تخليق الجينات الاصطناعية

📅 آخر تحديث: ٣ أغسطس ٢٠٢٦
✍️ نُشر في: ٣ أغسطس ٢٠٢٦
📷 يحتوي على 8 صور
الموسوعة الحرة

يشير التخليق الجيني الاصطناعي ، أو التخليق الجيني ببساطة ، إلى مجموعة من الطرق المستخدمة في علم الأحياء الاصطناعي لبناء وتجميع الجينات من النيوكليوتيدات الجديدة . على عكس تخليق الحمض النووي في الخلايا الحية، لا يتطلب التخليق الجيني الاصطناعي الحمض النووي القالب، مما يسمح تقريبًا بتخليق أي تسلسل DNA في المختبر. يتكون من خطوتين رئيسيتين، الأولى هي تخليق الحمض النووي في الطور الصلب ، والمعروف أحيانًا باسم طباعة الحمض النووي . [1] ينتج عن هذا شظايا أوليجونوكليوتيد تكون عمومًا أقل من 200 زوج قاعدي. تتضمن الخطوة الثانية بعد ذلك ربط شظايا الأوليجونوكليوتيد هذه باستخدام طرق تجميع الحمض النووي المختلفة. نظرًا لأن التخليق الجيني الاصطناعي لا يتطلب الحمض النووي القالب، فمن الممكن نظريًا صنع جزيء DNA اصطناعي تمامًا بدون حدود لتسلسل النوكليوتيدات أو حجمها.

أثبت هار جوبيند كورانا وزملاؤه تخليق أول جين كامل، وهو الحمض النووي الريبوزي الناقل للخميرة ، في عام 1972. [2] وتم إجراء تخليق أول جينات ترميز الببتيد والبروتين في مختبرات هربرت بوير وألكسندر ماركهام على التوالي. [3] [4] وفي الآونة الأخيرة، تم تطوير طرق تخليق الجينات الاصطناعية التي ستسمح بتجميع الكروموسومات والجينومات بالكامل. تم تخليق أول كروموسوم خميرة اصطناعي في عام 2014، كما تم تخليق كروموسومات بكتيرية وظيفية كاملة . [5] بالإضافة إلى ذلك، يمكن أن يستفيد تخليق الجينات الاصطناعية في المستقبل من أزواج قواعد نوكليوبية جديدة (أزواج قواعد غير طبيعية). [6] [7] [8]

الطرق القياسية لتخليق الحمض النووي

تخليق الأوليجونوكليوتيدات

يتم تصنيع الأوليجونوكليوتيدات كيميائيًا باستخدام كتل بناء تسمى فوسفوراميديتات النوكليوسيد . يمكن أن تكون هذه نوكليوسيدات طبيعية أو معدلة تحتوي على مجموعات حماية لمنع الأمينات ومجموعات الهيدروكسيل ومجموعات الفوسفات من التفاعل بشكل غير صحيح. تتم إضافة فوسفوراميديت واحد في كل مرة، ويتم إزالة الحماية من مجموعة الهيدروكسيل 5' وإضافة قاعدة جديدة وهكذا. تنمو السلسلة في الاتجاه من 3' إلى 5'، وهو الاتجاه المعاكس نسبيًا للتخليق الحيوي. في النهاية، تتم إزالة جميع المجموعات الواقية. ومع ذلك، نظرًا لكونها عملية كيميائية، تحدث العديد من التفاعلات غير الصحيحة مما يؤدي إلى بعض المنتجات المعيبة. كلما طالت تسلسل الأوليجونوكليوتيد الذي يتم تصنيعه، زاد عدد العيوب، وبالتالي فإن هذه العملية عملية فقط لإنتاج تسلسلات قصيرة من النوكليوتيدات . الحد العملي الحالي هو حوالي 200 زوج قاعدي ( أزواج قواعد ) لأوليجونوكليوتيد بجودة كافية لاستخدامه مباشرة في تطبيق بيولوجي. يمكن استخدام HPLC لعزل المنتجات بالتسلسل الصحيح. وفي الوقت نفسه، يمكن تصنيع عدد كبير من الأوليغوس بالتوازي على شرائح الجينات . وللحصول على أداء مثالي في إجراءات تصنيع الجينات اللاحقة، يجب تحضيرها بشكل فردي وعلى نطاقات أكبر.

اتصال الأوليجونوكليوتيدات على أساس التلدين

عادةً ما يتم تصنيع مجموعة من الأوليجونوكليوتيدات المصممة بشكل فردي على أجهزة تخليق الطور الصلب الآلية، ثم يتم تنقيتها وتوصيلها عن طريق التلدين المحدد وتفاعلات الربط القياسية أو تفاعلات البوليميراز . لتحسين خصوصية التلدين الأوليجونوكليوتيد، تعتمد خطوة التخليق على مجموعة من إنزيمات رباط الحمض النووي والبوليميراز المستقرة حراريًا . حتى الآن، تم وصف العديد من طرق تخليق الجينات، مثل ربط الأوليجونوكليوتيدات المتداخلة الفوسفورية، [ 2] [3] وطريقة Fok I [4] وشكل معدّل من تفاعل سلسلة الرباط لتخليق الجينات. بالإضافة إلى ذلك، تم وصف العديد من طرق تجميع تفاعل البوليميراز المتسلسل . [9] وعادةً ما تستخدم الأوليجونوكليوتيدات بطول 40-50 نوكليوتيدًا تتداخل مع بعضها البعض. تم تصميم هذه الأوليجونوكليوتيدات لتغطية معظم تسلسل كلا السلسلتين، ويتم إنشاء الجزيء كامل الطول تدريجيًا عن طريق تفاعل البوليميراز المتسلسل للامتداد المتداخل (OE)، [9] أو تفاعل البوليميراز المتسلسل المتوازن حراريًا من الداخل إلى الخارج (TBIO) [10] أو الطرق المشتركة. [11] تتراوح أحجام الجينات المصنعة بشكل شائع من 600 إلى 1200 زوج أساسي على الرغم من أن جينات أطول بكثير تم تصنيعها عن طريق ربط أجزاء مجمعة مسبقًا يقل حجمها عن 1000 زوج أساسي. في نطاق الحجم هذا، من الضروري اختبار العديد من المستنسخات المرشحة لتأكيد تسلسل الجين الاصطناعي المستنسخ من خلال طرق التسلسل الآلي.

القيود

وعلاوة على ذلك، ولأن تجميع منتج الجين كامل الطول يعتمد على المحاذاة الفعّالة والمحددة للأليغونوكليوتيدات الطويلة المفردة، فإن المعايير الحاسمة لنجاح التوليف تشمل مناطق تسلسل ممتدة تتألف من هياكل ثانوية ناجمة عن تكرارات مقلوبة، أو محتوى GC مرتفع أو منخفض بشكل غير عادي، أو هياكل متكررة. وعادةً لا يمكن توليف هذه الأجزاء من جين معين إلا من خلال تقسيم الإجراء إلى عدة خطوات متتالية والتجميع النهائي لتسلسلات فرعية أقصر، مما يؤدي بدوره إلى زيادة كبيرة في الوقت والعمالة اللازمة لإنتاجه. وتعتمد نتيجة تجربة توليف الجينات بشكل كبير على جودة الأوليجونوكليوتيدات المستخدمة. وبالنسبة لبروتوكولات توليف الجينات القائمة على التلدين، فإن جودة المنتج تعتمد بشكل مباشر وأسي على صحة الأوليجونوكليوتيدات المستخدمة. وبدلاً من ذلك، بعد إجراء توليف الجينات باستخدام الأوليجونوكليوتيدات ذات الجودة المنخفضة، يجب بذل المزيد من الجهد في ضمان الجودة اللاحقة أثناء تحليل الاستنساخ، والذي يتم عادةً من خلال إجراءات الاستنساخ والتسلسل القياسية التي تستغرق وقتًا طويلاً. هناك مشكلة أخرى مرتبطة بجميع طرق تخليق الجينات الحالية وهي ارتفاع معدل أخطاء التسلسل بسبب استخدام الأوليجونوكليوتيدات المصنعة كيميائيًا. يزداد معدل الخطأ مع الأوليجونوكليوتيدات الأطول، ونتيجة لذلك تنخفض نسبة المنتج الصحيح بشكل كبير مع استخدام المزيد من الأوليجونوكليوتيدات. يمكن حل مشكلة الطفرة باستخدام الأوليجونوكليوتيدات الأقصر لتجميع الجين. ومع ذلك، تتطلب جميع طرق التجميع القائمة على التلدين خلط البادئات معًا في أنبوب واحد. في هذه الحالة، لا تسمح التداخلات الأقصر دائمًا بالتلدين الدقيق والمحدد للبادئات التكميلية، مما يؤدي إلى تثبيط تكوين المنتج بطول كامل. يعد التصميم اليدوي للأوليجونوكليوتيدات إجراءً شاقًا ولا يضمن التوليف الناجح للجين المطلوب. للحصول على الأداء الأمثل لجميع الطرق القائمة على التلدين تقريبًا، يُفترض أن تكون درجات حرارة ذوبان المناطق المتداخلة متشابهة لجميع الأوليجونوكليوتيدات. يجب إجراء تحسين البادئ اللازم باستخدام برامج تصميم الأوليجونوكليوتيدات المتخصصة. حتى الآن تم تقديم العديد من الحلول لتصميم البادئ الآلي لتوليف الجينات. [12] [13] [14]

