اختبار نوكلياز Surveyor

📅 آخر تحديث: ٤ أغسطس ٢٠٢٦
✍️ نُشر في: ٤ أغسطس ٢٠٢٦
📷 يحتوي على 1 صور
الموسوعة الحرة
مخطط سير عمل فحص النيوكلياز الخاص بجهاز المسح

اختبار النيوكلياز Surveyor هو اختبار انقسام عدم تطابق الإنزيم يستخدم للكشف عن عدم تطابق القاعدة المفردة أو الإدخالات أو الحذف الصغيرة ( indels ).

إنزيم نوكلياز Surveyor هو جزء من عائلة من الإنزيمات النووية الداخلية المتخصصة في عدم تطابق القواعد ، والتي اكتُشفت في الكرفس (إنزيمات نوكلياز CEL). [ 1 ] يتعرف هذا الإنزيم على جميع استبدالات القواعد والإضافات/الحذف، ويقطع الطرف 3′ للمواقع غير المتطابقة في كلا شريطي الحمض النووي بدقة عالية. [ 2 ]

وقد تم استخدام هذا الاختبار لتحديد وتحليل الطفرات في مجموعة متنوعة من الكائنات الحية وأنواع الخلايا، وكذلك لتأكيد تعديلات الجينوم بعد تحرير الجينوم (باستخدام CRISPR / TALENs / أصابع الزنك ).

خلفية

تُعدّ القدرة على اكتشاف الطفرات المعروفة وغير المعروفة والكشف عنها ذات أهمية بالغة في البحوث الطبية الحيوية والتشخيص الجيني (انظر التطبيقات). ولذلك، طُوّرت طرق متعددة لتمكين الكشف عن هذه الطفرات في البحوث والتشخيص السريري.

إنّ الطريقة الأكثر مباشرة لتحديد التغيرات/الاختلافات في التسلسل هي قراءة تسلسل الحمض النووي باستخدام طرق التسلسل التقليدية وعالية الإنتاجية (انظر تسلسل سانجر وتسلسل الحمض النووي ). مع ذلك، تُنتج هذه الطرق كميات كبيرة من البيانات غير الضرورية، كما أنها مكلفة. [ 3 ] إضافةً إلى ذلك، قد يكون التسلسل التقليدي مفيدًا في الكشف عن الطفرات الجرثومية، ولكنه قد يكون أقل نجاحًا في الكشف عن الأليلات الجسدية الثانوية ذات الترددات المنخفضة ( الفسيفساء ). لذلك، ثمة حاجة إلى مناهج أخرى غير قائمة على التسلسل للكشف عن الطفرات أو تعدد الأشكال الجينية.

تعتمد طرق أخرى شائعة الاستخدام على الخصائص الفيزيائية للحمض النووي، مثل الأنظمة القائمة على درجة حرارة الانصهار، كتحليل تعدد الأشكال التوافقي أحادي السلسلة (SSCP) والكروماتوغرافيا السائلة عالية الأداء في ظروف التمَسُّخ (DHPLC). تقتصر هذه التقنيات عمومًا على تحليل أجزاء قصيرة من الحمض النووي (أقل من 1000 زوج قاعدي)، ولا تُشير إلا إلى وجود تعدد الأشكال، لكنها لا تُحدد بسهولة موقع الطفرة ضمن تسلسل الحمض النووي. لذا، يجب استكمال ذلك بتقنيات إضافية لتحديد موقع الطفرة بدقة أو رسم خريطة لطفرات متعددة في الجزء نفسه. [ 3 ]

تستغل فحوصات التحلل الإنزيمي لعدم تطابق القواعد خصائص الإنزيمات النووية الداخلية المتخصصة في الكشف عن عدم التطابق وفصله. تتميز هذه الطرق بسهولة تطبيقها باستخدام تقنيات ومعدات المختبر القياسية، ويمكنها الكشف عن تعدد الأشكال، وعدم تطابق زوج القاعدة المفرد ، وعمليات الإدخال والحذف بترددات منخفضة. [ 4 ] وقد تم اكتشاف العديد من هذه الإنزيمات (بما في ذلك CEL I، وإنزيم T4 النووي الداخلي VII، وإنزيم Endonuclease V ، وإنزيم T7 النووي الداخلي I). [ 3 ]

