التألق المناعي

📅 آخر تحديث: ٢٥ يوليو ٢٠٢٦
✍️ نُشر في: ٢٥ يوليو ٢٠٢٦
📷 يحتوي على 8 صور
الموسوعة الحرة

الأوعية الدموية في جلد الخنزير تحت المجهر الفلوري ( أكتين العضلات الملساء مع صبغة أليكسا فلور 488). الأخضر = أكتين العضلات الملساء (SMA) مع صبغة أليكسا فلور 488. الأزرق = صبغة DAPI المضادة. الأحمر = التألق الذاتي.

التألق المناعي (IF) هو تقنية تعتمد على المجهر الضوئي ، وتتيح الكشف عن مجموعة واسعة من الجزيئات الحيوية المستهدفة وتحديد موقعها داخل الخلية أو النسيج على مستوى كمي. تعتمد هذه التقنية على خصوصية ارتباط الأجسام المضادة بالمستضدات . [ 1 ] تُسمى المنطقة المحددة التي يتعرف عليها الجسم المضاد على المستضد " محدد المستضد ". يمكن لعدة أجسام مضادة التعرف على نفس محدد المستضد، ولكنها تختلف في قوة ارتباطها به. يتفوق الجسم المضاد ذو الألفة الأعلى لمحدد مستضد معين على الأجسام المضادة ذات الألفة الأقل لنفس المحدد. [ 2 ] [ 3 ]

عن طريق ربط الجسم المضاد بصبغة فلورية ، يتم تحديد موقع الجزيء الحيوي المستهدف من خلال إثارة الصبغة وقياس انبعاث الضوء عند طول موجي محدد مسبقًا باستخدام مجهر فلوري . ومن الضروري ألا يؤثر ارتباط الصبغة بالجسم المضاد نفسه على الخصوصية المناعية للجسم المضاد أو قدرة ارتباطه بالمستضد. [ 4 ] [ 5 ]

يُعدّ التألق المناعي مثالًا شائع الاستخدام على التلوين المناعي (استخدام الأجسام المضادة لتلوين البروتينات)، وهو مثالٌ خاص على الكيمياء النسيجية المناعية (استخدام العلاقة بين الجسم المضاد والمستضد في الأنسجة). تعتمد هذه التقنية بشكل أساسي على الفلوروفورات لتحديد موقع الأجسام المضادة، بينما تُحدث تقنيات أخرى تغيرًا لونيًا في الوسط المحيط بالمستضد المراد دراسته، أو تستخدم علامات مشعة. وقد طُوّرت تقنيات التألق المناعي التي تستخدم الأجسام المضادة الموسومة في أربعينيات القرن العشرين على يد ألبرت إتش. كونز . [ 2 ] [ 6 ] [ 7 ]

صورة مجهرية لمقطع نسيجي من جلد بشري مُعدّ للفحص المناعي الفلوري المباشر باستخدام جسم مضاد من نوع IgG. الجلد مأخوذ من مريض مصاب بمرض الذئبة الحمراء الجهازية ، ويُظهر ترسب IgG في موضعين مختلفين: الأول هو ترسب شريطي الشكل على طول الغشاء القاعدي للبشرة (اختبار شريط الذئبة إيجابي). أما الثاني فهو داخل نوى خلايا البشرة (أجسام مضادة للنواة).

تُستخدم تقنية التألق المناعي لتحليل توزيع البروتينات ، والسكريات ، والجزيئات البيولوجية وغير البيولوجية الصغيرة، وتصوير التراكيب مثل الخيوط متوسطة الحجم. [ 8 ]

إذا لم تُحدد بنية غشاء الخلية، يُمكن استخدام إدخال الإبيتوب في البروتينات بالتزامن مع التألق المناعي لتحديد البنى داخل غشاء الخلية. [ 9 ] كما يُمكن استخدام التألق المناعي (IF) كطريقة "شبه كمية" لفهم مستويات وأنماط تموضع مثيلة الحمض النووي. بالإضافة إلى ذلك، يُمكن استخدام التألق المناعي مع طرق أخرى للتلوين الفلوري غير المعتمدة على الأجسام المضادة، مثل استخدام DAPI لوسم الحمض النووي . [ 10 ] [ 11 ]