إجراءات تصحيح الأخطاء

للتغلب على المشاكل المرتبطة بجودة الأوليجونوكليوتيدات، تم تطوير العديد من الاستراتيجيات المعقدة، باستخدام إما الأوليجونوكليوتيدات الصيد المعدة بشكل منفصل، [15] أو إنزيمات ربط عدم التطابق من عائلة mutS [16] أو نوكليازات نهائية محددة من البكتيريا أو العاثيات. [17] ومع ذلك، فإن كل هذه الاستراتيجيات تزيد من الوقت والتكاليف اللازمة لتخليق الجينات بناءً على التلدين الأوليجونوكليوتيدات المصنعة كيميائيًا.

كما تم استخدام التسلسل المتوازي الضخم كأداة لفحص مكتبات الأوليجونوكليوتيدات المعقدة وتمكين استرجاع الجزيئات الدقيقة. في أحد الأساليب، يتم تسلسل الأوليجونوكليوتيدات على منصة تسلسل البايرو 454 ويقوم نظام آلي بتصوير واختيار حبات فردية تتوافق مع التسلسل الدقيق. [18] في نهج آخر، يتم تعديل مكتبة الأوليجونوكليوتيد المعقدة بعلامات جانبية فريدة قبل التسلسل المتوازي الضخم. ثم تمكن البادئات الموجهة بالعلامات من استرجاع الجزيئات ذات التسلسلات المرغوبة عن طريق تفاعل البوليميراز المتسلسل عن طريق الاتصال الهاتفي. [19]

وعلى نحو متزايد، يتم ترتيب الجينات في مجموعات تتضمن جينات ذات صلة وظيفية أو متغيرات تسلسلية متعددة على جين واحد. ويتم تحسين جميع البروتينات العلاجية قيد التطوير تقريبًا، مثل الأجسام المضادة وحيدة النسيلة، من خلال اختبار العديد من المتغيرات الجينية لتحسين الوظيفة أو التعبير.

أزواج القواعد غير الطبيعية

في حين أن التخليق التقليدي للأحماض النووية يستخدم فقط 4 أزواج قواعد - الأدينين، الثايمين، الجوانين والسيتوزين، فإن التخليق الأوليغونوكليوتيد في المستقبل قد يتضمن استخدام أزواج قواعد غير طبيعية، وهي قواعد نيتروجينية مصممة ومصنوعة بشكل مصطنع ولا تحدث في الطبيعة.

في عام 2012، نشر مجموعة من العلماء الأمريكيين بقيادة فلويد رومسبيرج، عالم الأحياء الكيميائية في معهد سكريبس للأبحاث في سان دييجو، كاليفورنيا، أن فريقه صمم زوجًا قاعديًا غير طبيعي (UBP). تم تسمية النوكليوتيدات الاصطناعية الجديدة أو زوج القواعد غير الطبيعي (UBP) باسم d5SICS و dNaM . من الناحية الفنية، تتميز هذه النوكليوتيدات الاصطناعية التي تحمل قواعد نوكليوتيدات كارهة للماء بحلقتين عطريتين مندمجتين تشكلان مركبًا أو زوجًا قاعديًا (d5SICS–dNaM) في الحمض النووي. في عام 2014، أفاد نفس الفريق من معهد سكريبس للأبحاث أنهم قاموا بتصنيع امتداد دائري من الحمض النووي يُعرف باسم البلازميد يحتوي على أزواج قواعد TA وCG طبيعية جنبًا إلى جنب مع أفضل زوج قواعد غير طبيعي (UBP) صممه مختبر رومسبيرج وأدخله في خلايا بكتيريا الإشريكية القولونية الشائعة التي نجحت في تكرار أزواج القواعد غير الطبيعية عبر أجيال متعددة. هذا هو أول مثال معروف لكائن حي ينقل شفرة وراثية موسعة إلى الأجيال اللاحقة. وقد تحقق ذلك جزئيًا من خلال إضافة جين طحلب داعم يعبر عن ناقل ثلاثي الفوسفات النوكليوتيدي الذي يستورد بكفاءة ثلاثي الفوسفات لكل من d5SICSTP و dNaMTP إلى بكتيريا E. coli . بعد ذلك، تستخدم مسارات التكاثر البكتيرية الطبيعية هذه العناصر لتكرار البلازميد المحتوي على d5SICS–dNaM بدقة.

إن الدمج الناجح لزوج قاعدي ثالث يمثل تقدمًا كبيرًا نحو هدف التوسع بشكل كبير في عدد الأحماض الأمينية التي يمكن ترميزها بواسطة الحمض النووي، من 20 حمضًا أمينيًا موجودًا إلى 172 حمضًا أمينيًا ممكنًا نظريًا، وبالتالي توسيع إمكانات الكائنات الحية لإنتاج بروتينات جديدة . [20] في المستقبل، يمكن تصنيع هذه الأزواج القاعدية غير الطبيعية ودمجها في الأوليجونوكليوتيدات عبر طرق طباعة الحمض النووي.

تجميع الحمض النووي

وبالتالي يمكن استخدام طباعة الحمض النووي لإنتاج أجزاء الحمض النووي، والتي تُعرَّف بأنها تسلسلات من الحمض النووي تشفر وظيفة بيولوجية محددة (على سبيل المثال، المحفزات أو تسلسلات تنظيم النسخ أو إطارات القراءة المفتوحة ). [21] ومع ذلك، نظرًا لأن تخليق الأوليجونوكليوتيدات لا يمكنه عادةً إنتاج تسلسلات الأوليجونوكليوتيدات أطول من بضع مئات من أزواج القواعد بدقة، فيجب استخدام طرق تجميع الحمض النووي لتجميع هذه الأجزاء معًا لإنشاء جينات وظيفية أو دوائر متعددة الجينات أو حتى كروموسومات أو جينومات اصطناعية كاملة. تحدد بعض تقنيات تجميع الحمض النووي بروتوكولات فقط لربط أجزاء الحمض النووي، بينما تحدد تقنيات أخرى أيضًا قواعد تنسيق أجزاء الحمض النووي المتوافقة معها. يمكن توسيع نطاق هذه العمليات لتمكين تجميع الكروموسومات أو الجينومات بالكامل. في السنوات الأخيرة، كان هناك انتشار في عدد معايير تجميع الحمض النووي المختلفة مع تطوير 14 معيار تجميع مختلف اعتبارًا من عام 2015، ولكل منها إيجابياتها وسلبياتها. [22] بشكل عام، ساعد تطوير معايير تجميع الحمض النووي بشكل كبير في تسهيل سير عمل البيولوجيا الاصطناعية، وساعد في تبادل المواد بين مجموعات البحث، كما سمح بإنشاء أجزاء الحمض النووي المعيارية والقابلة لإعادة الاستخدام. [22]

يمكن تصنيف طرق تجميع الحمض النووي المختلفة إلى ثلاث فئات رئيسية - التجميع بوساطة النوكلياز، وإعادة التركيب في موقع محدد، والتجميع القائم على التداخل الطويل. [22] كل مجموعة من الطرق لها خصائصها المميزة ومزاياها وقيودها الخاصة.

التجميع بوساطة النوكلياز

إن النوكليازات هي إنزيمات تتعرف على أجزاء الحمض النووي وتقطعها ويمكن استخدامها لتوجيه تجميع الحمض النووي. ومن بين الأنواع المختلفة من إنزيمات القطع، فإن إنزيمات القطع من النوع الثاني هي الأكثر شيوعًا واستخدامًا لأن مواقع قطعها تقع بالقرب من أو داخل مواقع التعرف عليها. وبالتالي، فإن طرق التجميع التي تتوسطها النوكليازات تستفيد من هذه الخاصية لتحديد أجزاء الحمض النووي وبروتوكولات التجميع.