يُعدّ إنزيم Surveyor nuclease (CEL II) أحد الإنزيمات الشائعة الاستخدام، حيث يقوم بقطع الطرف 3′ لكلا سلسلتي الحمض النووي DNA بدقة عالية عند مواقع استبدال القواعد أو الإدخال/الحذف. يتميز هذا الإنزيم بقدرته على القطع عند طفرات متعددة في أجزاء كبيرة من الحمض النووي DNA، وينتج نواتج قطع قابلة للكشف من الحمض النووي DNA غير المتطابق الذي يمثل نسبة صغيرة فقط من الحمض النووي DNA في العينة، مما يجعله مناسبًا للاستخدام في فحوصات قطع الحمض النووي DNA غير المتطابق. [ 2 ]

تاريخ

في عام 1998، حدد أوليكوفسكي وآخرون [ 5 ] إنزيم نووي داخلي جديد متخصص في عدم تطابق القواعد. تم تنقية الإنزيم من الكرفس وأُطلق عليه اسم CEL I.

أظهرت الدراسات أن إنزيم CEL I يقطع الحمض النووي بدقة عالية على كلا الشريطين عند الطرف 3′ لمواقع عدم تطابق استبدال القواعد، وبالتالي يمكن استخدامه في طرق الكشف عن الطفرات الإنزيمية لتحديد الطفرات والتعددات الشكلية. وقد أثبت أوليكوفسكي وزملاؤه هذه التقنية باستخدام هذا الإنزيم للكشف عن مجموعة متنوعة من الطفرات والتعددات الشكلية في جين BRCA1 البشري . [ 1 ] [ 5 ] [ 6 ]

أثناء مراقبة تنقية إنزيم CEL I باستخدام الرحلان الكهربائي على هلام متعدد الأكريلاميد ، لاحظ يانغ وزملاؤه [ 1 ] وجود حزمتين من النيوكلياز متلازمتين خلال جميع مراحل التنقية. سُمّي النشاط النيوكليازي الرئيسي CEL I، بينما سُمّي النشاط الثانوي على هلام SDS-PAGE بـ CEL II. وخلصوا إلى أن CEL I وCEL II متشابهان، وأن كلاهما قادر على قطع عدم تطابق الحمض النووي.

في عام 2004، قام كيو وآخرون بتطوير تقنية للكشف عن الطفرات تعتمد على CEL II، والمعروفة أيضًا باسم Surveyor Nuclease. [ 2 ] ومنذ ذلك الحين، تم استخدام هذه الطريقة للكشف عن الطفرات والتعددات الشكلية في العديد من الكائنات الحية وأنواع الخلايا المختلفة (انظر التطبيقات).

تم ترخيص نوكلياز Surveyor من مركز فوكس تشيس للسرطان بواسطة شركة Transgenomic، وتم بيعه لاحقًا إلى شركة IDT ، التي تقوم حاليًا بتوزيعه.

سير عمل فحص النيوكلياز في برنامج Surveyor

استخلاص الحمض النووي

في البداية، يتم استخلاص الحمض النووي المطلوب ( الحمض النووي النووي أو الميتوكوندري ) من الأنسجة أو مزارع الخلايا . ويمكن القيام بذلك باستخدام طرق الاستخلاص القياسية مثل الهضم باستخدام بروتينيز K متبوعًا بالترسيب بالإيثانول أو باستخدام طرق أخرى متوفرة تجاريًا.

إذا كان من المتوقع أن يكون الحمض النووي غير متجانس، على سبيل المثال من مجموعة من الخلايا المعدلة بشكل مختلف أو من حاملي الطفرات غير المتجانسة، فلا حاجة لإضافة الحمض النووي للتحكم.

تفاعل البوليميراز المتسلسل

يتم تضخيم المنطقة المستهدفة في كل من الحمض النووي المرجعي للطفرة والنوع البري باستخدام تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR). ينبغي إجراء تفاعل PCR باستخدام بوليميراز عالي الدقة مزود بخاصية التدقيق لتجنب حدوث أخطاء PCR التي قد يفسرها النيوكلياز. يجب تحسين تفاعل PCR لإنتاج حزمة واحدة قوية، حيث أن الحزم غير النوعية ستزيد من التشويش الخلفي للتحليل.

