام التصوير الإشعاعي الذاتي وفحص الفيلم المُظهَر مجهريًا. وقد مكّن هذا الباحثين من تحديد مواقع حدوث التضاعف. وكانت أولى الملاحظات الحاسمة على التضاعف ثنائي الاتجاه من دراسات أجريت على بكتيريا Bacillus subtilis. ^{[ 11 ]} وبعد ذلك بوقت قصير، تبين أيضًا أن كروموسوم بكتيريا Escherichia coli يتضاعف في اتجاهين. ^{[ 12 ]}

• انظر الشكل 4 من DM Prescott و PL Kuempel (1972): مسار الحبوب الناتج عن كروموسوم E. coli من الخلايا التي تم وسمها لمدة 19 دقيقة باستخدام [3H] thymine، متبوعًا بالوسم لمدة 2.5 دقيقة باستخدام [3H]thymine و ['H]thymidine..

إنزيم بوليميراز الحمض النووي DNA III الكامل في بكتيريا الإشريكية القولونية عبارة عن مركب بوزن 900 كيلو دالتون، يتميز ببنية ثنائية في الأساس . تحتوي كل وحدة أحادية على نواة محفزة، ووحدة فرعية للتكوين الثنائي ، ومكون للمعالجة . ^{[ 13 ]} يستخدم بوليميراز الحمض النووي DNA III مجموعة واحدة من وحداته الفرعية الأساسية لتخليق السلسلة الرائدة باستمرار، بينما تنتقل المجموعة الأخرى من الوحدات الفرعية الأساسية من قطعة أوكازاكي إلى القطعة التالية على السلسلة المتأخرة الحلقية . يبدأ تخليق السلسلة الرائدة بتخليق بادئ RNA قصير عند منشأ التضاعف بواسطة إنزيم برايميز ( بروتين DnaG ).

تُضاف النيوكليوتيدات منزوعة الأكسجين إلى هذا البادئ بواسطة ثنائي بوليميراز الحمض النووي III، ضمن مُركّب مُتكامل مع إنزيم DnaB الحلزوني. ثم يستمر تخليق السلسلة الرائدة بشكل مُتواصل، بينما يتم فك التفاف الحمض النووي في الوقت نفسه عند شوكة التضاعف. في المقابل، يتم تخليق السلسلة المتأخرة في أجزاء أوكازاكي قصيرة. أولًا، يتم تخليق بادئ الحمض النووي الريبي بواسطة إنزيم البرايميز، ومثلما هو الحال في تخليق السلسلة الرائدة، يرتبط بوليميراز الحمض النووي III ببادئ الحمض النووي الريبي ويُضيف النيوكليوتيدات منزوعة الأكسجين .

عند اكتمال عملية تخليق قطعة أوكازاكي، يتوقف التضاعف وتنفصل الوحدات الفرعية الأساسية لإنزيم بوليميراز الحمض النووي III عن مشبك بيتا المنزلق [مشبك بيتا المنزلق هو الوحدة الفرعية المسؤولة عن استمرارية إنزيم بوليميراز الحمض النووي III]. ^{[ 14 ]} تتم إزالة بادئ الحمض النووي الريبي واستبداله بالحمض النووي بواسطة إنزيم بوليميراز الحمض النووي I [الذي يمتلك أيضًا نشاطًا خارجيًا للتدقيق اللغوي ]، ويتم إغلاق الشق المتبقي بواسطة إنزيم ليغاز الحمض النووي ، الذي يقوم بدوره بربط هذه القطع لتكوين السلسلة المتأخرة.

تتعرض نسبة كبيرة (10-15%) من شوكات التضاعف الناشئة من موقع oriC لتلف في الحمض النووي أو انقطاع في السلسلة عند زراعة الخلايا في ظروف المختبر العادية (بدون معالجة خارجية مُسببة لتلف الحمض النووي). ^{[ 15 ]} عادةً ما تتم معالجة تلف الحمض النووي بواسطة إنزيمات إصلاح إعادة التركيب للسماح باستمرار تقدم شوكة التضاعف. ^{[ 15 ]}

الإنهاء هو عملية اندماج شوكات التضاعف وتفكك الريبليسومات لإنتاج جزيئين منفصلين وكاملين من الحمض النووي . يحدث هذا في منطقة النهاية، المقابلة تقريبًا لموقع بدء التضاعف (oriC) على الكروموسوم (الشكل 5). تحتوي منطقة النهاية على عدة مواقع لإنهاء تضاعف الحمض النووي، أو ما يُعرف بمواقع "Ter". يجب أن يرتبط بروتين خاص بـ"إنهاء التضاعف" بموقع Ter لإيقاف التضاعف مؤقتًا. لكل موقع Ter قطبية عمل، أي أنه سيوقف شوكة التضاعف التي تقترب منه من اتجاه معين، ولكنه سيسمح بحركة الشوكة دون عوائق من الاتجاه الآخر. يشكل ترتيب مواقع Ter مجموعتين متقابلتين تجبران الشوكتين على الالتقاء داخل المنطقة التي تمتدان فيها. يُطلق على هذا الترتيب اسم "مصيدة شوكة التضاعف". ^{[ 16 ]}

• انظر إلى مواقع وتسلسلات نهايات تضاعف الحمض النووي في بكتيريا الإشريكية القولونية. (أ) خريطة توضح موقع بدء التضاعف (ori) ومواقع Ter العشرة. (ب) التسلسل المتفق عليه لـ Ter.