الطوب الحيوي

تجميع BBF RFC 10 لجزئين متوافقين مع BioBricks. معالجة الجزء العلوي باستخدام EcoRI وSpeI، والجزء السفلي باستخدام EcoRI وXbaI يسمح بالتجميع بالتسلسل المطلوب. نظرًا لأن SpeI وXbaI ينتجان نتوءات تكميلية، فإنهما يساعدان في ربط قطعتي DNA معًا، مما ينتج عنه تسلسل ندبة. يتم الاحتفاظ بجميع مواقع التقييد الأصلية في البناء النهائي، والتي يمكن استخدامها بعد ذلك لمزيد من تفاعلات BioBricks.

تم وصف معيار تجميع BioBricks وتقديمه بواسطة Tom Knight في عام 2003 وتم تحديثه باستمرار منذ ذلك الحين. [23] حاليًا، يعد معيار BioBricks الأكثر استخدامًا هو معيار التجميع 10، أو BBF RFC 10. يحدد BioBricks تسلسلات البادئة واللاحقة المطلوبة لجزء DNA ليكون متوافقًا مع طريقة تجميع BioBricks، مما يسمح بربط جميع أجزاء DNA الموجودة في تنسيق BioBricks.

تحتوي البادئة على مواقع التقييد لـ EcoRI و NotI و XBaI، بينما تحتوي اللاحقة على مواقع التقييد SpeI و NotI و PstI. خارج مناطق البادئة واللاحقة، يجب ألا يحتوي جزء الحمض النووي على مواقع التقييد هذه. لربط جزأين من BioBrick معًا، يتم هضم أحد البلازميدات باستخدام EcoRI و SpeI بينما يتم هضم البلازميد الثاني باستخدام EcoRI و XbaI. تكون نتوءات EcoRI مكملة وبالتالي ستلتحم معًا، بينما تنتج SpeI و XbaI أيضًا نتوءات مكملة يمكن أيضًا ربطها معًا. نظرًا لأن البلازميد الناتج يحتوي على تسلسلات البادئة واللاحقة الأصلية، فيمكن استخدامه للانضمام إلى المزيد من أجزاء BioBricks. [24] وبسبب هذه الخاصية، يُقال إن معيار تجميع BioBricks هو أيدمبوتنت بطبيعته. ومع ذلك، سيكون هناك أيضًا تسلسل "ندبة" (إما TACTAG أو TACTAGAG) يتشكل بين BioBricks المندمجين. يمنع هذا استخدام BioBricks لإنشاء بروتينات الاندماج، حيث يشفر تسلسل الندبة 6bp لتيروزين وكودون توقف، مما يتسبب في إنهاء الترجمة بعد التعبير عن المجال الأول، بينما يتسبب تسلسل الندبة 8bp في حدوث إزاحة إطارية ، مما يمنع القراءة المستمرة للرموز. لتقديم تسلسلات ندبة بديلة تعطي على سبيل المثال ندبة 6bp، أو تسلسلات ندبة لا تحتوي على كودونات توقف، تم تصميم معايير تجميع أخرى مثل BB-2 Assembly وBglBricks Assembly وSilver Assembly وFreiburg Assembly. [25] [26] [27] [28]

في حين تم وصف أسهل طريقة لتجميع أجزاء BioBrick أعلاه، إلا أن هناك أيضًا العديد من طرق التجميع الأخرى المستخدمة بشكل شائع والتي توفر العديد من المزايا مقارنة بالتجميع القياسي. يسمح تجميع 3 المضادات الحيوية (3A) باختيار التجميع الصحيح من خلال اختيار المضادات الحيوية، بينما يسعى تجميع الإدخال المضخم إلى التغلب على كفاءة التحويل المنخفضة التي شوهدت في تجميع 3A. [29] [30]

كما عمل معيار تجميع BioBrick كمصدر إلهام لاستخدام أنواع أخرى من نوكليازات النهاية لتجميع الحمض النووي. على سبيل المثال، يستخدم كل من معيار iBrick ومعايير تجميع المتجهات HomeRun نوكليازات النهاية الموجهة بدلاً من إنزيمات القيد من النوع الثاني. [31] [32]

تجميع نوكلياز التقييد من النوع الثاني

تستخدم بعض طرق التجميع أيضًا نوكليازات القيد من النوع الثاني. وتختلف هذه عن نوكليازات النوع الثاني الأخرى لأنها تقطع عدة أزواج قاعدية بعيدًا عن موقع التعرف. ونتيجة لذلك، يمكن تعديل تسلسل التجاوز لاحتواء التسلسل المطلوب. وهذا يوفر لطرق التجميع من النوع الثاني ميزتين - فهو يتيح التجميع "بدون ندبة"، ويسمح بالتجميع في وعاء واحد ومتعدد الأجزاء. تشمل طرق التجميع التي تستخدم نوكليازات النوع الثاني نوكلياز Golden Gate والمتغيرات المرتبطة به.

استنساخ البوابة الذهبية
يمكن توجيه تسلسل أجزاء الحمض النووي لتجميع البوابة الذهبية من خلال تحديد نتوءات تكميلية فريدة لكل جزء. وبالتالي، لتجميع الجين 1 حسب ترتيب القطعة A وB وC، فإن النتوء 3' للقطعة A مكمل للنتوء 5' للقطعة B، وعلى نحو مماثل للقطعة B والقطعة C. بالنسبة للبلازميد الوجهة، فإن العلامة القابلة للاختيار محاطة بمواقع تقييد BsaI المقطوعة للخارج. يؤدي هذا إلى استئصال العلامة القابلة للاختيار، مما يسمح بإدراج البناء النهائي. يتم استخدام رباط T4 لربط القطع معًا وإلى البلازميد الوجهة.

تم تعريف بروتوكول تجميع البوابة الذهبية بواسطة إنجلر وآخرون عام 2008 لتحديد طريقة تجميع الحمض النووي التي من شأنها أن تعطي بنية نهائية بدون تسلسل ندبة، مع افتقارها أيضًا إلى مواقع التقييد الأصلية. يسمح هذا بالتعبير عن البروتين دون احتواء تسلسلات بروتينية غير مرغوب فيها والتي يمكن أن تؤثر سلبًا على طي البروتين أو التعبير عنه. باستخدام إنزيم التقييد BsaI الذي ينتج 4 أزواج قاعدية، يمكن استخدام ما يصل إلى 240 تسلسلًا فريدًا غير متناظر للتجميع. [33]

تصميم البلازميد وتجميعه

في استنساخ البوابة الذهبية، يتم وضع كل قطعة DNA المراد تجميعها في بلازميد، محاطة بمواقع تقييد BsaI المواجهة للداخل والتي تحتوي على تسلسلات التداخل المبرمجة. لكل قطعة DNA، يكون تسلسل التداخل 3' مكملًا للتداخل 5' لقطعة DNA التالية. بالنسبة للقطعة الأولى، يكون التداخل 5' مكملًا للتداخل 5' للبلازميد الوجهة، بينما يكون التداخل 3' للقطعة الأخيرة مكملًا للتداخل 3' للبلازميد الوجهة. يسمح هذا التصميم بتجميع جميع قطع DNA في تفاعل وعاء واحد (حيث يتم خلط جميع المتفاعلات معًا)، مع ترتيب جميع القطع بالتسلسل الصحيح. يتم اختيار التركيبات المجمعة بنجاح من خلال الكشف عن فقدان وظيفة شريط الفحص الذي كان في الأصل في البلازميد الوجهة. [33]

موكلو والضفيرة الذهبية

تسمح مجموعة Golden Gate الأصلية بإنشاء بنية واحدة فقط في متجه الوجهة. لتمكين استخدام هذه البنية في تفاعل لاحق كمتجه دخول، تم تصميم معايير MoClo وGolden Braid. [34]

يتضمن معيار MoClo تحديد طبقات متعددة من تجميع الحمض النووي:

  • معايير التجميع MoClo وGolden Braid هي مشتقات من معيار التجميع Golden Gate الأصلي.
    الطبقة 1: تجميع الطبقة 1 هو تجميع البوابة الذهبية القياسي، ويتم تجميع الجينات من أجزاء مكوناتها (أجزاء الحمض النووي التي تشفر العناصر الجينية مثل UTRs أو المحفزات أو مواقع ربط الريبوسوم أو تسلسلات النهاية ). يحيط بموقع إدخال متجهات الوجهة من الطبقة 1 زوج من مواقع تقييد BpiI التي تقطع إلى الداخل. يسمح هذا باستخدام هذه البلازميدات كمتجهات دخول لمتجهات الوجهة من الطبقة الثانية.
  • المستوى 2: يتضمن التجميع في المستوى 2 تجميع الجينات المجمعة في التجميع في المستوى 1 في هياكل متعددة الجينات. إذا كانت هناك حاجة إلى تجميع في مستوى أعلى، فيمكن إضافة مواقع تقييد BsaI المقطوعة للداخل لتحيط بمواقع الإدخال. يمكن بعد ذلك استخدام هذه المتجهات كمتجهات دخول للهياكل ذات المستوى الأعلى.

