الرحلان الكهربائي على هلام متعدد الأكريلاميد

📅 آخر تحديث: ٤ أغسطس ٢٠٢٦
✍️ نُشر في: ٤ أغسطس ٢٠٢٦
📷 يحتوي على 9 صور
الموسوعة الحرة

صورة لرحلان كهربائي هلامي SDS-PAGE. توجد العلامات الجزيئية (السلم) في المسار الأيسر.

يُعدّ الفصل الكهربائي الهلامي متعدد الأكريلاميد ( PAGE ) [ 1 ] تقنيةً شائعة الاستخدام في الكيمياء الحيوية ، والكيمياء الجنائية ، وعلم الوراثة ، والبيولوجيا الجزيئية ، والتكنولوجيا الحيوية ، لفصل الجزيئات الحيوية الكبيرة ، وعادةً ما تكون بروتينات أو أحماض نووية ، وفقًا لحركتها الكهربائية . وتعتمد هذه الحركة على طول الجزيء، وبنيته، وشحنته. ويُعتبر الفصل الكهربائي الهلامي متعدد الأكريلاميد أداةً فعّالة لتحليل عينات الحمض النووي الريبوزي (RNA). فعندما يُخضع هلام متعدد الأكريلاميد لعملية التمسخ بعد الفصل الكهربائي، فإنه يُوفّر معلوماتٍ حول تركيب أنواع الحمض النووي الريبوزي في العينة. [ 2 ]

يؤدي ترطيب الأكريلونيتريل إلى تكوين جزيئات الأكريلاميد ( C₃H₅NO ) بواسطة إنزيم هيدراتاز النتريل . [ 3 ] يكون مونومر الأكريلاميد في حالة مسحوق قبل إضافة الماء. يُعد الأكريلاميد سامًا للجهاز العصبي البشري، لذا يجب اتباع جميع إجراءات السلامة عند التعامل معه. يذوب الأكريلاميد في الماء، وعند إضافة مُحفزات الجذور الحرة، يتفاعل مُتبلمرًا مُؤديًا إلى تكوين بولي أكريلاميد. [ 3 ] من المفيد تحضير هلام بولي أكريلاميد عن طريق ترطيب الأكريلاميد، حيث يُمكن التحكم في حجم المسام. تؤدي زيادة تركيز الأكريلاميد إلى تقليل حجم المسام بعد البلمرة. يُساعد هلام بولي أكريلاميد ذو المسام الصغيرة على فحص الجزيئات الصغيرة بشكل أفضل، حيث يُمكن للجزيئات الصغيرة الدخول إلى المسام والتحرك عبر الهلام، بينما تُحاصر الجزيئات الكبيرة عند فتحات المسام.

كما هو الحال مع جميع أنواع الفصل الكهربائي الهلامي ، يمكن فصل الجزيئات في حالتها الأصلية ، مما يحافظ على بنيتها ثلاثية الأبعاد. تُسمى هذه الطريقة الفصل الكهربائي الهلامي الأصلي (Native PAGE). بدلاً من ذلك، يمكن إضافة عامل مُفسِّخ كيميائي لإزالة هذه البنية وتحويل الجزيء إلى جزيء غير مُهيكل تعتمد حركته فقط على طوله (لأن مُركبات البروتين مع كبريتات دوديسيل الصوديوم (SDS ) لها جميعًا نسبة كتلة إلى شحنة مُتشابهة). يُعد الفصل الكهربائي الهلامي متعدد الأكريلاميد مع كبريتات دوديسيل الصوديوم ( SDS-PAGE ) طريقة لفصل الجزيئات بناءً على اختلاف أوزانها الجزيئية. عند درجة الحموضة التي يُجرى عندها الفصل الكهربائي الهلامي، تكون جزيئات SDS سالبة الشحنة وترتبط بالبروتينات بنسبة مُحددة، جزيء واحد من SDS لكل حمضين أمينيين تقريبًا. [ 4 ] : ​​164-179 وبهذه الطريقة، يُوفر المُنظف لجميع البروتينات نسبة شحنة إلى كتلة مُوحدة. يرتبط المنظف بالبروتينات، فيدمر بنيتها الثانوية والثالثية و/أو الرباعية، مما يؤدي إلى تمسخها وتحويلها إلى سلاسل ببتيدية خطية سالبة الشحنة. عند تعريضها لمجال كهربائي في هلام البولي أكريلاميد (PAGE)، تتحرك هذه السلاسل الببتيدية سالبة الشحنة نحو المصعد بدرجات متفاوتة من الحركة. تتناسب حركتها، أو المسافة التي تقطعها الجزيئات، عكسيًا مع لوغاريتم وزنها الجزيئي. [ 5 ] وبمقارنة النسبة النسبية للمسافة التي يقطعها كل بروتين إلى طول الهلام (Rf)، يمكن استنتاج الوزن الجزيئي النسبي للبروتينات، حيث يتحدد طول الهلام بالمسافة التي يقطعها جزيء صغير، مثل صبغة التتبع. [ 6 ]

بالنسبة للأحماض النووية، يُعد اليوريا أكثر المواد المُسخِّنة شيوعًا. أما بالنسبة للبروتينات، فيُستخدم دوديسيل كبريتات الصوديوم (SDS) كمنظف أنيوني يُطبَّق على عينات البروتين لتغليفها، مما يُكسب كل حمضين أمينيين في البروتين المُسخَّن شحنتين سالبتين (من كل جزيء SDS). [ 4 ] : ​​161-3. كما يُمكن استخدام 2-مركابتوإيثانول لكسر روابط ثنائي الكبريتيد الموجودة بين مُركَّبات البروتين، مما يُساعد على زيادة تمسخ البروتين. في مُعظم البروتينات، يُؤدي ارتباط SDS بسلاسل الببتيد إلى توزيع مُتساوٍ للشحنة لكل وحدة كتلة، مما يُؤدي إلى فصل البروتينات حسب الحجم التقريبي أثناء الفصل الكهربائي. أما البروتينات ذات المحتوى الكاره للماء العالي - على سبيل المثال، العديد من البروتينات الغشائية، وتلك التي تتفاعل مع المواد الخافضة للتوتر السطحي في بيئتها الطبيعية - فيصعب معالجتها بدقة باستخدام هذه الطريقة، نظرًا لزيادة التباين في نسبة SDS المرتبط. [ 7 ] من الناحية الإجرائية، يمكن استخدام كل من تقنية الفصل الكهربائي الهلامي الأصلي (Native-PAGE) وتقنية الفصل الكهربائي الهلامي SDS-PAGE معًا لتنقية البروتين وفصل وحداته الفرعية المختلفة. تحافظ تقنية Native-PAGE على الشكل الأوليغوميري سليمًا، وتُظهر حزمة على الهلام تمثل مستوى النشاط. أما تقنية SDS-PAGE فتُفكك الشكل الأوليغوميري وتفصله إلى وحداته الأحادية، مُظهرةً حزمًا تمثل أوزانها الجزيئية. يمكن استخدام هذه الحزم لتحديد البروتين وتقييم نقائه. [ 4 ] : ​​161-163