يمكن إجراء فحص عينات التألق المناعي باستخدام تكوينات مجهرية مختلفة، بما في ذلك مجهر التألق فوق البنفسجي ، والمجهر متحد البؤر ، والمجهر واسع المجال. [ 12 ]

الأنواع

الأنماط الرئيسية للأجسام المضادة للنواة في التألق المناعي. [ 13 ]

تحضير الفلورة

لإجراء التلوين المناعي الفلوري، يجب ربط جزيء فلوري (أو وسمه) بجسم مضاد. يمكن تطبيق إجراءات التلوين على الأجسام المضادة المُعبَّر عنها داخل الخلايا، أو على مستضدات سطح الخلية على الخلايا الحية. توجد فئتان رئيسيتان من تقنيات التلوين المناعي الفلوري: أولية (مباشرة) وثانوية (غير مباشرة). [ 1 ] [ 2 ] ستركز الأوصاف التالية بشكل أساسي على هاتين الفئتين من حيث الأجسام المضادة المرتبطة. [ 12 ]

أساسي (مباشر)

المفهوم الأساسي للتألق المناعي الأولي : جسم مضاد مع فلوروفور مقترن، يرتبط بشكل خاص بجزء محدد على الجزيء المستهدف.

تستخدم تقنية التألق المناعي الأولي (المباشر) جسمًا مضادًا واحدًا مرتبطًا بصبغة فلورية . يتعرف الجسم المضاد على الجزيء المستهدف (المستضد) ويرتبط بمنطقة محددة تُسمى الإبيتوب . يمكن الكشف عن الصبغة الفلورية المرتبطة باستخدام المجهر الفلوري، الذي يُصدر، اعتمادًا على نوع الصبغة الفلورية، طولًا موجيًا محددًا من الضوء عند إثارته. [ 1 ] [ 14 ]

يقلل الربط المباشر للفلوروفور بالجسم المضاد من عدد خطوات تحضير العينة، مما يوفر الوقت ويقلل من إشارة الخلفية غير النوعية أثناء التحليل. [ 12 ] كما يحدّ ذلك من احتمالية التفاعل المتبادل للأجسام المضادة، والأخطاء المحتملة خلال العملية. من عيوب تقنية التألق المناعي المباشر (DIF) محدودية عدد الأجسام المضادة التي يمكنها الارتباط بالمستضد، مما قد يقلل من حساسية التقنية. عندما يكون البروتين المستهدف متوفرًا بتراكيز منخفضة فقط، يُعدّ التألق المناعي الثانوي (FI) خيارًا أفضل، إذ يُعتبر أكثر حساسية من تقنية التألق المناعي المباشر [ 2 ] [ 12 ] مقارنةً بتقنية التألق المناعي الثانوي (غير المباشر). [ 1 ]

المفهوم الأساسي للتألق المناعي الثانوي : جسم مضاد ثانوي، مع فلوروفور مقترن، مرتبط بجسم مضاد أولي مرتبط بشكل خاص بجزء محدد على الجزيء المستهدف.

ثانوي (غير مباشر)

التألق المناعي الثانوي (غير المباشر) مشابه للتألق المناعي المباشر، إلا أن هذه التقنية تستخدم نوعين من الأجسام المضادة، أحدهما فقط يحمل جزيء فلوري مرتبط. يُطلق على الجسم المضاد المرتبط بالجزيء الفلوري اسم الجسم المضاد الثانوي، بينما يُطلق على الجسم المضاد غير المرتبط اسم الجسم المضاد الأولي. [ 1 ]

تعتمد هذه التقنية على مبدأ أن الجسم المضاد الأولي يرتبط بشكل خاص بالجزء المحدد على الجزيء المستهدف، بينما يقوم الجسم المضاد الثانوي، المرتبط بالفلوروفور، بالتعرف على الجسم المضاد الأولي والارتباط به. [ 1 ]