يتناوب كل مستوى تجميعي على استخدام مواقع تقييد BsaI وBpiI لتقليل عدد المواقع المحظورة، ويتم تحقيق التجميع المتسلسل لكل مستوى باتباع تصميم بلازميد Golden Gate. بشكل عام، يسمح معيار MoClo بتجميع بنية تحتوي على وحدات نسخ متعددة، يتم تجميعها جميعًا من أجزاء DNA مختلفة، من خلال سلسلة من تفاعلات Golden Gate أحادية الوعاء. ومع ذلك، فإن أحد عيوب معيار MoClo هو أنه يتطلب استخدام "أجزاء وهمية" بدون وظيفة بيولوجية، إذا كان البناء النهائي يتطلب أقل من أربعة أجزاء مكونة. [35] من ناحية أخرى، قدم معيار Golden Braid معيار تجميع Golden Gate ثنائيًا.

يستخدم معيار Golden Braid نفس التجميع المتدرج مثل MoClo، لكن كل طبقة تتضمن فقط تجميع قطعتين من الحمض النووي، أي نهج ثنائي. وبالتالي، في كل طبقة، يتم استنساخ أزواج الجينات في قطعة وجهة بالتسلسل المطلوب، ثم يتم تجميعها بعد ذلك اثنتين في كل مرة في طبقات متتالية. ومثل MoClo، يتناوب معيار Golden Braid بين إنزيمات القيد BsaI وBpiI بين كل طبقة.

لقد سمح تطوير طرق التجميع في Golden Gate ومتغيراتها للباحثين بتصميم مجموعات أدوات لتسريع سير عمل علم الأحياء الاصطناعي. على سبيل المثال، تم تطوير EcoFlex كمجموعة أدوات لـ E. Coli تستخدم معيار MoClo لأجزاء الحمض النووي الخاصة بها، في حين تم أيضًا تطوير مجموعة أدوات مماثلة لهندسة الطحالب الدقيقة Chlamydomonas reinhardtii . [36] [37]

إعادة التركيب حسب الموقع

ملخص لتقنيات استنساخ البوابة الرئيسية.

تستخدم إعادة التركيب الخاصة بالموقع إنزيمات التكامل البكتيري بدلاً من إنزيمات القيد، مما يلغي الحاجة إلى وجود مواقع القيد في شظايا الحمض النووي. بدلاً من ذلك، تستخدم الإنزيمات التكاملية مواقع التعلق الفريدة (att)، وتحفز إعادة ترتيب الحمض النووي بين الشظية المستهدفة والناقل الوجهة. تم اختراع نظام استنساخ Invitrogen Gateway في أواخر التسعينيات ويستخدم مزيجين من الإنزيمات الخاصة، BP clonase وLR clonase. يحفز مزيج BP clonase إعادة التركيب بين مواقع attB وattP، مما يؤدي إلى توليد مواقع attL وattR هجينة، بينما يحفز مزيج LR clonase إعادة تركيب مواقع attL وattR لإعطاء مواقع attB وattP. نظرًا لأن كل مزيج إنزيم يتعرف فقط على مواقع att محددة، فإن إعادة التركيب تكون محددة للغاية ويمكن تجميع الشظايا بالتسلسل المطلوب. [38]

تصميم وتجميع المتجهات

نظرًا لأن استنساخ البوابة هو تقنية خاصة، فيجب إجراء جميع تفاعلات البوابة باستخدام مجموعة البوابة التي يوفرها المصنع. يمكن تلخيص التفاعل في خطوتين. تتضمن الخطوة الأولى تجميع استنساخات الدخول التي تحتوي على جزء الحمض النووي المطلوب، بينما تتضمن الخطوة الثانية إدخال هذا الجزء المطلوب في استنساخ الوجهة.

  1. يجب أن يتم إنشاء استنساخات الدخول باستخدام متجهات "المانح" المقدمة التي تحتوي على شريط بوابة محاط بمواقع attP. يحتوي شريط البوابة على جين انتحار بكتيري (مثل ccdB ) والذي سيسمح بالبقاء واختيار استنساخات الدخول المعاد تركيبها بنجاح. تتم إضافة زوج من مواقع attB لتحيط بقطعة الحمض النووي المطلوبة، وهذا سيسمح بإعادة التركيب مع مواقع attP عند إضافة مزيج استنساخ BP. يتم إنتاج استنساخات الدخول، ويحيط بقطعة الاهتمام مواقع attL.
  2. يأتي ناقل الوجهة أيضًا مع شريط بوابة، ولكنه محاط بدلاً من ذلك بزوج من مواقع attR. سيسمح خلط هذا البلازميد الوجهة مع استنساخات الدخول ومزيج استنساخ LR بحدوث إعادة التركيب بين مواقع attR وattL. يتم إنتاج استنساخ الوجهة، مع إدخال القطعة المطلوبة بنجاح. يتم إدخال الجين القاتل في الناقل الأصلي، وتموت البكتيريا المحولة بهذا البلازميد. وبالتالي يمكن اختيار الناقل المطلوب بسهولة.

كانت الإصدارات الأولى من طريقة استنساخ البوابة تسمح باستخدام استنساخ دخول واحد فقط لكل استنساخ وجهة تم إنتاجه. ومع ذلك، كشف المزيد من البحث عن إمكانية إنشاء أربعة تسلسلات أخرى متعامدة من تسلسلات att، مما يسمح بتجميع ما يصل إلى أربعة أجزاء مختلفة من الحمض النووي، وتُعرف هذه العملية الآن باسم تقنية البوابة متعددة المواقع. [39]

بالإضافة إلى استنساخ البوابة، تم تطوير طرق غير تجارية تستخدم إنزيمات تكامل أخرى. على سبيل المثال، تستخدم طريقة التجميع التجميعي لإنزيم سيرين إنتيغريز (SIRA) إنتيغريز ϕC31، بينما تستخدم طريقة التجميع التجميعي المترادف القائم على إعادة التركيب في الموقع (SSRTA) إنتيغريز φBT1 من Streptomyces phage. [40] [41] تعتمد طرق أخرى، مثل نظام تجميع المتجهات HomeRun (HVAS)، على نظام استنساخ البوابة وتدمج أيضًا نوكليازات توجيهية لتصميم بروتوكول يمكن أن يدعم بشكل محتمل التركيب الصناعي لهياكل الحمض النووي الاصطناعية. [31]

تتطلب طرق التجميع القائمة على التداخل الطويل وجود مناطق تداخل طويلة على أجزاء الحمض النووي المراد تجميعها. وهذا يتيح بناء نتوءات تكميلية يمكن أن تتفاعل من خلال اقتران القواعد التكميلية. توجد مجموعة متنوعة من الطرق، مثل تجميع جيبسون، وCPEC، وMODAL التي تستخدم هذا المفهوم لتجميع الحمض النووي.

تجميع قائم على التداخل الطويل

تم تطوير مجموعة متنوعة من طرق التجميع القائمة على التداخل الطويل في السنوات الأخيرة. تم تطوير إحدى الطرق الأكثر استخدامًا، طريقة تجميع جيبسون، في عام 2009، وتوفر طريقة تجميع الحمض النووي أحادية الوعاء والتي لا تتطلب استخدام إنزيمات القيد أو الإنزيمات المتكاملة. [42] تشمل طرق التجميع الأخرى القائمة على التداخل الاستنساخ الدائري لتمديد البوليميراز (CPEC)، والاستنساخ المستقل عن التسلسل والربط (SLIC) ومستخلص الاستنساخ بالربط السلس (SLiCE). [43] [44] [45] وعلى الرغم من وجود العديد من طرق تجميع التداخل، إلا أن طريقة تجميع جيبسون لا تزال الأكثر شيوعًا. [46] بالإضافة إلى الطرق المذكورة أعلاه، بنى باحثون آخرون على المفاهيم المستخدمة في تجميع جيبسون وطرق التجميع الأخرى لتطوير استراتيجيات تجميع جديدة مثل استراتيجية التجميع الموجه بالتداخل المعياري باستخدام الروابط (MODAL)، أو طريقة معيار تجميع الأجزاء الحيوية للاستنساخ الأيدبوت (BASIC). [47] [48]

تجميع جيبسون

طريقة تجميع جيبسون هي طريقة تجميع DNA مباشرة نسبيًا، ولا تتطلب سوى عدد قليل من الكواشف الإضافية: إكسونوكلياز 5'T5 ، وبوليميراز DNA Phusion ، ورابط DNA Taq . يتم تصنيع شظايا DNA المراد تجميعها بحيث يكون لها نهايات متداخلة 5' و3' بالترتيب الذي سيتم تجميعها به. يتم خلط هذه الكواشف مع شظايا DNA المراد تجميعها عند 50 درجة مئوية وتحدث التفاعلات التالية:

  1. تقوم إكسونوكلياز T5 بمضغ الحمض النووي من الطرف 5' لكل جزء، مما يكشف عن 3' نتوءات على كل جزء من الحمض النووي.
  2. تترابط النتوءات التكميلية على أجزاء الحمض النووي المجاورة من خلال الاقتران القاعدي التكميلي.
  3. يملأ بوليميراز الحمض النووي Phusion أي فجوات حيث تتجمع الأجزاء.
  4. تعمل رباطات Taq DNA على إصلاح الشقوق في كلا سلسلتي DNA.