إجراء

تحضير العينة

قد تكون العينات أي مادة تحتوي على بروتينات أو أحماض نووية. ويمكن أن تكون هذه المواد مشتقة بيولوجيًا، على سبيل المثال من خلايا بدائية النواة أو حقيقية النواة، أو أنسجة، أو فيروسات، أو عينات بيئية، أو بروتينات نقية. في حالة الأنسجة أو الخلايا الصلبة، غالبًا ما تُفكك ميكانيكيًا أولًا باستخدام الخلاط (للعينات ذات الأحجام الكبيرة)، أو باستخدام جهاز التجنيس (للعينات ذات الأحجام الصغيرة)، أو باستخدام جهاز الموجات فوق الصوتية ، أو باستخدام دورات الضغط العالي. ويمكن استخدام مزيج من التقنيات الكيميائية الحيوية والميكانيكية - بما في ذلك أنواع مختلفة من الترشيح والطرد المركزي - لفصل حجيرات الخلية المختلفة وعضياتها قبل الفصل الكهربائي. كما يمكن استخدام جزيئات حيوية اصطناعية مثل قليل النوكليوتيدات كمواد تحليلية.

اختزال رابطة ثنائي الكبريتيد النموذجية بواسطة DTT من خلال تفاعلي تبادل متتاليين بين الثيول وثنائي الكبريتيد .

يمكن مزج العينة المراد تحليلها، اختيارياً، بمادة كيميائية مُفسِّخة، وعادةً ما تكون كبريتات دوديسيل الصوديوم (SDS) للبروتينات أو اليوريا للأحماض النووية. كبريتات دوديسيل الصوديوم (SDS) منظف أنيوني يُفسِّخ البنية الثانوية والبنية الثالثية غير المرتبطة بروابط ثنائية الكبريتيد، كما يُضفي شحنة سالبة على كل بروتين تتناسب مع كتلته. أما اليوريا، فتُكسر الروابط الهيدروجينية بين أزواج القواعد في الحمض النووي، مما يؤدي إلى انفصال السلاسل المكونة له. ويُعزز تسخين العينات إلى 60 درجة مئوية على الأقل عملية التفسُّخ. [ 8 ] [ 9 ] [ 10 ] [ 11 ] 

بالإضافة إلى استخدام كبريتات دوديسيل الصوديوم (SDS)، يمكن تسخين البروتينات لفترة وجيزة إلى درجة حرارة قريبة من الغليان بوجود عامل مُختزل، مثل ثنائي ثيوتريتول (DTT) أو 2-مركابتوإيثانول (بيتا-مركابتوإيثانول/BME) ، مما يزيد من تمسخ البروتينات عن طريق اختزال روابط ثنائي الكبريتيد، وبالتالي التغلب على بعض أشكال الطي البروتيني الثلاثي، وتفكيك البنية البروتينية الرباعية (الوحدات الفرعية قليلة الوحدات). يُعرف هذا باسم الفصل الكهربائي الهلامي SDS-PAGE المُختزل.

يمكن إضافة صبغة تتبع إلى المحلول. تتميز هذه الصبغة عادةً بحركة كهربائية أعلى من المواد المراد تحليلها، مما يسمح للمُجرِّب بتتبع تقدم المحلول عبر الهلام أثناء عملية الفصل الكهربائي.

تحضير هلامات الأكريلاميد

تتكون الهلامات عادةً من الأكريلاميد، والبيس أكريلاميد ، ومادة مُفسِّخة اختيارية (مثل كبريتات دوديسيل الصوديوم أو اليوريا)، ومحلول منظم ذي درجة حموضة مُعدَّلة. يمكن إزالة الغازات من المحلول تحت فراغ لمنع تكوُّن فقاعات الهواء أثناء عملية البلمرة. بدلاً من ذلك، يمكن إضافة البيوتانول إلى هلام الفصل (للبروتينات) بعد صبه، حيث يُزيل البيوتانول الفقاعات ويجعل السطح أملسًا. [ 12 ] يُضاف مصدر للجذور الحرة ومُثبِّت، مثل بيرسلفات الأمونيوم و TEMED، لبدء عملية البلمرة. [ 13 ] يُنتج تفاعل البلمرة هلامًا بسبب إضافة البيس أكريلاميد، الذي يُمكنه تكوين روابط متقاطعة بين جزيئين من الأكريلاميد. يُمكن تغيير نسبة البيس أكريلاميد إلى الأكريلاميد لأغراض خاصة، ولكنها عادةً ما تكون جزءًا واحدًا من 35. كما يُمكن تغيير تركيز الأكريلاميد في الهلام، وعادةً ما يتراوح بين 5% و25%. تُعدّ الهلامات ذات النسب المئوية المنخفضة أفضل لفصل الجزيئات ذات الوزن الجزيئي العالي جدًا، بينما تتطلب البروتينات الأصغر نسبًا أعلى بكثير من الأكريلاميد. يتحدد متوسط ​​قطر مسام هلامات بولي أكريلاميد بالتركيز الكلي للأكريلاميدات (%T، حيث T = التركيز الكلي للأكريلاميد وبيس أكريلاميد) وتركيز عامل الربط المتشابك بيس أكريلاميد (%C، حيث C = تركيز بيس أكريلاميد). [ 14 ] يتناسب حجم المسام عكسيًا مع %T. بالنسبة لـ %C، ينتج عن تركيز 5% أصغر المسام، نظرًا لأن تأثير بيس أكريلاميد على حجم المسام يأخذ شكل قطع مكافئ رأسه عند 5%.