إذا كان من المتوقع أن يكون الأليل محل الاهتمام موجودًا بتردد منخفض، كما هو الحال في حالة الفسيفساء الجسدية أو الحمض النووي للميتوكوندريا غير المتجانس، فقد يتم النظر في بروتوكول PCR معدل يقوم بإثراء الأليلات المتغيرة من خليط من الحمض النووي من النوع البري والحمض النووي الذي يحتوي على الطفرة (مثل COLD-PCR ).

تكوين الحمض النووي المزدوج الهجين

يُخضع الحمض النووي المستهدف لعملية فصل السلاسل ثم إعادة ربطها لتكوين جزيئات هجينة تحتوي على عدم تطابق عند موضع الطفرة، والتي يمكن تحديدها بواسطة نوكلياز Surveyor. إذا كان من المتوقع أن يكون الحمض النووي متجانسًا (مثل الحمض النووي للميتوكوندريا المتجانس أو الأليلات المتطابقة على كلا كروموسومي الحمض النووي الجينومي)، فإنه يلزم استخدام حمض نووي من عينة تحكم لتكوين جزيء هجين يمكن للنوكلياز التعرف عليه. أما إذا كانت عينة الحمض النووي غير متجانسة، فلا حاجة إلى حمض نووي تحكم إضافي؛ ومع ذلك، يجب فصل سلاسل نواتج تفاعل البوليميراز المتسلسل وإعادة ربطها لتكوين جزيئات هجينة.

الهضم

يُعالج الحمض النووي المُهَجَّن بإنزيم نوكلياز Surveyor لفصل السلاسل غير المتجانسة. يستطيع إنزيم نوكلياز Surveyor تحديد جميع أنواع عدم التطابق، مع العلم أن تفضيلات قطع عدم التطابق تُصنَّف إلى أربع مجموعات من الأكثر تفضيلاً إلى الأقل: تُفضَّل CT وAC وCC بالتساوي على TT، تليها AA وGG، وأخيرًا الأقل تفضيلاً، AG وGT. كما يؤثر سياق التسلسل على معدل هضم نوكلياز Surveyor. [ 2 ]

تحليل

يمكن تحليل نواتج هضم الحمض النووي باستخدام الرحلان الكهربائي الهلامي التقليدي أو الرحلان الكهربائي الشعيري عالي الدقة . يشير الكشف عن النواتج المقطوعة إلى وجود جزيء مزدوج غير متجانس ناتج عن عدم تطابق. يمكن استنتاج موقع الطفرة/التعدد الشكلي من خلال ملاحظة طول القطعة بعد القطع. في حال استخدام بادئات موسومة بصبغة فلورية لتحديد طرفي 5' و3' لنواتج تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR)، ستظهر حزم ملونة مختلفة في التحليل. يؤكد حجم كل حزمة على حدة موقع الطفرة/التعدد الشكلي. يمكن الكشف عن طفرات متعددة من خلال وجود عدة قطع. [ 1 ] [ 5 ]

المزايا والعيوب

المزايا

مزايا فحوصات النيوكلياز غير المتطابقة

تتمثل إحدى المزايا الرئيسية للكشف عن الطفرات والتعددات الشكلية باستخدام طرق النيوكلياز غير المتطابقة في عدم الحاجة إلى معرفة مسبقة بطبيعة الطفرة، على عكس الطرق الأخرى، مثل تعدد أطوال قطع التقييد (RFLP) التي تم استخدامها لتحليل SNP في الماضي.

بالمقارنة مع الطرق القائمة على درجة حرارة الانصهار، فإن طرق الإندونوكلياز الخاصة بعدم التطابق ليست أسرع فحسب، بل يمكنها أيضًا اكتشاف طفرات متعددة في أجزاء كبيرة من الحمض النووي.

تُعد هذه الطريقة قابلة للتطبيق في الأنظمة عالية الإنتاجية التي تستخدم الحقن الآلي، مما يجعلها مناسبة للفحص. [ 7 ]