نظرًا لأن إكسونوكلياز T5 غير قابل للتغير بالحرارة، فإنه يتم تعطيله عند 50 درجة مئوية بعد الخطوة الأولى للمضغ. وبالتالي يكون المنتج مستقرًا، ويتم تجميع الشظايا بالترتيب المطلوب. يمكن لهذا البروتوكول أحادي الوعاء تجميع ما يصل إلى 5 شظايا مختلفة بدقة، في حين أن العديد من المزودين التجاريين لديهم مجموعات لتجميع ما يصل إلى 15 شظية مختلفة بدقة في تفاعل من خطوتين. [49] ومع ذلك، في حين أن بروتوكول تجميع جيبسون سريع ويستخدم عددًا قليلًا نسبيًا من الكواشف، فإنه يتطلب تخليق الحمض النووي حسب الطلب حيث يجب تصميم كل شظية لاحتواء تسلسلات متداخلة مع الشظايا المجاورة وتضخيمها عبر تفاعل البوليميراز المتسلسل. قد يؤثر هذا الاعتماد على تفاعل البوليميراز المتسلسل أيضًا على دقة التفاعل عند استخدام شظايا طويلة أو شظايا ذات محتوى عالٍ من GC أو تسلسلات متكررة. [48]

يوفر معيار MODAL تنسيقًا مشتركًا يسمح بجعل أي جزء من الحمض النووي متوافقًا مع تجميع جيبسون أو طرق تجميع التداخل الأخرى. يخضع جزء الحمض النووي المطلوب لجولتين من تفاعل البوليميراز المتسلسل، أولاً لربط بادئة المحول واللاحقات، ثم لربط تسلسلات الرابط المحددة مسبقًا. بمجرد أن تكون الأجزاء بالتنسيق المطلوب، يمكن تنفيذ طرق التجميع مثل تجميع جيبسون. يتم توجيه ترتيب الأجزاء بواسطة الروابط، أي يتم ربط نفس تسلسل الرابط بالطرف 3' من الجزء العلوي والطرف 5' من الجزء السفلي.

تحدد استراتيجية MODAL تسلسلات تداخل تُعرف باسم "الروابط" لتقليل كمية التخصيص المطلوب القيام به مع كل جزء من الحمض النووي. تم تصميم الروابط باستخدام برنامج R2oDNA Designer وتم تصميم مناطق التداخل بحيث يبلغ طولها 45 زوجًا قاعديًا لتكون متوافقة مع تجميع جيبسون وطرق تجميع التداخل الأخرى. لربط هذه الروابط بالأجزاء المراد تجميعها، يتم إجراء تفاعل البوليميراز المتسلسل باستخدام بادئات خاصة بالأجزاء تحتوي على تسلسلات محول بادئة ولاحقة بطول 15 زوجًا قاعديًا. ثم يتم ربط الروابط بتسلسلات المحول عبر تفاعل تفاعل البوليميراز المتسلسل الثاني. لتحديد موضع شظايا الحمض النووي، سيتم ربط نفس الرابط بلاحقة الجزء العلوي المطلوب وبادئة الشظايا السفلية المطلوبة. بمجرد ربط الروابط، يمكن استخدام تجميع جيبسون أو CPEC أو طرق تجميع التداخل الأخرى لتجميع شظايا الحمض النووي بالترتيب المطلوب.

أساسي

تم تطوير استراتيجية التجميع الأساسية في عام 2015 وسعت إلى معالجة قيود تقنيات التجميع السابقة، ودمج ستة مفاهيم رئيسية منها: الأجزاء القياسية القابلة لإعادة الاستخدام؛ تنسيق الطبقة الواحدة (جميع الأجزاء بنفس التنسيق ويتم تجميعها باستخدام نفس العملية)؛ الاستنساخ الأيدموجرافي؛ تجميع الحمض النووي المتوازي (متعدد الأجزاء)؛ الاستقلال عن الحجم؛ القدرة على الأتمتة. [48]

أجزاء الحمض النووي وتصميم الرابط

تم تصميم أجزاء الحمض النووي واستنساخها في بلازميدات تخزين، مع الجزء المحاط بتسلسل بادئة متكاملة ( i P) ولاحقة متكاملة ( i S). يحتوي تسلسلا i P و i S على مواقع تقييد BsaI متجهة للداخل، والتي تحتوي على نتوءات مكملة لروابط BASIC. [48] كما هو الحال في MODAL، تم تصميم الروابط القياسية السبعة المستخدمة في BASIC باستخدام برنامج R2oDNA Designer، وتم فحصها للتأكد من أنها لا تحتوي على تسلسلات متشابهة مع جينومات الهيكل، وأنها لا تحتوي على تسلسلات غير مرغوب فيها مثل تسلسلات البنية الثانوية أو مواقع التقييد أو مواقع ربط الريبوسوم. يتم تقسيم كل تسلسل رابط إلى نصفين، كل منهما به نتوء 4 bp مكمل لموقع تقييد BsaI، وتسلسل مزدوج السلسلة بطول 12 bp ويشارك في تسلسل تداخل بطول 21 bp مع النصف الآخر. يُعرف النصف الذي يرتبط بجزء الحمض النووي العلوي باسم جزء الرابط اللاحق (مثل L1S) ويُعرف النصف الذي يرتبط بالجزء السفلي باسم جزء الرابط البادئ (مثل L1P). تشكل هذه الروابط الأساس لتجميع أجزاء الحمض النووي معًا.

بالإضافة إلى توجيه ترتيب التجميع، يمكن أيضًا تعديل روابط BASIC القياسية للقيام بوظائف أخرى. للسماح بالتجميع الأيدموبوت، تم تصميم الروابط أيضًا مع إدراج تسلسلات i P و i S إضافية ميثلة لحمايتها من التعرف عليها بواسطة BsaI. يتم فقد هذا الميثلة بعد التحويل وتضاعف البلازميد في الجسم الحي، ويمكن استخراج البلازميدات وتنقيتها واستخدامها لمزيد من التفاعلات.

نظرًا لأن تسلسلات الرابط طويلة نسبيًا (45 زوجًا قاعديًا للرابط القياسي)، فهناك فرصة لدمج تسلسلات DNA الوظيفية لتقليل عدد أجزاء DNA المطلوبة أثناء التجميع. يوفر معيار التجميع BASIC العديد من الروابط المضمنة بـ RBS بقوى مختلفة. وبالمثل لتسهيل بناء البروتينات المندمجة التي تحتوي على مجالات بروتينية متعددة، تم أيضًا تصميم العديد من الروابط المندمجة للسماح بالقراءة الكاملة لبنية DNA. تشفر روابط الاندماج هذه 15 حمضًا أمينيًا من الجلايسين والسرين، وهو ببتيد رابط مثالي للبروتينات المندمجة ذات المجالات المتعددة.

حَشد

هناك ثلاث خطوات رئيسية في تجميع البناء النهائي.

  1. أولاً، يتم استئصال أجزاء الحمض النووي من البلازميد التخزيني، مما يعطي جزءًا من الحمض النووي مع وجود نتوءات BsaI على النهاية 3'و5'.
  2. بعد ذلك، يتم ربط كل جزء رابط بجزء DNA الخاص به عن طريق الحضانة مع رباط DNA T4. سيكون لكل جزء DNA جزء رابط لاحقة وبادئة من رابطين مختلفين لتوجيه ترتيب التجميع. على سبيل المثال، سيكون الجزء الأول في التسلسل به L1P وL2S، بينما سيكون الجزء الثاني به L2P وL3S. يمكن تغيير أجزاء الرابط لتغيير تسلسل التجميع.
  3. أخيرًا، يتم تجميع الأجزاء التي تحتوي على الروابط الملتصقة في بلازميد عن طريق الحضانة عند درجة حرارة 50 درجة مئوية. يتم تجميد النتوءات التي يبلغ طولها 21 زوجًا قاعديًا من الروابط الفوسفاتية والكبريتية ويمكن تحويل التركيب النهائي إلى خلايا بكتيرية للاستنساخ. يتم إصلاح الشقوق ذات السلسلة المفردة في الجسم الحي بعد التحويل، مما ينتج عنه تركيب نهائي مستقر مستنسخ في البلازميدات.