تُحضّر المواد الهلامية عادةً بين لوحين زجاجيين في جهاز صبّ الهلام، حيث يُدخل مشط في الأعلى لإنشاء تجاويف العينات. بعد اكتمال عملية البلمرة، يُزال المشط ويصبح الهلام جاهزًا للفصل الكهربائي.

الرحلان الكهربائي

تُستخدم أنظمة محاليل منظمة متنوعة في تقنية الفصل الكهربائي الهلامي متعدد الأكريلاميد (PAGE) تبعًا لطبيعة العينة والهدف التجريبي. وقد تكون المحاليل المنظمة المستخدمة عند المصعد والمهبط متطابقة أو مختلفة. [ 10 ] [ 15 ] [ 16 ]

يُطبَّق مجال كهربائي عبر الهلام، مما يدفع البروتينات أو الأحماض النووية سالبة الشحنة إلى الهجرة عبر الهلام بعيدًا عن القطب السالب (الكاثود، نظرًا لأن هذه خلية تحليلية وليست جلفانية) ونحو القطب الموجب (الأنود). وبحسب حجمها، تتحرك كل جزيئة حيوية بشكل مختلف عبر مصفوفة الهلام: فالجزيئات الصغيرة تمر بسهولة أكبر عبر مسام الهلام، بينما تواجه الجزيئات الأكبر صعوبة أكبر. يُجرى اختبار الهلام عادةً لبضع ساعات، مع العلم أن هذه المدة تعتمد على الجهد الكهربائي المُطبَّق عبر الهلام؛ إذ تحدث الهجرة بسرعة أكبر عند الجهود العالية، لكن هذه النتائج عادةً ما تكون أقل دقة مقارنةً بتلك المُسجَّلة عند الجهود المنخفضة. بعد انقضاء المدة المحددة، تكون الجزيئات الحيوية قد هاجرت مسافات مختلفة بناءً على حجمها. تتحرك الجزيئات الحيوية الأصغر مسافة أبعد في الهلام، بينما تبقى الجزيئات الأكبر أقرب إلى نقطة المنشأ. وبالتالي، يمكن فصل الجزيئات الحيوية تقريبًا وفقًا لحجمها، والذي يعتمد بشكل أساسي على الوزن الجزيئي في ظروف التمسخ، ولكنه يعتمد أيضًا على البنية الفراغية ذات الترتيب الأعلى في الظروف الطبيعية. تُعرَّف حركة الهلام بأنها معدل انتقال الجزيئات عند فرق جهد مقداره 1 فولت/سم، ووحدتها سم² / ثانية/فولت. [ 4 ] : ​​161-163. ولأغراض التحليل، تُرسم الحركة النسبية للجزيئات الحيوية، Rf ، وهي نسبة المسافة التي قطعتها الجزيئة على الهلام إلى إجمالي مسافة انتقال صبغة التتبع، مقابل الوزن الجزيئي للجزيئة (أو أحيانًا لوغاريتم الوزن الجزيئي، أو بالأحرى نصف قطر الجزيئة Mr ) . تمثل هذه الرسوم البيانية الخطية عادةً المؤشرات القياسية أو منحنيات المعايرة المستخدمة على نطاق واسع للتقدير الكمي لأحجام الجزيئات الحيوية المختلفة. [ 4 ] : ​​161-163

مع ذلك، تتصرف بعض البروتينات السكرية بشكل غير طبيعي على هلامات SDS. بالإضافة إلى ذلك، يُذكر أن تحليل البروتينات الأكبر حجمًا التي يتراوح وزنها الجزيئي بين 250,000 و600,000 دالتون يمثل مشكلة أيضًا نظرًا لأن هذه الببتيدات تتحرك بشكل غير صحيح في أنظمة الهلام المستخدمة عادةً. [ 17 ]

مزيد من الإجراءات

صورتان لهلام SDS-PAGE بعد اكتمال التشغيل

بعد الفصل الكهربائي، يمكن تلوين الهلام (للبروتينات، يُستخدم عادةً أزرق كوماسي اللامع R-250 أو التصوير الإشعاعي الذاتي؛ وللأحماض النووية، يُستخدم بروميد الإيثيديوم ؛ أو لكليهما، يُستخدم التلوين الفضي )، مما يسمح برؤية البروتينات المفصولة، أو معالجته بشكل إضافي (مثل لطخة ويسترن ). بعد التلوين، تظهر الجزيئات الحيوية من الأنواع المختلفة على شكل نطاقات مميزة داخل الهلام. من الشائع استخدام علامات قياس الوزن الجزيئي ذات الوزن الجزيئي المعروف في مسار منفصل في الهلام لمعايرة الهلام وتحديد الكتلة الجزيئية التقريبية للجزيئات الحيوية غير المعروفة عن طريق مقارنة المسافة التي قطعتها بالنسبة للعلامة.