تُعتبر هذه التقنية أكثر حساسية من التألق المناعي الأولي، لأن العديد من الأجسام المضادة الثانوية يمكنها الارتباط بنفس الجسم المضاد الأولي. يؤدي ازدياد عدد جزيئات الفلوروفور لكل مستضد إلى زيادة كمية الضوء المنبعث، وبالتالي تضخيم الإشارة. [ 1 ] توجد طرق مختلفة لتحقيق نسبة أعلى من الفلوروفور إلى المستضد، مثل طريقة معقد الأفيدين-بيوتين (طريقة ABC) وطريقة الستربتافيدين-بيوتين الموسوم (طريقة LSAB). [ 15 ] [ 16 ]

القيود

المفهوم الأساسي لطريقة ABC : يرتبط الجسم المضاد الأولي بالمستضد، قبل أن يرتبط بالجسم المضاد الثانوي المُعلَّم بالبيوتين. ثم يرتبط مُركَّب إنزيم الأفيدين-بيوتين (ABC) بالجسم المضاد الثانوي.

يقتصر استخدام التألق المناعي على الخلايا الثابتة (أي الميتة) عند دراسة التراكيب داخل الخلية، إذ لا تخترق الأجسام المضادة عادةً الأغشية الخلوية أو دون الخلوية السليمة في الخلايا الحية، لأنها بروتينات كبيرة. ولتصوير هذه التراكيب، يجب تثبيت المادة المستضدية بإحكام في موضعها الطبيعي داخل الخلية. [ 17 ] لدراسة التراكيب داخل الخلايا الحية، بالاقتران مع التألق، يمكن استخدام البروتينات المؤتلفة التي تحتوي على نطاقات بروتينية متألقة، مثل البروتين الفلوري الأخضر (GFP). تتضمن تقنية GFP تعديل المعلومات الوراثية للخلايا. [ 18 ] [ 19 ]

تُعدّ ظاهرة التلاشي الضوئي مشكلةً رئيسيةً في تقنية التألق المناعي ، [ 12 ] حيث يفقد الفلوروفور قدرته على إصدار الضوء بشكلٍ دائم. [ 1 ] وللحدّ من خطر التلاشي الضوئي، يمكن اتباع استراتيجياتٍ مختلفة. فمن خلال تقليل شدة الضوء أو مدة التعرض له، أو الحدّ منها، تقلّ دورة امتصاص وانبعاث الضوء الفلوري، وبالتالي الحفاظ على وظيفة الفلوروفور. كما يمكن زيادة تركيز الفلوروفورات، أو اختيار فلوروفوراتٍ أكثر مقاومةً للتلاشي الضوئي، مثل فلوروفورات أليكسا ، وفلوروفورات سيتا، وفلوروفورات داي لايت . [ 2 ]

المفهوم الأساسي لطريقة LSAB : تعتمد هذه الطريقة على استخدام مُقترن الستربتافيدين-الإنزيم لتحديد الجسم المضاد الثانوي المُؤشَّر بالبيوتين والمرتبط بالجسم المضاد الأولي. وتُعدّ هذه الطريقة مناسبة عندما يصبح مُركَّب الأفيدين-البيوتين في طريقة ABC كبيرًا جدًا.

تشمل المشكلات الأخرى التي قد تنشأ عند استخدام تقنيات التألق المناعي: التألق الذاتي ، والتداخل الطيفي، والتلوين غير النوعي. [ 1 ] [ 2 ] يشمل التألق الذاتي التألق الطبيعي المنبعث من نسيج العينة أو الخلية نفسها. يحدث التداخل الطيفي عندما يكون للفلوروفور طيف انبعاث واسع يتداخل مع طيف فلوروفور آخر، مما يؤدي إلى إشارات خاطئة. يحدث التلوين غير النوعي عندما يرتبط الجسم المضاد، الذي يحتوي على الفلوروفور، ببروتينات غير مقصودة بسبب تشابه كافٍ في الإبيتوب. قد يؤدي هذا إلى نتائج إيجابية خاطئة. [ 2 ] [ 4 ] [ 1 ] في دراسة أجريت عام 2025 حول خصوصية تلوين IgG كطريقة لتقييم تسربات الحاجز الدموي الدماغي في الفئران، وجدت الدراسة انخفاضًا تامًا في التلوين غير النوعي عند تسخين مقاطع الدماغ إلى 75  درجة مئوية، وانخفاضات كبيرة مع استخدام مزيج من المعالجة المسبقة ببيروكسيد الهيدروجين ومثبط الكاتالاز 3-AT. [ 20 ]