التطبيقات

نظرًا لأن طرق طباعة الحمض النووي وتجميعه سمحت بتقليل تكلفة تخليق الجينات التجارية بشكل تدريجي وأسي على مدار السنوات الماضية، [50] فإن تخليق الجينات الاصطناعي يمثل أداة هندسية قوية ومرنة لإنشاء وتصميم تسلسلات الحمض النووي ووظائف البروتين الجديدة. إلى جانب علم الأحياء الاصطناعي، فإن مجالات البحث المختلفة مثل تلك التي تنطوي على التعبير الجيني غير المتجانس وتطوير اللقاح والعلاج الجيني والهندسة الجزيئية، ستستفيد بشكل كبير من وجود طرق سريعة ورخيصة لتوليف الحمض النووي للترميز للبروتينات والببتيدات. [51] حتى أن الأساليب المستخدمة في طباعة الحمض النووي وتجميعه مكنت من استخدام الحمض النووي كوسيلة لتخزين المعلومات .

تركيب الجينومات البكتيرية

سينثيا ومختبر الميكوبلازما

في 28 يونيو 2007، نشر فريق من معهد جيه كريج فينتر مقالاً في مجلة ساينس إكسبريس ، قالوا فيه إنهم نجحوا في زرع الحمض النووي الطبيعي من بكتيريا الميكوبلازما ميكويدس في خلية الميكوبلازما كابريكولوم ، مما أدى إلى إنشاء بكتيريا تتصرف مثل الميكوبلازما ميكويدس . [52]

في السادس من أكتوبر 2007، أعلن كريج فينتر في مقابلة مع صحيفة الجارديان البريطانية أن نفس الفريق نجح في تصنيع نسخة معدلة من الكروموسوم الفردي لبكتيريا Mycoplasma genitalium بشكل مصطنع. وقد تم تعديل الكروموسوم لإزالة جميع الجينات التي أظهرت الاختبارات التي أجريت على البكتيريا الحية أنها غير ضرورية. والخطوة التالية المخطط لها في مشروع الجينوم البسيط هذا هي زرع الجينوم البسيط المصنّع في خلية بكتيرية مع إزالة الحمض النووي القديم الخاص بها؛ وسوف يطلق على البكتيريا الناتجة اسم Mycoplasma laboratorium . وفي اليوم التالي، أصدرت مجموعة الأخلاقيات الحيوية الكندية، ETC Group، بيانًا من خلال ممثلها، بات موني ، قائلة إن "خلق" فينتر كان "هيكلًا يمكنك بناء أي شيء عليه تقريبًا". ولم يتم زرع الجينوم المصنّع بعد في خلية عاملة. [53]

في 21 مايو 2010، أفادت مجلة ساينس أن مجموعة فينتر نجحت في تصنيع جينوم بكتيريا Mycoplasma mycoides من سجل حاسوبي، وزرعت الجينوم المصنّع في خلية موجودة لبكتيريا Mycoplasma capricolum التي تم إزالة حمضها النووي منها. كانت البكتيريا "المصنّعة" قابلة للحياة، أي قادرة على التكاثر مليارات المرات. كان الفريق قد خطط في الأصل لاستخدام بكتيريا M. genitalium التي كانوا يعملون عليها سابقًا، لكنهم تحولوا إلى M. mycoides لأن البكتيريا الأخيرة تنمو بشكل أسرع بكثير، مما أدى إلى تجارب أسرع. [54] يصفها فينتر بأنها "أول نوع.... يكون والداه حاسوبًا". [55] أطلقت ETC على البكتيريا المتحولة اسم " Synthia ". رفض متحدث باسم فينتر تأكيد أي اختراق في وقت كتابة هذا المقال.

الخميرة الاصطناعية 2.0

كجزء من مشروع الخميرة الاصطناعية 2.0، شاركت مجموعات بحثية مختلفة حول العالم في مشروع لتوليف جينومات الخميرة الاصطناعية، ومن خلال هذه العملية، تحسين جينوم الكائن النموذجي Saccharomyces cerevisiae . [56] طبق مشروع الخميرة 2.0 طرق تجميع الحمض النووي المختلفة التي تمت مناقشتها أعلاه، وفي مارس 2014، كشف جيف بوكي من مركز لانجون الطبي بجامعة نيويورك أن فريقه قد قام بتوليف الكروموسوم الثالث من S. cerevisiae . [57] [58] تضمنت العملية استبدال الجينات في الكروموسوم الأصلي بنسخ اصطناعية ثم تم دمج الكروموسوم الاصطناعي النهائي في خلية الخميرة. تطلب الأمر تصميم وإنشاء 273871 زوجًا أساسيًا من الحمض النووي - أقل من 316667 زوجًا في الكروموسوم الأصلي. في مارس 2017، تم الانتهاء من تركيب 6 من الكروموسومات الستة عشر، ولا يزال تركيب الكروموسومات الأخرى مستمرًا. [59]