بالنسبة للبروتينات، يُعدّ الفصل الكهربائي الهلامي SDS-PAGE الخيار الأول عادةً لاختبار نقائها نظرًا لموثوقيته وسهولته. يعمل وجود SDS وخطوة التمسخ على فصل البروتينات، تقريبًا بناءً على حجمها، ولكن قد يحدث هجرة غير طبيعية لبعض البروتينات. كما قد تختلف البروتينات في تلوينها، مما يؤثر على التحديد الكمي باستخدام التلوين. يمكن أيضًا استخدام PAGE كتقنية تحضيرية لتنقية البروتينات. على سبيل المثال، يُعدّ الفصل الكهربائي الهلامي التحضيري الأصلي طريقة لفصل البروتينات المعدنية الأصلية في المصفوفات البيولوجية المعقدة. [ 18 ]

المكونات الكيميائية وأدوارها

عُرف هلام بولي أكريلاميد (PAG) كوسيط تضمين محتمل لتقطيع الأنسجة منذ عام 1964، واستخدمته مجموعتان بحثيتان مستقلتان في الرحلان الكهربائي عام 1959. [ 19 ] [ 20 ] يتميز هذا الهلام بعدة خصائص مرغوبة في الرحلان الكهربائي، مما يجعله وسطًا متعدد الاستخدامات. فهو هلام اصطناعي، مستقر حراريًا، شفاف، قوي، وخامل كيميائيًا نسبيًا، ويمكن تحضيره بنطاق واسع من أحجام المسام المتوسطة. [ 21 ] يتحدد حجم مسام الهلام وقابلية تكرار حجم مسامه بثلاثة عوامل: الكمية الإجمالية للأكريلاميد الموجودة (%T) (حيث T = التركيز الكلي للأكريلاميد ومونومر ثنائي أكريلاميد)، وكمية عامل الربط المتشابك (%C) (حيث C = تركيز ثنائي أكريلاميد)، ومدة بلمرة الأكريلاميد. يقل حجم المسام مع زيادة %T؛ ومع الربط المتشابك، يُعطي تركيز 5%C أصغر حجم للمسام. أي زيادة أو نقصان في نسبة C عن 5% يؤدي إلى زيادة حجم المسام، حيث أن حجم المسام بالنسبة لنسبة C دالة قطع مكافئ رأسها 5%C. ويبدو أن هذا يعود إلى عدم تجانس تكتل خيوط البوليمر داخل الهلام. كما أن مادة الهلام هذه تتحمل تدرجات الجهد العالية ، وتخضع لإجراءات تلوين وإزالة تلوين متنوعة، ويمكن هضمها لاستخلاص أجزاء منفصلة أو تجفيفها للتصوير الإشعاعي الذاتي والتسجيل الدائم.

عناصر

تتكون هلامات البولي أكريلاميد من هلام تكديس وهلام فصل. يتميز هلام التكديس بمسامية أعلى مقارنةً بهلام الفصل، مما يسمح للبروتينات بالهجرة في منطقة مركزة. بالإضافة إلى ذلك، عادةً ما يكون الرقم الهيدروجيني لهلام التكديس 6.8، لأن جزيئات الجليسين المتعادلة تسمح بحركة أسرع للبروتينات. أما هلام الفصل، فيبلغ الرقم الهيدروجيني له 8.8، حيث يبطئ الجليسين الأنيوني حركة البروتينات. يسمح هلام الفصل بفصل البروتينات ويتميز بمسامية أقل نسبيًا. في هذه الحالة، يتم فصل البروتينات بناءً على الحجم (في هلام SDS-PAGE) والحجم/الشحنة (في هلام Native PAGE). [ 22 ]

يعمل المحلول المنظم الكيميائي على تثبيت قيمة الرقم الهيدروجيني (pH) عند القيمة المطلوبة داخل الهلام نفسه وفي محلول الفصل الكهربائي. كما يؤثر اختيار المحلول المنظم على حركة الأيونات المضادة فيه أثناء الفصل الكهربائي ، وبالتالي على دقة فصل الهلام. يجب أن يكون المحلول المنظم غير متفاعل، أي لا يُعدّل أو يتفاعل مع معظم البروتينات. يمكن استخدام محاليل منظمة مختلفة كمحاليل للكاثود والأنود، على التوالي، حسب التطبيق. يمكن استخدام قيم متعددة للرقم الهيدروجيني داخل هلام واحد، كما هو الحال في الفصل الكهربائي بتقنية DISC. تشمل المحاليل المنظمة الشائعة في تقنية PAGE: Tris وBis-Tris والإيميدازول .

تعمل الأيونات المضادة على موازنة الشحنة الذاتية لأيون المحلول المنظم، كما تؤثر على شدة المجال الكهربائي أثناء عملية الفصل الكهربائي. غالبًا ما يتم تجنب الأيونات عالية الشحنة وسريعة الحركة في محاليل الكاثود في تقنية SDS-PAGE، ولكن يمكن تضمينها في الهلام نفسه، حيث تهاجر أمام البروتين. في تطبيقات مثل DISC SDS-PAGE، قد تختلف قيم الأس الهيدروجيني داخل الهلام لتغيير متوسط ​​شحنة الأيونات المضادة أثناء التشغيل لتحسين الدقة. من الأيونات المضادة الشائعة الجليسين والتريسين . يُستخدم الجليسين كمصدر للأيون المتأخر أو الأيون البطيء لأن قيمة pKa الخاصة به هي 9.69، وحركة الجليسينات تسمح بضبط الحركة الفعالة عند قيمة أقل من حركة أبطأ البروتينات المعروفة ذات الشحنة السالبة الصافية في نطاق الأس الهيدروجيني. الحد الأدنى للأس الهيدروجيني لهذا النطاق هو 8.0 تقريبًا.

عند إذابة الأكريلاميد ( C₃H₅NO ؛ الوزن الجزيئي: 71.08 ) في الماء، تحدث عملية بلمرة ذاتية بطيئة وتلقائية ، حيث ترتبط الجزيئات معًا بتكوين بوليمرات طويلة أحادية السلسلة عن طريق ربط الرأس بالذيل. يُسرّع وجود نظام مُولّد للجذور الحرة عملية البلمرة بشكل كبير. يُعرف هذا النوع من التفاعل باسم بلمرة إضافة الفينيل . يصبح محلول هذه السلاسل البوليمرية لزجًا ولكنه لا يُشكّل هلامًا، لأن السلاسل تنزلق ببساطة فوق بعضها البعض. يتطلب تكوين الهلام ربط سلاسل مختلفة معًا. الأكريلاميد مادة مسرطنة ، [ 23 ] وسم عصبي ، وسم تناسلي. [ 24 ] من الضروري أيضًا تخزين الأكريلاميد في مكان بارد ومظلم وجاف للحد من البلمرة الذاتية والتحلل المائي .