التطورات

تكمن التحسينات الرئيسية في تقنية التألق المناعي في تطوير الفلوروفورات والمجاهر الفلورية. يمكن تعديل بنية الفلوروفورات لتحسين سطوعها وثباتها الضوئي، مع الحفاظ على خصائصها الطيفية ونفاذيتها للخلايا. [ 21 ]

صورة مجهرية لمقطع نسيجي من جلد بشري مُعدّ للفحص المناعي الفلوري المباشر باستخدام جسم مضاد من نوع IgA. الجلد مأخوذ من مريض مصاب بفرفرية هينوخ-شونلاين : توجد ترسبات IgA في جدران الشعيرات الدموية السطحية الصغيرة (الأسهم الصفراء). المنطقة الخضراء الباهتة المتموجة في الأعلى هي البشرة ، والمنطقة الليفية في الأسفل هي الأدمة .

تُتيح طرق المجهر الفلوري فائق الدقة إنتاج صور بدقة أعلى من تلك التي تفرضها حدود الحيود في المجاهر التقليدية . وهذا يُمكّن من تحديد التفاصيل البنيوية داخل الخلية. [ 22 ] ويُشير مصطلح "فائق الدقة" في الفلورة، تحديدًا، إلى قدرة المجهر على منع الفلورة المتزامنة للفلوروفورات المتجاورة ذات الطيف المتطابق (التداخل الطيفي). ومن بين طرق المجهر الفلوري فائق الدقة التي طُوّرت حديثًا: مجهر استنزاف الانبعاث المُحفّز ( STED )، ومجهر الإضاءة المُهيكلة المشبعة (SSIM)، ومجهر تحديد موقع التنشيط الضوئي الفلوري (F PALM )، ومجهر إعادة البناء البصري العشوائي (STORM). [ 23 ]