انظر أيضا

ملحوظات

  1. ^ شتاين ر (7 مايو 2015). "طباعة الحمض النووي نعمة كبيرة للبحث، ولكن بعضها يثير المخاوف". كل شيء في الحسبان . الإذاعة الوطنية العامة.
  2. ^ ab Khorana HG, Agarwal KL, Büchi H, Caruthers MH, Gupta NK, Kleppe K, et al. (ديسمبر 1972). "دراسات على البولينيوكليوتيدات. 103. التوليف الكامل للجين البنيوي لحمض الريبونوكلييك الناقل للألانين من الخميرة". مجلة البيولوجيا الجزيئية . 72 (2): 209-17. doi :10.1016/0022-2836(72)90146-5. PMID  4571075.
  3. ^ ab Itakura K، Hirose T، Crea R، Riggs AD، Heyneker HL، Bolivar F، Boyer HW (ديسمبر 1977). “التعبير في الإشريكية القولونية عن الجين المركب كيميائيًا لهرمون السوماتوستاتين”. علوم . 198 (4321): 1056–63. بيب كود :1977Sci...198.1056I. دوى :10.1126/science.412251. بميد  412251.
  4. ^ ab Edge MD, Green AR, Heathcliffe GR, Meacock PA, Schuch W, Scanlon DB, et al. (أغسطس 1981). "التركيب الكامل لجين إنترفيرون الكريات البيضاء البشرية". Nature . 292 (5825): 756–62. Bibcode :1981Natur.292..756E. doi :10.1038/292756a0. PMID  6167861. S2CID  4330168.
  5. ^ Shukman D (2014-03-27). "التقدم في مجال الحمض النووي الاصطناعي يحظى بالإشادة". BBC News . تم الاسترجاع في 2020-04-11 .
  6. ^ Kimoto M، Yamashige R، Matsunaga K، Yokoyama S، Hirao I (مايو 2013). "توليد أبتامرات الحمض النووي عالية الألفة باستخدام أبجدية وراثية موسعة". Nature Biotechnology . 31 (5): 453–7. doi :10.1038/nbt.2556. PMID  23563318. S2CID  23329867.
  7. ^ Malyshev DA, Dhami K, Quach HT, Lavergne T, Ordoukhanian P, Torkamani A, Romesberg FE (يوليو 2012). "التكرار الفعّال والمستقل عن التسلسل للحمض النووي الذي يحتوي على زوج قاعدي ثالث يؤسس أبجدية جينية وظيفية مكونة من ستة أحرف". وقائع الأكاديمية الوطنية للعلوم في الولايات المتحدة الأمريكية . 109 (30): 12005–10. Bibcode :2012PNAS..10912005M. doi : 10.1073/pnas.1205176109 . PMC 3409741. PMID  22773812 . 
  8. ^ Malyshev DA, Dhami K, Lavergne T, Chen T, Dai N, Foster JM, et al. (مايو 2014). "كائن حي شبه اصطناعي بأبجدية جينية موسعة". Nature . 509 (7500): 385–8. Bibcode :2014Natur.509..385M. doi :10.1038/nature13314. PMC 4058825. PMID  24805238 . 
  9. ^ ab Fuhrmann M, Oertel W, Hegemann P (أغسطس 1999). "الجين الاصطناعي الذي يشفر البروتين الفلوري الأخضر (GFP) هو مراسل متعدد الاستخدامات في Chlamydomonas reinhardtii". مجلة النبات . 19 (3): 353–61. doi : 10.1046/j.1365-313X.1999.00526.x . PMID  10476082.
  10. ^ Mandecki W, Bolling TJ (أغسطس 1988). "طريقة FokI لتخليق الجينات". Gene . 68 (1): 101–7. doi :10.1016/0378-1119(88)90603-8. PMID  3265397.
  11. ^ Stemmer WP, Crameri A, Ha KD, Brennan TM, Heyneker HL (أكتوبر 1995). "تجميع خطوة واحدة لجين وبلازميد كامل من أعداد كبيرة من أوليجوديوكسي ريبونوكليوتيدات". Gene . 164 (1): 49–53. doi :10.1016/0378-1119(95)00511-4. PMID  7590320.
  12. ^ Gao X, Yo P, Keith A, Ragan TJ, Harris TK (نوفمبر 2003). "التوليف الجيني القائم على تفاعل البوليميراز المتسلسل المتوازن حراريًا من الداخل إلى الخارج (TBIO): طريقة جديدة لتصميم البادئ من أجل التجميع عالي الدقة لتسلسلات جينية أطول". Nucleic Acids Research . 31 (22): 143e–143. doi :10.1093/nar/gng143. PMC 275580. PMID  14602936 . 
  13. ^ يونغ إل، دونج كيو (أبريل 2004). "طريقة التخليق الجيني الكامل بخطوتين". أبحاث الأحماض النووية . 32 (7): e59. doi :10.1093/nar/gnh058. PMC 407838. PMID  15087491 . 
  14. ^ Hillson NJ, Rosengarten RD, Keasling JD (يناير 2012). "برنامج أتمتة تصميم تجميع الحمض النووي j5". ACS Synthetic Biology . 1 (1): 14–21. doi :10.1021/sb2000116. PMID  23651006.
  15. ^ Hoover DM, Lubkowski J (مايو 2002). "DNAWorks: طريقة آلية لتصميم الأوليجونوكليوتيدات لتخليق الجينات المستندة إلى تفاعل البوليميراز المتسلسل". Nucleic Acids Research . 30 (10): 43e–43. doi :10.1093/nar/30.10.e43. PMC 115297. PMID  12000848 . 
  16. ^ Villalobos A, Ness JE, Gustafsson C, Minshull J, Govindarajan S (يونيو 2006). "Gene Designer: a synthetic biology tool for building artificial DNA segments". BMC Bioinformatics . 7 : 285. doi : 10.1186/1471-2105-7-285 . PMC 1523223. PMID  16756672 . 
  17. ^ Tian J, Gong H, Sheng N, Zhou X, Gulari E, Gao X, Church G (ديسمبر 2004). "التوليف الدقيق للجينات المتعددة من شرائح DNA الدقيقة القابلة للبرمجة" (PDF) . Nature . 432 (7020): 1050–4. Bibcode :2004Natur.432.1050T. doi :10.1038/nature03151. hdl : 2027.42/62677 . PMID  15616567. S2CID  4373350.
  18. ^ Matzas M, Stähler PF, Kefer N, Siebelt N, Boisguérin V, Leonard JT, et al. (ديسمبر 2010). "التوليف الجيني عالي الدقة عن طريق استرجاع الحمض النووي الذي تم التحقق من تسلسله والذي تم تحديده باستخدام تسلسل البايرو عالي الإنتاجية". Nature Biotechnology . 28 (12): 1291–4. doi :10.1038/nbt.1710. PMC 3579223. PMID  21113166 . 
  19. ^ Schwartz JJ, Lee C, Shendure J (سبتمبر 2012). "التوليف الدقيق للجينات باستخدام استرجاع موجه للعلامات لجزيئات الحمض النووي التي تم التحقق من تسلسلها". Nature Methods . 9 (9): 913–5. doi :10.1038/nmeth.2137. PMC 3433648. PMID  22886093 . 
  20. ^ Weidman C (2017-12-06). "توسيع الأبجدية الجينية". مدونة . جامعة هارفارد . تم الاسترجاع في 2020-04-17 .
  21. ^ "مساعدة:علم الأحياء التركيبي - parts.igem.org". parts.igem.org . تم الاسترجاع في 2020-04-11 .
  22. ^ abc Casini A, Storch M, Baldwin GS, Ellis T (سبتمبر 2015). "Bricks and blueprints: methods and criteria for DNA assembly". Nature Reviews. Molecular Cell Biology . 16 (9): 568–76. doi :10.1038/nrm4014. hdl : 10044/1/31281 . PMID  26081612. S2CID  3502437.
  23. ^ Knight T (2003). "تصميم متجهات متجانسة للتجميع القياسي للطوب الحيوي". مجموعة عمل البيولوجيا التركيبية في معهد ماساتشوستس للتكنولوجيا . hdl :1721.1/21168.
  24. ^ Røkke G, Korvald E, Pahr J, Oyås O, Lale R (2014). "معايير وتقنيات تجميع الطوب الحيوي وأدوات البرمجيات المرتبطة بها". في Valla S, Lale R (المحرران). استنساخ الحمض النووي وطرق التجميع . طرق في علم الأحياء الجزيئي. المجلد 1116. كليفتون، نيوجيرسي، ص 1-24. doi :10.1007/978-1-62703-764-8_1. ISBN 978-1-62703-763-1. PMID  24395353.{{cite book}}:CS1 maint: موقع الناشر المفقود ( الرابط )
  25. ^ Knight T (2008-11-19). "مسودة معيارية لأجزاء Biobrick BB-2 البيولوجية". BBF RFC . 12 . hdl :1721.1/45139.
  26. ^ Anderson JC, Dueber JE, Leguia M, Wu GC, Goler JA, Arkin AP, Keasling JD (يناير 2010). "BglBricks: معيار مرن لتجميع الأجزاء البيولوجية". مجلة الهندسة البيولوجية . 4 (1): 1. doi : 10.1186/1754-1611-4-1 . PMC 2822740. PMID  20205762 . 
  27. ^ Phillips I, Silver P (2006-04-20). "استراتيجية جديدة لتجميع الطوب الحيوي مصممة للهندسة البروتينية السهلة". hdl :1721.1/32535.
  28. ^ جرونبيرج آر ، أرندت ك ، مولر ك (2009-04-18). "معيار تجميع الطوب الحيوي للبروتين (فرايبورج)". BBF RFC . 25 . اتش دي ال :1721.1/45140.
  29. ^ Shetty R, Lizarazo M, Rettberg R, Knight TF (2011). "تجميع الأجزاء البيولوجية القياسية من BioBrick باستخدام ثلاثة تجميعات مضادة للمضادات الحيوية". علم الأحياء التركيبي، الجزء ب - التصميم بمساعدة الكمبيوتر وتجميع الحمض النووي . طرق في علم الإنزيمات. المجلد 498. ص 311-26. doi :10.1016/B978-0-12-385120-8.00013-9. hdl : 1721.1/65066 . ISBN 9780123851208. PMID  21601683.
  30. ^ Speer MA, Richard TL (ديسمبر 2011). "Amplified insert assembly: an optimized approach to standard assembly of BioBrickTM genetic circuits". مجلة الهندسة البيولوجية . 5 (1): 17. doi : 10.1186/1754-1611-5-17 . PMC 3287150. PMID  22176971 . 