يُعدّ ثنائي أكريلاميد ( N , N′- ميثيلين ثنائي أكريلاميد ) ( C7H10N2O2 ؛ الوزن الجزيئي : 154.17 ) أكثر عوامل الربط المتشابك استخدامًا في هلامات البولي أكريلاميد. ويمكن اعتباره كيميائيًا جزيئين من الأكريلاميد مرتبطين رأسًا برأس عند نهايتيهما غير المتفاعلتين. يستطيع ثنائي أكريلاميد ربط سلسلتين من البولي أكريلاميد معًا، مما ينتج عنه هلام.

كبريتات دوديسيل الصوديوم (SDS) ( C12H25NaO4S ؛ الوزن الجزيئي : 288.38 ) (يُستخدم فقط في هلامات فصل البروتينات) هو عامل تنظيف قوي يُستخدم لفصل البروتينات الأصلية إلى عديدات ببتيد منفردة . لا يتم هذا الفصل، الذي يُشار إليه باسم الفصل الترميمي، عن طريق استقامة البروتين بالكامل، بل من خلال تغيير في بنيته الفراغية إلى مزيج من البنية العشوائية والحلزونية ألفا. [ 7 ] عند تسخين خليط البروتين إلى 100 درجة مئوية في وجود SDS، يلتف المنظف حول العمود الفقري لعديد الببتيد. ويرتبط بعديدات الببتيد بنسبة وزن ثابتة تبلغ 1.4 غرام من SDS لكل غرام من عديد الببتيد. في هذه العملية، تصبح الشحنات الذاتية لعديدات الببتيد ضئيلة مقارنةً بالشحنات السالبة التي يُساهم بها SDS. وبالتالي، تتحول عديدات الببتيد بعد المعالجة إلى تراكيب عصوية الشكل ذات كثافة شحنة منتظمة، أي شحنة سالبة صافية متساوية لكل وحدة وزن. وتعتمد سرعة الهجرة الكهربائية لهذه البروتينات خطيًا على لوغاريتمات أوزانها الجزيئية. في غياب كبريتات دوديسيل الصوديوم (SDS)، ستهاجر البروتينات المختلفة ذات الأوزان الجزيئية المتقاربة بشكل مختلف نتيجةً لاختلاف نسبة الكتلة إلى الشحنة، حيث يمتلك كل بروتين نقطة تعادل كهربائي ووزنًا جزيئيًا خاصًا ببنيته الأولية . يُعرف هذا باسم الهجرة الكهربائية الأصلية (Native PAGE ). يحل إضافة كبريتات دوديسيل الصوديوم هذه المشكلة، إذ يرتبط بالبروتين ويفككه، مما يُعطي شحنة سالبة شبه منتظمة على طول عديد الببتيد. 

اليوريا ( CO(NH₂ ) ₂ ؛ الوزن الجزيئي: 60.06) عامل فوضوي يزيد من إنتروبيا النظام عن طريق التدخل في التفاعلات الجزيئية الداخلية التي تتوسطها قوى غير تساهمية مثل الروابط الهيدروجينية وقوى فان دير فالس . يعتمد تركيب الجزيئات الكبيرة على التأثير الكلي لهذه القوى، وبالتالي فإن زيادة تركيز المواد المذابة الفوضوية تؤدي إلى تغيير طبيعة الجزيئات الكبيرة.

يُعد بيرسلفات الأمونيوم (APS) ( N₂H₈S₂O₈ ؛ الوزن الجزيئي : 228.2 ) مصدرًا للجذور الحرة، ويُستخدم غالبًا كمحفز لتكوين الهلام. ويُعتبر الريبوفلافين مصدرًا بديلًا للجذور الحرة ، حيث يُولّد الجذور الحرة في تفاعل كيميائي ضوئي .

يعمل رباعي ميثيل إيثيلين ديامين (TEMED ) ( C6H16N2 ؛ الوزن الجزيئي : 116.21 ) على تثبيت الجذور الحرة وتحسين عملية البلمرة. يعتمد معدل البلمرة وخصائص الهلام الناتج على تركيز الجذور الحرة. تؤدي زيادة كمية الجذور الحرة إلى انخفاض متوسط ​​طول سلسلة البوليمر ، وزيادة عكارة الهلام، وانخفاض مرونته. بينما يؤدي تقليل الكمية إلى عكس ذلك. ينبغي استخدام أقل تركيز تحفيزي يسمح بالبلمرة خلال فترة زمنية معقولة. يُستخدم كل من بيركبريتات الأمونيوم (APS) وTEMED عادةً بتراكيز متساوية تقريبًا تتراوح بين 1 و10 ملي مولار.

مواد كيميائية للمعالجة والتصوير

تم تصوير بروتينات فيروس الروتا باستخدام تقنية الفصل الكهربائي الهلامي (PAGE) بعد تلوينها بصبغة كوميسي الزرقاء.

تُستخدم المواد الكيميائية والإجراءات التالية لمعالجة الجل وعينات البروتين التي تظهر فيه.

صبغة التتبع: نظرًا لأن البروتينات والأحماض النووية عديمة اللون في الغالب، يصعب تتبع حركتها عبر الهلام أثناء الفصل الكهربائي. لذلك، تُضاف عادةً أصباغ أنيونية ذات حركة كهربائية معروفة إلى محلول عينة الفصل الكهربائي الهلامي متعدد الأكريلاميد (PAGE). من أشهر أصباغ التتبع صبغة بروموفينول الأزرق (BPB، 3',3",5',5" رباعي بروموفينول سلفون فثالين). تتلون هذه الصبغة في الوسط القلوي والمتعادل، وهي جزيء صغير سالب الشحنة يتحرك باتجاه المصعد . نظرًا لحركتها العالية، فإنها تسبق معظم البروتينات. عند وصولها إلى المصعد في وسط الفصل الكهربائي، يتوقف الفصل. يمكن أن ترتبط هذه الصبغة ببعض البروتينات بشكل ضعيف، مما يُكسبها لونًا أزرق. من أصباغ التتبع الشائعة الأخرى صبغة زيلين سيانول ، ذات الحركة الأقل، وصبغة أورانج جي ، ذات الحركة الأعلى.