مزايا نوكلياز المسح

إنزيم نوكلياز Surveyor هو إنزيم حساس نسبيًا، إذ يُنتج نواتج قطع قابلة للكشف من تسلسلات لا تُمثل سوى نسبة ضئيلة من الحمض النووي في العينة. يستطيع هذا الإنزيم الكشف عن نسبة 1:32 من الحمض النووي الهجين إلى الحمض النووي المتماثل لمنتجات تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR) الصغيرة (حوالي 0.6 كيلوبايت)، ونسبة 1:16 من الحمض النووي الهجين إلى الحمض النووي المتماثل لمنتجات تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR) الأطول (حوالي 2.3 كيلوبايت). تُتيح هذه الخاصية إمكانية تجميع العينات السريرية لزيادة تكوين الحمض النووي الهجين، وبالتالي زيادة الحساسية. [ 3 ] كما يُفيد هذا في الكشف عن الطفرات الطفيفة في عينة غير متجانسة (مثل الأورام غير المتجانسة). في حالة تعديل الجينوم باستخدام تقنية كريسبر أو غيرها من الطرق، تُعزز هذه الخاصية الكشف عن أحداث التعديل النادرة في مجموعة من الخلايا قبل إنشاء واختبار النسخ المُعدلة الفردية.

يقوم إنزيم Surveyor nuclease بقطع جميع أنواع عدم التطابق، حتى وإن كان بعضها أكثر تفضيلاً من غيرها: يُفضّل كل من CT وAC وCC بالتساوي على TT، يليهما AA وGG، وأخيراً الأقل تفضيلاً، وهما AG وGT. كما أنه يكشف عن عمليات الإدخال والحذف التي يصل طولها إلى 12 زوجاً قاعدياً على الأقل. [ 2 ]

يمكن لفحص نوكلياز Surveyor أيضًا الكشف عن طفرات متعددة في نفس الجزء. ومع ذلك، يتطلب ذلك عدة خطوات معالجة إضافية قد تزيد من التشويش في الفحص (انظر القيود).

القيود

ناتج تضخيم تفاعل البوليميراز المتسلسل

من أبرز عيوب هذا التحليل اعتماده على تضخيم الحمض النووي بتقنية تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR)، وبالتالي تأثره بجودة الناتج المُضخّم. قد تؤدي شوائب تفاعل البوليميراز المتسلسل (مثل ثنائيات البادئات أو النواتج المبتورة) إلى زيادة التشويش الخلفي وحجب الإشارة. كما قد تُثبّط ثنائيات البادئات نشاط إنزيم النيوكلياز المُستَكشِف، مما يُقلّل من قوة الإشارة.

بما أن تقنية تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR) قد تُسبب طفرات خاصة بها أثناء عملية التضخيم، فإن هذه الأخطاء قد تزيد من التشويش الخلفي. لذا، يُفضل استخدام بوليميراز عالي الدقة لتقليل أخطاء التضخيم.

قد يكون تحليل الحمض النووي للميتوكوندريا عرضة للتلوث بتسلسلات الحمض النووي للميتوكوندريا النووية التي يتم تضخيمها بشكل مشترك أثناء تفاعل البلمرة المتسلسل (PCR)، مما يؤدي إلى تشويش تحليل الحمض النووي للميتوكوندريا المتجانس مقابل الحمض النووي للميتوكوندريا غير المتجانس. [ 8 ]

للكشف عن طفرات متعددة في نفس القطعة، يجب إجراء تنقية ما بعد تفاعل البلمرة المتسلسل (PCR) قبل هضم نوكلياز Surveyor. يمكن تحسين الكشف عن عدم تطابق القواعد المتعددة بزيادة مدة وكمية نوكلياز Surveyor في التفاعل، ولكن هذا يزيد أيضًا من التشويش الناتج عن القطع غير النوعي.

قيود إنزيم نوكلياز المسح

يمتلك إنزيم Surveyor nuclease أيضًا نشاطًا خارجيًا 5′ يهاجم نهايات الحمض النووي المزدوج، مما يزيد من إشارة الخلفية أثناء فترة الحضانة الطويلة. [ 2 ] ويمكن تقليل ذلك عن طريق تقصير وقت الهضم وإضافة بوليميراز الحمض النووي.