شخصيات بارزة

انظر أيضاً

مراجع

  1. 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 أوديل، آي دي، وكوك، دي (2013-01-01). "تقنيات التألق المناعي" . مجلة الأمراض الجلدية الاستقصائية . 133 (1): e4. doi : 10.1038/jid.2012.455 . PMID 23299451 . 
  2. 1 2 3 4 5 6 7 جوشي إس، يو دي (2017)، "التألق المناعي" ، أساليب العلوم الأساسية للباحثين السريريين ، إلسيفير، ص 135-150 ، doi : 10.1016/b978-0-12-803077-6.00008-4 ، ISBN  978-0-12-803077-6تم الاطلاع عليه بتاريخ 14 فبراير 2024
  3. ↑ لادنر، آر سي (2007-01-01). "رسم خرائط الحواتم للأجسام المضادة". مراجعات التكنولوجيا الحيوية والهندسة الوراثية . 24 (1): 1-30 . CiteSeerX 10.1.1.536.6172 . doi : 10.1080/02648725.2007.10648092 . PMID 18059626. S2CID 34595289 .   
  4. 1 2 ماركس كيه إم، نولان جي بي (أغسطس 2006). " استراتيجيات الوسم الكيميائي لبيولوجيا الخلية" . نيتشر ميثودز . 3 (8): 591-596 . doi : 10.1038/nmeth906 . ISSN 1548-7091 . PMID 16862131. S2CID 27848267 .   
  5. ↑ أوينيوس ر، أوسترلوند م، ليندغرين م، سفينسون م، أولسن أو إتش، بيرسون إي، فريسكغارد بي أو، كارلسون يو (أكتوبر 1999). "خصائص العلامات الدورانية والفلورية عند سطح التفاعل بين المستقبل والرابط" . مجلة الفيزياء الحيوية . 77 (4): 2237-2250 . Bibcode : 1999BpJ....77.2237O . doi : 10.1016/ S0006-3495 (99)77064-5 . PMC 1300504. PMID 10512843 .  
  6. ↑ هوكفلت، ت. (نوفمبر 1999). "علم الأحياء العصبية بفضل علم الأحياء الدقيقة: إرث ألبرت هـ. كونز (1912-1978)" . نشرة أبحاث الدماغ . 50 ( 5-6 ): 371-372 . doi : 10.1016/S0361-9230(99)00109-4 . PMID 10643440. S2CID 33618171 .  
  7. ↑ شينغ و، تشانغ سي، محي الدين تي إم، الراوي إم، زيبرنيك إف، فالكون إف إتش، مينولد-هيرلين آي، حسين إيه إف (2023-02-04). " التألق المناعي المتعدد: أداة فعالة في العلاج المناعي للسرطان" . المجلة الدولية للعلوم الجزيئية . 24 (4): 3086. doi : 10.3390/ijms24043086 . ISSN 1422-0067 . PMC 9959383. PMID 36834500 .   
  8. ↑ فرانك دبليو دبليو، شميد إي، أوزبورن إم، ويبر كيه (أكتوبر 1978). "خيوط متوسطة الحجم مختلفة تم تمييزها بواسطة المجهر المناعي الفلوري" . وقائع الأكاديمية الوطنية للعلوم في الولايات المتحدة الأمريكية . 75 (10): 5034-5038 . Bibcode : 1978PNAS...75.5034F . doi : 10.1073/pnas.75.10.5034 . PMC 336257. PMID 368806 .  
  9. ↑ وانغ هـ، لي إي دبليو، كاي إكس، ني زد، تشو إل، ماو كيو (ديسمبر 2008). "تحديد بنية غشاء بروتين مقاومة سرطان الثدي البشري (BCRP/ABCG2) عن طريق إدخال الإبيتوب والتألق المناعي" . الكيمياء الحيوية . 47 (52): 13778-13787 . doi : 10.1021/bi801644v . PMC 2649121. PMID 19063604 .  
  10. ↑ Çelik S (يناير 2015). "فهم تعقيد استرجاع المستضدات من مثيلة الحمض النووي لقياسات التألق المناعي ومنهجية التحدي" . مجلة أساليب علم المناعة . 416 : 1-16 . doi : 10.1016/j.jim.2014.11.011 . PMID 25435341 . 
  11. ↑ غريماسون أ، سميث هـ، باركر ج، بخاري ز، كامبل أ، روبرتسون ل (مارس 1994). "تطبيق DAPI والتألق المناعي لتحسين تحديد بويضات الكريبتوسبوريديوم في عينات المياه" . أبحاث المياه . 28 (3): 733-736 . Bibcode : 1994WatRe..28..733G . doi : 10.1016/0043-1354(94)90154-6 .