وسائل التحميل: تُحمّل معظم أنظمة الفصل الكهربائي الهلامي متعدد الأكريلاميد (PAGE) من الأعلى في حُفر الهلام. ولضمان ترسب العينة في قاع الحُفر، يُضاف إلى محلول العينة موادٌ تزيد من كثافتها . يجب أن تكون هذه المواد غير أيونية وغير متفاعلة مع البروتينات لتجنب التداخل مع عملية الفصل الكهربائي. ومن المواد الشائعة في هذا السياق الجلسرين والسكروز .

يُعدّ صبغ كوماسي الأزرق اللامع R-250 (CBB) ( C45H44N3NaO7S2 ؛ الوزن الجزيئي : 825.97 ) أشهر صبغات البروتينات. وهو صبغ أنيوني يرتبط بالبروتينات بشكل غير انتقائي. يتميز تركيب CBB بأنه غير قطبي في الغالب، ويُستخدم عادةً في محلول ميثانولي مُحمّض بحمض الخليك . تُثبّت البروتينات في الهلام بواسطة حمض الخليك وتُصبغ في الوقت نفسه. يمكن إزالة الصبغ الزائد المُدمج في الهلام عن طريق إزالة الصبغة الزائدة باستخدام نفس المحلول الخالي من الصبغة. تظهر البروتينات على شكل أشرطة زرقاء على خلفية شفافة. ولأن كبريتات دوديسيل الصوديوم (SDS) أنيونية أيضًا، فقد تتداخل مع عملية الصبغ. لذلك، يُنصح باستخدام حجم كبير من محلول الصبغ، لا يقل عن عشرة أضعاف حجم الهلام.

يُعدّ بروميد الإيثيديوم (EtBr) صبغة شائعة للأحماض النووية. يسمح بروميد الإيثيديوم برؤية الحمض النووي (DNA) أو الحمض النووي الريبي (RNA) بسهولة على الهلام، حيث يُصدر لونًا برتقاليًا عند تعريضه للأشعة فوق البنفسجية. [ 25 ] يرتبط بروميد الإيثيديوم بسلاسل الأحماض النووية من خلال عملية التداخل. [ 4 ] على الرغم من شيوع استخدام بروميد الإيثيديوم، إلا أنه من المهم توخي الحذر عند استخدامه لأنه مادة مسرطنة معروفة . لهذا السبب، يختار العديد من الباحثين استخدام صبغات أخرى مثل SYBR Green و SYBR Safe ، وهي بدائل أكثر أمانًا لبروميد الإيثيديوم. [ 26 ] يُستخدم بروميد الإيثيديوم ببساطة عن طريق إضافته إلى خليط الهلام. بعد اكتمال عملية الفصل، يمكن معاينة الهلام باستخدام نظام توثيق فوتوغرافي. [ 4 ]

يُستخدم التلوين بالفضة عند الحاجة إلى طريقة أكثر حساسية للكشف، حيث أن التلوين التقليدي بصبغة كوماسي الزرقاء اللامعة قادر عادةً على الكشف عن  حزمة بروتينية بتركيز 50 نانوغرام، بينما يزيد التلوين بالفضة الحساسية بمقدار 10 إلى 100 ضعف. يعتمد هذا على كيمياء تحميض الصور الفوتوغرافية. تُثبّت البروتينات على الهلام باستخدام محلول ميثانول مخفف، ثم تُحضن مع محلول نترات الفضة الحمضي. تُختزل أيونات الفضة إلى شكلها المعدني بواسطة الفورمالديهايد عند درجة حموضة قلوية. يُوقف المحلول الحمضي، مثل حمض الخليك، عملية التحميض. [ 27 ] قدّم كيريني وغالياس التلوين بالفضة كإجراء حساس للكشف عن كميات ضئيلة من البروتينات في الهلام. [ 28 ] وُسّع نطاق هذه التقنية لدراسة جزيئات بيولوجية كبيرة أخرى فُصلت على دعامات متنوعة. [ 29 ] يمكن أن تؤثر العديد من المتغيرات على شدة اللون ، ولكل بروتين خصائصه الخاصة في التلوين. تُعدّ الأواني الزجاجية النظيفة والمواد الكيميائية النقية والماء عالي النقاء من أهمّ عوامل نجاح عملية التلوين. [ 30 ] طُوّرت تقنية التلوين بالفضة في القرن الرابع عشر لتلوين سطح الزجاج، واستُخدمت على نطاق واسع لهذا الغرض منذ القرن السادس عشر. تراوحت الألوان الناتجة عن التلوين بالفضة في بداياتها بين الأصفر الفاتح والبرتقالي المحمر. وقد أتقن كاميلو غولجي هذه التقنية لدراسة الجهاز العصبي ، حيث تقوم طريقته بتلوين عدد محدود من الخلايا بشكل عشوائي وكامل. [ 31 ]

تستخدم تقنية التصوير الإشعاعي الذاتي ، المستخدمة أيضاً للكشف عن نطاقات البروتين بعد الفصل الكهربائي الهلامي، النظائر المشعة لوسم البروتينات، والتي يتم الكشف عنها بعد ذلك باستخدام فيلم الأشعة السينية . [ 32 ]

يُعدّ التلطيخ الغربي عملية يتم فيها نقل البروتينات المفصولة في هلام الأكريلاميد كهربائيًا إلى غشاء ثابت قابل للتحكم، مثل غشاء النيتروسليلوز أو النايلون أو بولي فينيليدين ثنائي الفلوريد (PVDF). بعد ذلك، يُمكن تطبيق تقنيات الكيمياء المناعية لتصوير البروتينات المنقولة، بالإضافة إلى تحديد الزيادات أو النقصان النسبي في البروتين المطلوب بدقة.