التطبيقات

تأكيد تعديلات الجينوم باستخدام تقنية كريسبر وغيرها من الطرق

ظهرت في السنوات الأخيرة عدة تقنيات لتعديل الجينوم، منها نوكليازات أصابع الزنك (ZFNs)، ونوكليازات المؤثرات الشبيهة بمنشطات النسخ ( TALENs )، ونظام نوكلياز CRISPR/Cas9 الموجه بالحمض النووي الريبي . تعمل هذه الطرق على تعديل الجينوم عن طريق إحداث قطع في سلسلتي الحمض النووي، يليه إصلاح عبر مساري الربط غير المتجانس للنهايات (NHEJ) أو الإصلاح الموجه بالتماثل (HDR). في حين يُتوقع أن يُحدث HDR تعديلًا متسقًا في الجينوم، قد يُحدث NHEJ مزيجًا غير متجانس من الطفرات (عادةً ما تكون حذفًا أو إدخالًا صغيرًا)، مما يصعب تحديده باستخدام تسلسل سانجر. يمكن الكشف عن الطفرات النقطية والحذف والإدخال بواسطة فحص نوكلياز Surveyor، مما يجعله مفيدًا للكشف عن تعديل الجينوم في مجموعة من الخلايا دون الحاجة إلى التوسع النسيلي قبل التحليل، كما يُمكنه أيضًا توفير تقدير لكفاءة الاستهداف المُحققة. [ 9 ] [ 10 ] [ 11 ] حتى بعد التوسع النسيلي، قد يكون الكشف عن الطفرات باستخدام تسلسل سانجر صعبًا، إذ يمكن لكل أليل أن يخضع لعملية تحرير مختلفة. في هذه الحالة، سيستغل اختبار نوكلياز Surveyor هذا التأثير لإنشاء الهيترودوبلكسات المطلوبة للكشف عنها بواسطة إنزيم نوكلياز عدم التطابق.

الكشف عن الطفرات الجرثومية في الجينات البشرية

استُخدم اختبار نوكلياز Surveyor للكشف عن الطفرات الجرثومية في الجينات البشرية. على سبيل المثال، جين ATRX المرتبط بالإعاقة الذهنية المرتبطة بالكروموسوم X، [ 12 ] وجين HBB المرتبط بمرض الثلاسيميا بيتا. [ 7 ] كما استُخدم الاختبار للكشف عن طفرات الحمض النووي للميتوكوندريا والنواة المرتبطة بعيوب سلسلة التنفس، [ 13 ] والطفرات المرتبطة بأمراض الكلى. [ 14 ] [ 15 ]

الكشف عن الطفرات الجسدية في السرطان

استُخدم اختبار نوكلياز Surveyor للكشف عن الطفرات الجسدية في العديد من الجينات المرتبطة بالسرطان ، وكما ذُكر سابقًا، يُمكن استخدامه حتى عندما تكون العينة غير متجانسة ولا يُمثل الأليل الطافر سوى 1% إلى 5% من إجمالي الأليلات. [ 16 ] وقد استُخدمت هذه الطريقة للكشف عن الطفرات في مستقبل عامل نمو البشرة (EGFR)، [ 16 ] [ 17 ] [ 18 ] [ 19 ] وكينيز جانوس 2 (JAK2)، [ 20 ] [ 21 ] و p53، [ 22 ] وغيرها.

تطبيقات أخرى

وقد تم استخدام هذه الطريقة للكشف عن الطفرات التي تسبب مقاومة الأدوية في المتفطرة السلية . [ 23 ]