تتفاعل مواقع Ter تحديدًا مع بروتين إنهاء التضاعف المسمى Tus في بكتيريا الإشريكية القولونية . ^{[ 17 ]} يعيق مركب Tus-Ter نشاط فك الحمض النووي لـ DnaB بطريقة تعتمد على الاتجاه. ^{[ 18 ]}

• البنية البلورية لمركب بروتين Ter DNA-Tus (أ) تُظهر الوجهين غير المُعيق والمُعيق لشوكة التفرع لبروتين Tus. (ب) منظر مقطعي للسطح المُثبِّط للهيليكاز.

يؤدي تضاعف الحمض النووي الذي يفصل بين شوكتي التضاعف المتقابلتين إلى تكوين كروموسومات متصلة على شكل حلقات متشابكة طوبولوجيًا. لا ترتبط هذه الحلقات بروابط تساهمية، بل بروابط ميكانيكية، لأنها ملتفة حول بعضها البعض ، وكل حلقة منها مغلقة بروابط تساهمية. تتطلب هذه الحلقات المتشابكة عمل إنزيمات التوبويزوميراز لفصلها (فك التشابك). في بكتيريا الإشريكية القولونية ، يلعب إنزيم توبويزوميراز الحمض النووي الرابع الدور الرئيسي في فصل الكروموسومات المتشابكة، حيث يقوم بكسر مؤقت لكلا سلسلتي الحمض النووي لأحد الكروموسومات، مما يسمح للكروموسوم الآخر بالمرور عبر هذا الكسر.

ثمة بعض اللبس حول دور إنزيم DNA gyrase في عملية فك التشابك. ولتحديد المصطلحات، يوجد نوعان من إنزيمات التوبويزوميراز: النوع الأول يُحدث كسورًا مؤقتة في سلسلة الحمض النووي المفردة، والنوع الثاني يُحدث كسورًا مؤقتة في سلسلتي الحمض النووي. ونتيجةً لذلك، يُزيل إنزيم النوع الأول الالتفافات الفائقة من الحمض النووي واحدةً تلو الأخرى، بينما يُزيل إنزيم النوع الثاني الالتفافات الفائقة اثنتين في كل مرة. يُعد إنزيم التوبويزوميراز الأول (topo I) في كل من بدائيات النوى وحقيقيات النوى من النوع الأول. أما إنزيم التوبويزوميراز الثاني (topo II) في حقيقيات النوى، وإنزيم gyrase البكتيري، وإنزيم التوبويزوميراز الرابع (topo IV) البكتيري، فتنتمي إلى النوع الثاني.

يمتلك إنزيم DNA gyrase أيضًا نشاط توبويزوميراز من النوع الثاني؛ لذا، وباعتباره نظيرًا لتوبويزوميراز IV (الذي يمتلك أيضًا نشاط توبويزوميراز من النوع الثاني)، نتوقع تشابهًا في وظائف البروتينين. يتمثل الدور الأولي لإنزيم DNA gyrase في إدخال التواءات فائقة سالبة في الحمض النووي، مما يؤدي إلى إرخاء الالتواءات الفائقة الموجبة التي تتشكل أثناء تضاعف الحمض النووي. كما يُرخي توبويزوميراز IV الالتواءات الفائقة الموجبة، وبالتالي، يلعب كل من إنزيم DNA gyrase وتوبويزوميراز IV دورًا متطابقًا تقريبًا في إزالة الالتواءات الفائقة الموجبة أمام بوليميراز الحمض النووي المتحرك، مما يسمح باستمرار تضاعف الحمض النووي دون عوائق ناتجة عن الإجهاد الطوبولوجي. ^{[ 19 ]}

إنزيم DNA gyrase ليس الإنزيم الوحيد المسؤول عن فك تشابك الكروموسومات. في تجربة أجراها زيكيدريش وخودورسكي وكوزاريلي عام ١٩٩٧، وُجد أن إنزيم توبويزوميراز IV هو الإنزيم الوحيد المهم المسؤول عن فك تشابك وسائط تضاعف الحمض النووي في البكتيريا. ^{[ ٢٠ ]} عند تثبيط إنزيم DNA gyrase وحده، انفصلت معظم سلاسل الكروموسومات. مع ذلك، عند تثبيط إنزيم توبويزوميراز IV وحده، توقف فك التشابك بشكل شبه كامل. يشير هذا إلى أن إنزيم توبويزوميراز IV هو البروتين الأساسي لفك تشابك الكروموسومات المترابطة في الكائنات الحية ، بينما يلعب إنزيم DNA gyrase دورًا ثانويًا.