انظر أيضاً

مراجع

  1. ↑ لوغان سي إم، رايس إم كيه (1987). اختصارات لوغان الطبية والعلمية (كتاب ذو غلاف مقوى). جيه بي ليبينكوت . ص  404. ISBN 0-397-54589-4.
  2. ↑ بيتروف أ، تسا أ، بوغليسي ج.د. (2013). "الفصل السادس عشر - تحليل الحمض النووي الريبي بواسطة الفصل الكهربائي الهلامي متعدد الأكريلاميد التحليلي". في لورش ج (محرر). طرق في علم الإنزيمات . المجلد 530. دار النشر الأكاديمية . الصفحات 301-313 . doi : 10.1016/B978-0-12-420037-1.00016-6 . ISBN   978-0-12-420037-1PMID 24034328​​ 
  3. 1 2 "بولي أكريلاميد" . الطبعة الأكاديمية على الإنترنت من موسوعة بريتانيكا . شركة موسوعة بريتانيكا ، 2017.
  4. 1 2 3 4 5 6 7 نينفا إيه جيه، بالو دي بي ، بينور إم (2010). مناهج المختبر الأساسية للكيمياء الحيوية والتكنولوجيا الحيوية ( الطبعة الثانية). هوبوكين، نيوجيرسي: جون وايلي وأولاده . ISBN  978-0-470-08766-4. OCLC 420027217 . 
  5. ↑ كيندت تي، غولدسبي آر ، أوزبورن بي (2007). علم المناعة لكوبي . نيويورك: دبليو إتش فريمان وشركاه . ص 553. ISBN  978-1-4292-0211-4.
  6. ↑ كومار أ، أواستي أ (2009). هندسة الفصل الحيوي . نيودلهي: دار نشر آي كي الدولية. ص 137. ISBN  978-93-80026-08-4.
  7. 1 2 راث أ، غليبوويكا م، نادو ف ج، وآخرون (2009). "ارتباط المنظفات يفسر الهجرة الشاذة لبروتينات الغشاء في هلام SDS-PAGE" . وقائع الأكاديمية الوطنية للعلوم في الولايات المتحدة الأمريكية 106 (6): 1760-1765 . Bibcode : 2009PNAS..106.1760R . doi : 10.1073/pnas.0813167106 . PMC 2644111. PMID 19181854 .   
  8. ↑ شابيرو، أ. ل.، فينيويلا، إ.، مايزل، ج. ف. الابن (1967). "تقدير الوزن الجزيئي لسلاسل البولي ببتيد بواسطة الرحلان الكهربائي في هلامات بولي أكريلاميد SDS". مجلة بحوث الكيمياء الحيوية والفيزياء الحيوية، 28 (5): 815-820 . doi : 10.1016/0006-291X(67)90391-9 . PMID 4861258 . 
  9. ↑ ويبر ك، أوزبورن م (1969). "موثوقية تحديد الوزن الجزيئي بواسطة الرحلان الكهربائي على هلام بولي أكريلاميد مع كبريتات دوديسيل" . مجلة الكيمياء البيولوجية . 244 (16): 4406-12 . doi : 10.1016/S0021-9258(18)94333-4 . PMID 5806584 . 
  10. 1 2 ليميللي ، المملكة المتحدة (1970). "انقسام البروتينات التركيبية أثناء تجميع رأس العاثية T4". مجلة نيتشر . 227 (5259): 680-685 . Bibcode : 1970Natur.227..680L . doi : 10.1038/227680a0 . PMID 5432063. S2CID 3105149 .  
  11. ↑ كابريت، د. ر. "SDS-PAGE" . العلوم البيولوجية التجريبية . تم الاطلاع عليه بتاريخ 27 سبتمبر 2009 .
  12. ↑ "ما معنى إزالة الغازات من مزيج جل الأكريلاميد؟" . بروتوكول أونلاين . 2006. تم الاطلاع عليه بتاريخ 28 سبتمبر 2009 .
  13. ↑ "SDS-PAGE" . مؤرشف من الأصل في 20 فبراير 2014. تم الاطلاع عليه في 12 سبتمبر 2009 .
  14. ↑ روشيل ر، ستير ر.ل، إيربي إ.ف (1978). "ملاحظات مجهرية إلكترونية نافذة لهلامات بولي أكريلاميد محفورة بالتجميد". مجلة الكروماتوغرافيا أ . 166 (2): 563-575 . doi : 10.1016/S0021-9673(00)95641-3 .
  15. ↑ شاغر هـ، فون ياغو ج (1987). "الرحلان الكهربائي الهلامي متعدد الأكريلاميد مع كبريتات دوديسيل الصوديوم ثلاثي السين لفصل البروتينات في نطاق من 1 إلى 100 كيلو دالتون". مجلة الكيمياء الحيوية التحليلية 166 (2): 368-379 . doi : 10.1016/0003-2697(87)90587-2 . PMID 2449095 . 
  16. ↑ أنكروز د (2007). "SDS-PAGE" . مختبر أندروز . مؤرشف من الأصل في 2 يوليو 2017. تم الاسترجاع في 27 سبتمبر 2009 .
  17. ↑ كواندت ن، ستيندل أ، كيلر يو (1993). "الرحلان الكهربائي على هلام بولي أكريلاميد مع كبريتات دوديسيل الصوديوم لتقدير الوزن الجزيئي للببتيدات عالية الوزن الجزيئي". مجلة الكيمياء الحيوية التحليلية 214 (2): 490-494 . doi : 10.1006/abio.1993.1527 . PMID 8109738 . 
  18. ↑ كاستنهولز، بيرند (2004). "الرحلان الكهربائي الهلامي المستمر التحضيري متعدد الأكريلاميد الأصلي (PNC-PAGE): طريقة فعالة لعزل العوامل المساعدة للكادميوم في الأنظمة البيولوجية" . رسائل تحليلية . 37 (4): 657-665 . doi : 10.1081/AL-120029742 . ISSN 0003-2719 . S2CID 97636537 .  
  19. ↑ ديفيس بي جيه، أورنشتاين إل (1959). "طريقة جديدة للرحلان الكهربائي عالي الدقة". تم تقديمها في جمعية دراسة الدم في أكاديمية نيويورك للطب .