مراجع

  1. 1 2 3 4 يانغ، ب.؛ وين، إكس.؛ كودالي، إن إس؛ أوليكوفسكي، سي إيه؛ ميلر، سي جي؛ كولينسكي، جيه.؛ بيساك، دي.؛ يونغ، جيه إيه؛ كوالسكي، دي. (2000-04-04). "تنقية واستنساخ وتوصيف نوكلياز CEL I". الكيمياء الحيوية . 39 (13): 3533-3541 . doi : 10.1021/bi992376z . ISSN 0006-2960 . PMID 10736152 .  
  2. 1 2 3 4 5 6 كيو، بيتر؛ شانديليا، هاريني؛ داليسيو، جيمس م.؛ أوكونور، كيفن؛ دوروشيه، جيفري؛ جيرارد، غاري ف. (2004-04-01). "الكشف عن الطفرات باستخدام نوكلياز Surveyor" . BioTechniques . 36 (4): 702–707 . doi : 10.2144/04364PF01 . ISSN 0736-6205 . PMID 15088388 .  
  3. 1 2 3 4 يونغ، أنتوني ت.؛ هاتانغادي، ديبالي؛ بليكيسلي، لورين؛ نيكولاس، إيمانويل (2005-05-01). "تقنيات الكشف عن الطفرات الإنزيمية" . BioTechniques . 38 (5): 749–758 . doi : 10.2144/05385rv01 . ISSN 0736-6205 . PMID 15948293 .  
  4. ↑ هوانغ، مو تشاو؛ تشيونغ، واي تشاي؛ ليم، لي شي؛ لي، مو-هوانغ (2012-03-01). "فحص طفرات بسيط وعالي الحساسية باستخدام إنزيم Ampligase-medified T7 endonuclease I وإنزيم Surveyor nuclease مع الفصل الكهربائي الشعيري الميكروفلويدي". Electrophoresis . 33 ( 5): 788–796 . doi : 10.1002/elps.201100460 . ISSN 1522-2683 . PMID 22437793. S2CID 40764751 .   
  5. 1 2 3 أوليكوفسكي، كاثرين أ.؛ مولينز، كولين ر.ب.؛ جودوين، أندرو ك.؛ يونغ، أنتوني ت. (1998). "الكشف عن الطفرات باستخدام إنزيم نووي داخلي نباتي جديد" . مجلة أبحاث الأحماض النووية . 26 (20): 4597-4602 . doi : 10.1093/nar/26.20.4597 . PMC 147896. PMID 9753726 .  
  6. ↑ كولينسكي، ج.؛ بيساك، د.؛ أوليكوفسكي، ك.أ.؛ جودوين، أ.ك.؛ يونغ، أ.ت. (2000-07-01). "فحص الكشف عن الطفرات الإنزيمية باستخدام CEL I" . BioTechniques . 29 (1): 44–46 ، 48. doi : 10.2144/00291bm07 . ISSN 0736-6205 . PMID 10907074 .  
  7. 1 2 هونغ، تشيا-تشنغ؛ سو، يي-نينغ؛ لين، تشيا-يون؛ تشانغ، ين-فاي؛ تشانغ، تشين-هوي؛ تشنغ، وين-فانغ؛ تشن، تشي-آن؛ لي، تشين-نان؛ لين، وين-لي (2008-01-01). "مقارنة بين طريقة الإندونوكلياز النوعي لعدم التطابق وتقنية كروماتوغرافيا السائل عالي الأداء المُشوهة لتحديد طفرات جين HBB" . مجلة BMC للتكنولوجيا الحيوية . 8 : 62. doi : 10.1186/1472-6750-8-62 . ISSN 1472-6750 . PMC 2525636. PMID 18694524 .   
  8. ↑ ين، هسيو-تشوان؛ لي، شيو-لي؛ هسو، وي-تشين؛ تانغ، بيتروس (2014-01-01). "تداخل تسلسلات الحمض النووي للميتوكوندريا النووية المُضخّمة معًا في تحديد التغاير البلازمي للحمض النووي للميتوكوندريا البشرية باستخدام نوكلياز SURVEYOR ونظام WAVE HS" . PLOS ONE . 9 (3) e92817. Bibcode : 2014PLoSO...992817Y . doi : 10.1371/ journal.pone.0092817 . ISSN 1932-6203 . PMC 3963942. PMID 24664244 .   
  9. ↑ غوشين، ديمتري ي.؛ وايت، آدم ج.؛ كاتيبة، جورج إي.؛ ميلر، جيفري سي.؛ هولمز، مايكل سي.؛ ريبار، إدوارد ج. (2010-01-01). "فحص سريع وعام لرصد تعديل الجينات الداخلية". بروتينات أصابع الزنك المُهندسة . طرق في البيولوجيا الجزيئية . المجلد 649. الصفحات 247-256 . doi : 10.1007/978-1-60761-753-2_15 . ISBN   978-1-60761-752-5ISSN 1940-6029 . PMID 20680839 .​  