  12. 1 2 3 4 5 Piña R، Santos-Díaz AI، Orta-Salazar E، Aguilar-Vazquez AR، Mantellero CA، Acosta-Galeana I، Estrada-Mondragon A، Pre-Gonzalez M، Martinez-Cruz JI، Rosas-Arellano A (2022/01/26). "عشرة أساليب تعمل على تحسين تلطيخ المناعة: مراجعة لأحدث التطورات لتحسين التألق المناعي" . المجلة الدولية للعلوم الجزيئية . 23 (3): 1426. دوى : 10.3390/ijms23031426 . ردمك 1422-0067 . بمك 8836139 . بميد 35163349 .   
  13. ↑ المغالس، ج. أ. (2022). "أنماط الأجسام المضادة للنواة لدى مرضى الذئبة الحمامية الجهازية وعلاقتها بالمعايير المناعية التشخيصية الأخرى" . فرونت إيمونول . 13 850759. doi : 10.3389/fimmu.2022.850759 . PMC 8964090. PMID 35359932 .  تعديلات طفيفة بواسطة Mikael Häggström، MD - ترخيص Attribution 4.0 International (CC BY 4.0)
  14. ↑ "طرق التلوين المناعي النسيجي" (ملف PDF) . دليل التلوين المناعي النسيجي ( الطبعة السادسة). شركة داكو الدنماركية، إحدى شركات أجيلنت تكنولوجيز. 2013. مؤرشف من النسخة الأصلية (ملف PDF) بتاريخ 3 أغسطس 2016. تاريخ الاطلاع: 14 مايو 2014 . 
  15. ↑ إم ك، مارينينوف س، دياز إم إف، يونغ دبليو إتش (2019)، "مقدمة في إجراء التلوين المناعي الفلوري"، في يونغ دبليو إتش (محرر)، بنوك العينات الحيوية ، المجلد 1897، نيويورك، نيويورك: سبرينغر نيويورك، الصفحات 299-311 ، doi : 10.1007/978-1-4939-8935-5_26 ، ISBN   978-1-4939-8933-1، PMC 6918834 ، PMID 30539454  
  16. ↑ ياريلين د، شو ك، توركيكول م، فان ن، رومين ي، فيجيساوا س، بارلاس أ، مانوفا-تودوروفا ك (31 مارس 2015). "طريقة آلية للتحليل الجزيئي المتعدد في الموقع للأنسجة باستخدام الكشف المناعي الفلوري" . التقارير العلمية . 5 (1): 9534. Bibcode : 2015NatSR...5.9534Y . doi : 10.1038 / srep09534 . ISSN 2045-2322 . PMC 4821037. PMID 25826597 .   
  17. ↑ "التثبيت والنفاذية في الكيمياء المناعية الخلوية /التألق المناعي (ICC/IF)" . نوفوس بيولوجيكالز . 14 فبراير 2024. تم الاطلاع عليه بتاريخ 14 فبراير 2024 .
  18. ↑ إيرهاردت د (ديسمبر 2003). "تقنية البروتين الفلوري الأخضر لتصوير الخلايا الحية" . الرأي الحالي في بيولوجيا النبات . 6 (6): 622-628 . Bibcode : 2003COPB....6..622E . doi : 10.1016/j.pbi.2003.09.014 . PMID 14611963 . 
  19. ↑ تشالفي م (أكتوبر 1995). "البروتين الفلوري الأخضر". الكيمياء الضوئية والبيولوجيا الضوئية . 62 (4): 651-656 . doi : 10.1111 / j.1751-1097.1995.tb08712.x . PMID 7480149. S2CID 3944607 .  
  20. ^ يانغ ك، شو تي، لين سي، يانغ زي، ليو إتش، يوان إف (2025/09/01). "يمكن التخلص بشكل فعال من الخلفية غير المحددة في تلطيخ الجلوبيولين المناعي G باستخدام التسخين أو مثبط الكاتلاز" . اكتا هيستوتشيميكا . 127 (3) 152269. دوى : 10.1016/j.actis.2025.152269 . ISSN 0065-1281 . 
  21. ↑ غريم جيه بي، إنجلش بي بي، تشين جيه، سلوتر جيه بي، تشانغ زد، ريفياكين إيه، باتيل آر، ماكلين جيه جيه، نورمانو دي، سينغر آر إتش، ليونيه تي، لافيس إل دي (مارس 2015). "طريقة عامة لتحسين الفلوروفورات المستخدمة في مجهر الخلايا الحية والجزيئات المفردة" . مجلة نيتشر ميثودز . 12 (3): 244-250 . doi : 10.1038/nmeth.3256 . ISSN 1548-7091 . PMC 4344395. PMID 25599551 .   
  22. ↑ هوانغ ب، بيتس م، تشوانغ إكس (2009-06-02). " المجهر الفلوري فائق الدقة" . المراجعة السنوية للكيمياء الحيوية . 78 : 993-1016 . doi : 10.1146/annurev.biochem.77.061906.092014 . PMC 2835776. PMID 19489737 .  
  23. ↑ ليونغ، ب. أو.، وتشو، ك. س. (2011-09-01). "مراجعة لمجهر التألق فائق الدقة في علم الأحياء" . التحليل الطيفي التطبيقي . 65 (9): 967-980 . Bibcode : 2011ApSpe..65..967L . doi : 10.1366/11-06398 . PMID: 21929850. S2CID : 5545465 .