  20. ↑ ريموند إس ، وينتروب إل (1959). "جل الأكريلاميد كوسيط داعم للرحلان الكهربائي النطاقي". مجلة ساينس . 130 (3377): 711. Bibcode : 1959Sci...130..711R . doi : 10.1126/science.130.3377.711 . PMID 14436634. S2CID 7242716 .  
  21. ↑ روشيل ر، ستير ر.ل، إيربي إ.ف (1978). "ملاحظات مجهرية إلكترونية نافذة لهلامات بولي أكريلاميد محفورة بالتجميد". مجلة الكروماتوغرافيا أ . 166 (2): 563-75 . doi : 10.1016/S0021-9673(00)95641-3 .
  22. ↑ دوشين إل جي، لام جيه إس، ماكدونالد إل إيه، وآخرون (1988). "تأثير الرقم الهيدروجيني وتركيز الأكريلاميد على فصل عديدات السكاريد الدهنية في هلامات البولي أكريلاميد". علم الأحياء الدقيقة الحالي . 16 (4): 191-194 . doi : 10.1007/BF01568528 . S2CID 932635 .  
  23. ↑ تاريك إي، ريدبيرغ ب، إريكسون س، وآخرون (2000). "الأكريلاميد: مادة مسرطنة في الطهي؟". مجلة أبحاث السموم الكيميائية 13 (6): 517-22 . doi : 10.1021/tx9901938 . PMID 10858325 .  
  24. ↑ لوباتشين ر (2004). "الرؤية المتغيرة لسمية الأكريلاميد العصبية". علم السموم العصبية . 25 (4): 617-30 . Bibcode : 2004NeuTx..25..617L . doi : 10.1016/j.neuro.2004.01.004 . PMID 15183015 . 
  25. ↑ سابنيس، ر. و. (2010). دليل الأصباغ والملونات البيولوجية: التركيب والتطبيقات الصناعية . هوبوكين، نيوجيرسي: وايلي-بلاك ويل. ISBN 978-0-470-40753-0. OCLC 647922579 . 
  26. ↑ سينغر، في. إل.، لولور، تي. إي.، يو، إس. (1999). "مقارنة بين قدرة صبغة SYBR Green I على إحداث الطفرات في هلام الحمض النووي وقدرة بروميد الإيثيديوم على إحداث الطفرات في اختبار الطفرة العكسية في السالمونيلا/الميكروسومات الثديية (اختبار أميس)". مجلة أبحاث الطفرات 439 (1): 37-47 . رمز Bibcode : 1999MRGTE.439...37S . doi : 10.1016/s1383-5718(98)00172-7 . PMID 10029672 . 
  27. ↑ نينفا إيه جيه، بالو دي بي (2004). مناهج المختبر الأساسية للكيمياء الحيوية والتكنولوجيا الحيوية . هوبوكين، نيوجيرسي: وايلي وأولاده. ISBN 978-1-891786-00-6. OCLC 633862582 . 
  28. ^ كيريني إل، جالياس إف (1973). ""مشكلة كمية في Auswertung der mit physikalischer Entwicklung versilberten Agarelektroforetogramme"." كلين. شيم. اكتا . 47 (3): 425-436 . دوى : 10.1016/0009-8981(73)90276-3 . بميد 4744834 . 
  29. ↑ سويتزر آر سي الثالث، ميريل سي آر، شيفرين إس (1979). "صبغة فضية عالية الحساسية للكشف عن البروتينات والببتيدات في هلامات البولي أكريلاميد". مجلة الكيمياء الحيوية التحليلية 98 (1): 231-237 . doi : 10.1016/0003-2697(79)90732-2 . PMID 94518 . 
  30. ↑ هيمبلمان إي، شولز إم، غوتزه أو (1984). "مجموعات SH الحرة مهمة للتلوين متعدد الألوان للبروتينات باستخدام نترات الفضة". في: نويوف في (محرر). الرحلان الكهربائي 84. فاينهايم: فيرلاغ كيمي. ص 328-330 . 
  31. ↑ جرانت، ج. (2007) . "كيف تقاسم غولجي وكاخال جائزة نوبل في الطب أو علم وظائف الأعضاء لعام 1906". مجلة أبحاث الدماغ ، 55 (2): 490-498 . doi : 10.1016/j.brainresrev.2006.11.004 . PMID 17306375. S2CID 24331507 .  
  32. ↑ سونغ د، ما س، خور س ب (2002). "تحليل صور الرحلان الكهربائي الهلامي والتصوير الإشعاعي الذاتي لتركيز الدواء البروتيني الموسوم إشعاعيًا في المصل لدراسات الحرائك الدوائية". مجلة الأساليب الدوائية والسمية . 47 (1): 59-66 . doi : 10.1016/s1056-8719(02)00203-4 . PMID 12387940 . 
  33. ↑ ميندي دي بي (2012). " تحديد استقرار البروتين الفيزيائي الحيوي في المستخلصات بواسطة اختبار التحلل البروتيني السريع، FASTpp" . PLOS One . 7 (10) e46147. Bibcode : 2012PLoSO...746147M . doi : 10.1371/journal.pone.0046147 . PMC 3463568. PMID 23056252 .  
  • صفحة بيانات السلامة (SDS-PAGE): كيف تعمل
  • فيديو توضيحي لصفحة بيانات السلامة (SDS-PAGE)
  • تبسيط فهم SDS-PAGE
  • حاسبة SDS-PAGE لإعداد وصفات مخصصة لهلامات اليوريا TRIS.
  • 2- الرحلان الكهربي للبروتينات الأبعادية
  • هيمبلمان إي. الفصل الكهربائي الهلامي للبروتينات باستخدام كبريتات دوديسيل الصوديوم (SDS-PAGE) والكشف عن البروتينات باستخدام التلوين الفضي والتلطيخ المناعي لبروتينات بلازموديوم فالسيباروم. في: مول ك، ليونغستروم ج، بيرلمان هـ، شيرف أ، والغرين م (محررون) طرق البحث في الملاريا، الطبعة الخامسة، 2008، 263-266