  10. ↑ ران، ف. آن؛ هسو، باتريك د.؛ لين، تشي-يو؛ غوتنبرغ، جوناثان س.؛ كونرمان، سيلفانا؛ تريفينو، أليخاندرو إي.؛ سكوت، ديفيد أ.؛ إينوي، أزوسا؛ ماتوبا، شوغو (12-09-2013). "القطع المزدوج بواسطة CRISPR Cas9 الموجه بالحمض النووي الريبي لتحسين دقة تحرير الجينوم" . مجلة Cell . 154 (6): 1380-1389 . doi : 10.1016/j.cell.2013.08.021 . ISSN 1097-4172 . PMC 3856256. PMID 23992846 .   
  11. ↑ وانغ، هاوي؛ يانغ، هوي؛ شيفاليلا، تشيكدو س.؛ دولاتي، ميلاد م.؛ تشنغ، ألبرت و.؛ تشانغ، فنغ؛ جانيش، رودولف (9 مايو 2013). "توليد فئران تحمل طفرات في جينات متعددة بخطوة واحدة باستخدام هندسة الجينوم بوساطة CRISPR/Cas" . مجلة Cell . 153 (4): 910-918 . doi : 10.1016/j.cell.2013.04.025 . ISSN 1097-4172 . PMC 3969854. PMID 23643243 .   
  12. ↑ وادا، تاكاهيتو؛ فوكوشيما، يوشيميتسو؛ سايتو، شينجي (15 يوليو/تموز 2006). "طريقة جديدة للكشف عن طفرات جين ATRX باستخدام إنزيم نووي داخلي متخصص في عدم التطابق". المجلة الأمريكية لعلم الوراثة الطبية، الجزء أ . 140 (14): 1519-1523 . doi : 10.1002/ajmg.a.31310 . ISSN 1552-4825 . PMID 16763962. S2CID 6803312 .   
  13. ↑ بانوارث، سيلفي؛ بروكاسيو، فينسنت؛ باكي-فلوكلينجر، فيرونيك (1 يونيو 2005). "إنزيم النيوكلياز المساحي: استراتيجية جديدة لتحديد سريع لطفرات الحمض النووي للميتوكوندريا غير المتجانسة لدى المرضى الذين يعانون من عيوب في سلسلة التنفس" . الطفرات البشرية . 25 (6): 575-582 . doi : 10.1002/humu.20177 . ISSN 1098-1004 . PMID 15880407. S2CID 9919530 .   
  14. ↑ تان، يينغ-كاي؛ بلومنفيلد، جون د.؛ أنجيل، رالوكا؛ دوناهو، ستيفاني؛ بيلينكايا، ريما؛ بالينا، مارينا؛ باركر، توماس؛ ليفين، دانيال؛ ليونارد، ديبرا جي بي (1 فبراير 2009). "طريقة جديدة للتحليل الجينومي لطفرات PKD1 وPKD2 في مرض الكلى متعدد الكيسات السائد وراثيًا" . الطفرات البشرية . 30 (2): 264-273 . doi : 10.1002/humu.20842 . ISSN 1098-1004 . PMID 18837007. S2CID 5419679 .   
  15. ↑ فوسكاريدس، كونستانتينوس؛ دلتاس، كونستانتينوس (2009-07-01). "فحص الطفرات في الجينات المرتبطة بالكلى باستخدام نوكلياز SURVEYOR للقطع عند عدم تطابق الحمض النووي المزدوج غير المتجانس" . مجلة التشخيص الجزيئي . 11 (4): 311-318 . doi : 10.2353/jmoldx.2009.080144 . ISSN 1943-7811 . PMC 2710707. PMID 19525337 .   
  16. 1 2 إنجلمان، جيفري أ.؛ موكوهارا، تورو؛ زينولاهو، كريشنيك؛ ليفشيتس، يوجين؛ بوراس، آنا م.؛ غيل، كريستوفر مايكل؛ ناوموف، جورج ن.؛ ياب، بيو ي.؛ جاريل، إميلي (2006-10-01). "التخفيف الأليلي يحجب الكشف عن طفرة مقاومة ذات أهمية بيولوجية في سرطان الرئة المُضخّم لجين EGFR" . مجلة التحقيقات السريرية . 116 (10): 2695-2706 . doi : 10.1172/JCI28656 . ISSN 0021-9738 . PMC 1570180. PMID 16906227 .   