  31. ^ ab Li MV, Shukla D, Rhodes BH, Lall A, Shu J, Moriarity BS, Largaespada DA (2014-06-24). "HomeRun Vector Assembly System: a elastic and standardized cloning system for assembly of multi-modular DNA structures". PLOS ONE . ​​9 (6): e100948. Bibcode :2014PLoSO...9j0948L. doi : 10.1371/journal.pone.0100948 . PMC 4069157 . PMID  24959875. 
  32. ^ Liu JK, Chen WH, Ren SX, Zhao GP, Wang J (2014-10-20). "iBrick: معيار جديد للتجميع التكراري للأجزاء البيولوجية باستخدام نوكليازات التوجيه". PLOS ONE . 9 (10): e110852. Bibcode : 2014PLoSO ...9k0852L. doi : 10.1371/journal.pone.0110852 . PMC 4203835. PMID  25329380. 
  33. ^ ab Engler C, Kandzia R, Marillonnet S (2008-11-05). "طريقة استنساخ دقيقة في وعاء واحد وخطوة واحدة مع قدرة إنتاجية عالية". PLOS ONE . ​​3 (11): e3647. Bibcode :2008PLoSO...3.3647E. doi : 10.1371/journal.pone.0003647 . PMC 2574415 . PMID  18985154. 
  34. ^ Weber E, Engler C, Gruetzner R, Werner S, Marillonnet S (فبراير 2011). "نظام استنساخ معياري للتجميع القياسي للهياكل متعددة الجينات". PLOS ONE . 6 (2): e16765. Bibcode :2011PLoSO...616765W. doi : 10.1371/journal.pone.0016765 . PMC 3041749. PMID  21364738 . 
  35. ^ Klein CA, Emde L, Kuijpers A, Sobetzko P (2019-10-17 ) . "MoCloFlex: نظام استنساخ معياري ومرن". Frontiers in Bioengineering and Biotechnology . 7 : 271. doi : 10.3389/fbioe.2019.00271 . PMC 6843054. PMID  31750294. 
  36. ^ Moore SJ, Lai HE, Kelwick RJ, Chee SM, Bell DJ, Polizzi KM, Freemont PS (أكتوبر 2016). "EcoFlex: مجموعة متعددة الوظائف MoClo لعلم الأحياء التركيبي لـ E. coli". ACS Synthetic Biology . 5 (10): 1059–1069. doi : 10.1021/acssynbio.6b00031 . hdl : 10044/1/31290 . PMID  27096716.
  37. ^ Crozet P, Navarro FJ, Willmund F, Mehrshahi P, Bakowski K, Lauersen KJ, et al. (سبتمبر 2018). "ولادة هيكل التمثيل الضوئي: مجموعة أدوات MoClo لتمكين علم الأحياء التركيبي في الطحالب الدقيقة Chlamydomonas reinhardtii". ACS Synthetic Biology . 7 (9): 2074–2086. doi :10.1021/acssynbio.8b00251. PMID  30165733. S2CID  52131500.
  38. ^ Reece-Hoyes JS, Walhout AJ (يناير 2018). "Gateway Recombination Cloning". Cold Spring Harbor Protocols . 2018 (1): pdb.top094912. doi :10.1101/pdb.top094912. PMC 5935001. PMID  29295908 . 
  39. ^ Sasaki Y, Sone T, Yoshida S, Yahata K, Hotta J, Chesnut JD, et al. (فبراير 2004). "دليل على الخصوصية العالية والكفاءة لإشارات إعادة التركيب المتعددة في استنساخ الحمض النووي المختلط بواسطة نظام Multisite Gateway". مجلة التكنولوجيا الحيوية . 107 (3): 233–43. doi :10.1016/j.jbiotec.2003.10.001. PMID  14736459.
  40. ^ Colloms SD، Merrick CA، Olorunniji FJ، Stark WM، Smith MC، Osbourn A، et al. (فبراير 2014). "التجميع السريع للمسار الأيضي وتعديله باستخدام إعادة التركيب الموقعي المحدد لإنزيم السيرين". Nucleic Acids Research . 42 (4): e23. doi :10.1093/nar/gkt1101. PMC 3936721. PMID 24225316  . 
  41. ^ Zhang L, Zhao G, Ding X (2011-11-03). "التجميع المترادف لمجموعة الجينات الحيوية للإيبوثيلون عن طريق إعادة التركيب في موقع محدد في المختبر". التقارير العلمية . 1 (1): 141. Bibcode :2011NatSR...1E.141Z. doi :10.1038/srep00141. PMC 3216622. PMID  22355658 . 
  42. ^ Gibson DG, Young L, Chuang RY, Venter JC, Hutchison CA, Smith HO (مايو 2009). "التجميع الأنزيمي لجزيئات الحمض النووي حتى عدة مئات من الكيلوبايتات". Nature Methods . 6 (5): 343–5. doi :10.1038/nmeth.1318. PMID  19363495. S2CID  1351008.
  43. ^ Quan J, Tian J (يوليو 2009). "استنساخ مكتبات الجينات المعقدة والمسارات باستخدام البوليميراز الدائري". PLOS ONE . 4 (7): e6441. Bibcode :2009PLoSO...4.6441Q. doi : 10.1371/journal.pone.0006441 . PMC 2713398. PMID  19649325 . 
  44. ^ Li MZ, Elledge SJ (مارس 2007). "تسخير إعادة التركيب المتماثل في المختبر لتوليد الحمض النووي المؤتلف عبر SLIC". Nature Methods . 4 (3): 251–6. doi :10.1038/nmeth1010. PMID  17293868. S2CID  30893882.
  45. ^ Zhang Y, Werling U, Edelmann W (أبريل 2012). "SLiCE: طريقة جديدة لاستنساخ الحمض النووي تعتمد على مستخلص الخلايا البكتيرية". Nucleic Acids Research . 40 (8): e55. doi :10.1093/nar/gkr1288. PMC 3333860. PMID  22241772 . 
  46. ^ "كيف تعمل تقنية Gibson Assembly® على تغيير علم الأحياء التركيبي". New England Biolabs . تم الاسترجاع في 2020-04-14 .
  47. ^ Casini A, MacDonald JT, De Jonghe J, Christodoulou G, Freemont PS, Baldwin GS, Ellis T (يناير 2014). "إنشاء الحمض النووي أحادي الوعاء للبيولوجيا الاصطناعية: استراتيجية التجميع الموجه بالتداخل المعياري باستخدام الروابط (MODAL)". Nucleic Acids Research . 42 (1): e7. doi :10.1093/nar/gkt915. PMC 3874208. PMID  24153110 . 
  48. ^ abcd Storch M, Casini A, Mackrow B, Fleming T, Trewhitt H, Ellis T, Baldwin GS (يوليو 2015). "BASIC: معيار تجميع الأجزاء الحيوية الجديد للاستنساخ الأيدبوت يوفر تجميعًا دقيقًا أحادي الطبقة للحمض النووي للبيولوجيا التركيبية". ACS Synthetic Biology . 4 (7): 781–7. doi : 10.1021/sb500356d . hdl : 10044/1/29939 . PMID  25746445.
  49. ^ "بروتوكول تجميع جيبسون". Addgene . تم الاسترجاع في 2020-04-14 .
  50. ^ El Karoui M, Hoyos -Flight M, Fletcher L (2019). "Future Trends in Synthetic Biology-A Report". Frontiers in Bioengineering and Biotechnology . 7 : 175. doi : 10.3389/fbioe.2019.00175 . PMC 6692427. PMID  31448268. 
  51. ^ Kosuri S, Church GM (مايو 2014). "التوليف الجديد للحمض النووي على نطاق واسع: التقنيات والتطبيقات" (PDF) . Nature Methods . 11 (5): 499–507. doi :10.1038/nmeth.2918. PMC 7098426. PMID  24781323 . 
  52. ^ Lartigue C, Glass JI, Alperovich N, Pieper R, Parmar PP, Hutchison CA, et al. (أغسطس 2007). "زرع الجينوم في البكتيريا: تغيير نوع إلى آخر". Science . 317 (5838): 632–8. Bibcode :2007Sci...317..632L. CiteSeerX 10.1.1.395.4374 . doi :10.1126/science.1144622. PMID  17600181. S2CID  83956478. 
  53. ^ Pilkington E (2009-10-06). "أنا أصنع حياة اصطناعية، يعلن رائد الجينات الأمريكي". The Guardian . لندن. مؤرشف من الأصل في 28 مايو 2010. تم الاسترجاع في 2010-05-22 .
  54. ^ Pennisi, E. (2010-05-21). "Synthetic Genome Brings New Life to Bacterium" (PDF) . Science . 328 (5981): 958–9. doi : 10.1126/science.328.5981.958 . PMID  20488994. مؤرشف من الأصل (PDF) في 25 مايو 2010 . تم الاسترجاع في 2010-05-21 .
  55. ^ "كيف صنع العلماء "حياة اصطناعية". بي بي سي نيوز . 2010-05-20. مؤرشف من الأصل في 1 يونيو 2013. تم استرجاعه في 2010-05-21 .
  56. ^ "الخميرة 2.0". مجموعة اتصالات الطبيعة . Springer Nature Limited. 22 مايو 2018. تم الاسترجاع في 2020-04-17 .
  57. ^ Shukman D (27 مارس 2014). "علماء يشيدون بالتقدم المحرز في مجال الكروموسومات الاصطناعية". BBC News . تم الاسترجاع في 2014-03-28 .
  58. ^ أنالورو ن، مولر إتش، ميتشل لا، رامالينغام إس، ستراكوادينيو جي، ريتشاردسون إس إم، وآخرون. (أبريل 2014). “التوليف الكامل لكروموسوم حقيقي النواة مصمم وظيفي”. علوم . 344 (6179): 55-8. بيب كود :2014Sci...344...55A. دوى :10.1126/science.1249252. بمك 4033833 . بميد  24674868. 
  59. ^ إصدار خاص من مجلة جينوم الخميرة الاصطناعية ، 10 مارس 2017، المجلد 355، العدد 6329
تم الاسترجاع من "https://en.wikipedia.org/w/index.php?title=التخليق_الجيني_الاصطناعي&oldid=1221385830"
Original text
Rate this translation
Your feedback will be used to help improve Google Translate