  17. ↑ جاكمان، ديفيد م.؛ هولمز، أليسون ج.؛ ليندمان، نيل؛ وين، باتريك ي.؛ كيساري، سانتوش؛ بوراس، آنا م.؛ بيلي، كريستوفر؛ دي يونغ، فرانسيسكا؛ يان، باسي أ. (2006-09-20). "الاستجابة والمقاومة لدى مريض مصاب بسرطان الرئة ذي الخلايا غير الصغيرة مع طفرة في مستقبل عامل نمو البشرة وانتقالات سحائية، عولج بجرعة عالية من جيفيتينيب" . مجلة علم الأورام السريري . 24 (27): 4517-4520 . doi : 10.1200/JCO.2006.06.6126 . ISSN 1527-7755 . PMID 16983123 .  
  18. ↑ جاكمان، ديفيد م.؛ ياب، بيو ي.؛ سيكويست، ليسيا ف.؛ ليندمان، نيل؛ هولمز، أليسون ج.؛ جوشي، فيكتوريا أ.؛ بيل، دافني و.؛ هوبرمان، مارك س.؛ هالموس، بالاز (2006-07-01). "ترتبط طفرات حذف الإكسون 19 لمستقبل عامل نمو البشرة بزيادة معدل البقاء على قيد الحياة لدى مرضى سرطان الرئة ذي الخلايا غير الصغيرة الذين عولجوا بالجيفيتينيب أو الإرلوتينيب" . مجلة أبحاث السرطان السريرية . 12 (13): 3908-3914 . doi : 10.1158/1078-0432.CCR-06-0462 . ISSN 1078-0432 . PMID 16818686 .  
  19. ↑ يان، باسي أ.؛ بوراس، آنا م.؛ كوانغ، يانان؛ روجرز، أندرو م.؛ جوشي، فيكتوريا أ.؛ لياناج، هيما؛ ليندمان، نيل؛ لي، جيفري س.؛ هالموس، بالاز (2006-02-01). "طريقة إنزيمية سريعة وحساسة لفحص طفرات مستقبل عامل نمو البشرة" . أبحاث السرطان السريرية . 12 (3 الجزء 1): 751-758 . doi : 10.1158/1078-0432.CCR-05-2047 . ISSN 1078-0432 . PMID 16467085 .  
  20. ↑ جاميسون، كاتريونا إتش إم؛ جوتليب، جيسون؛ دوروشيه، جيفري إيه؛ تشاو، مارك بي؛ ماريبان، إم راجان؛ لاي، مارلا؛ جونز، كارول؛ زيندر، جيمس إل؛ ليلبيرج، ستان إل. (18 أبريل 2006). "تحدث طفرة JAK2 V617F في الخلايا الجذعية المكونة للدم في كثرة الحمر الحقيقية، وتؤدي إلى التمايز إلى خلايا الدم الحمراء" . وقائع الأكاديمية الوطنية للعلوم في الولايات المتحدة الأمريكية . 103 (16): 6224-6229 . Bibcode : 2006PNAS..103.6224J . doi : 10.1073/pnas.0601462103 . ISSN 0027-8424 . PMC 1434515 . PMID 16603627 .   
  21. ↑ ساتلر، مارتن؛ والز، كريستوف؛ كراولي، برايان جيه؛ لينغفيلدر، إيفا؛ يان، باسي إيه؛ روجرز، أندرو إم؛ كوانغ، يانان؛ ديستل، روبرت جيه؛ رايتر، أندرياس (2006-02-01). "طريقة حساسة وعالية الإنتاجية للكشف عن الطفرات المنشطة لجين Jak2 في عينات الدم المحيطي" . مجلة الدم . 107 (3): 1237-1238 . doi : 10.1182/blood-2005-07-2899 . ISSN 0006-4971 . PMC 1895916. PMID 16434495 .   
  22. ↑ ميتاني، نورياكي؛ نيوا، يوشيماسا؛ أوكاموتو، ياسويوكي (1 نوفمبر 2007). "الكشف عن طفرات جين p53 في الأورام الدموية الخبيثة باستخدام نوكلياز المسح". حوليات الكيمياء الحيوية السريرية . 44 (الجزء 6): 557-559 . doi : 10.1258/000456307782268174 . ISSN 0004-5632 . PMID 17961311. S2CID 22933002 .   
  23. ^ شي، رويرو؛ أوتومو، كوجي؛ يامادا، هيرويوكي؛ تاتسومي، التايغا؛ سوجاوارا ، إيسامو (2006-01-01). "تحليل ثنائي الاتجاه بوساطة درجة الحرارة للكشف عن طفرات الجينات المقاومة للأدوية في العزلات السريرية لمرض السل المتفطرة عن طريق تغيير طبيعة HPLC، SURVEYOR nuclease" . الميكروبات والعدوى / معهد باستور . 8 (1): 128-135 . دوى : 10.1016/j.micinf.2005.06.008 . ردمك 1286-4579 . بميد 16182590 .