المجهر الإلكتروني النافذ وتسلسل الحمض النووي

كما هو الحال في تفاعل البوليميراز المتسلسل القياسي (PCR)، يجب فصل جزيئات الحمض النووي المزدوجة التي سيتم تسلسلها قبل أن يتم تصنيع السلسلة الثانية باستخدام النيوكليوتيدات الموسومة.

العناصر المكونة للجزيئات البيولوجية ( الكربون ، الهيدروجين ، النيتروجين ، الأكسجين ، الفوسفور ، الكبريت ) خفيفة جدًا ( عددها الذري منخفض، Z ) بحيث لا يمكن رؤيتها بوضوح كذرات منفردة باستخدام المجهر الإلكتروني النافذ . ولتجاوز هذه المشكلة، يمكن وسم قواعد الحمض النووي بذرات أثقل (عددها الذري أعلى، Z). يُوسم كل نيوكليوتيد بعلامة ثقيلة مميزة، مما يسمح بتمييزها في صورة المجهر الإلكتروني النافذ.

• تقترح شركة ZS Genetics استخدام ثلاثة علامات ثقيلة: البروم (Z=35)، واليود (Z=53)، وثلاثي كلورو الميثان (مجموع Z=63). ستظهر هذه العلامات على شكل بقع داكنة وفاتحة متباينة على الصورة المجهرية، بينما ستبقى قاعدة الحمض النووي الرابعة غير موسومة.
• تقترح شركة هالسيون موليكولار، بالتعاون مع مجموعة توست، إمكانية إضافة مجموعات وظيفية إلى قواعد البيورين والبيريميدين باستخدام ثنائي أمين البلاتين أو رباعي أكسيد الأوزميوم ثنائي البيريدين، على التوالي. ويمكن لذرات المعادن الثقيلة، مثل الأوزميوم (Z=76) أو الإيريديوم (Z=77) أو الذهب (Z=79) أو اليورانيوم (Z=92)، أن تُكوّن روابط فلزية-فلزية مع هذه المجموعات الوظيفية لتمييز القواعد الفردية. ^{[ 12 ]}

يجب فرد جزيئات الحمض النووي على سطح صلب رقيق بحيث يكون ترتيب القواعد المُعَلَّمة واضحًا في الصورة المجهرية الإلكترونية. يُعدّ التمشيط الجزيئي تقنيةً تستخدم قوة انحسار سطح التماس بين الهواء والماء لفرد جزيئات الحمض النووي، تاركةً إياها مرتبطةً بشكلٍ دائم بطبقة من السيلان بعد جفافها. ^{[ 13 ] [ 14 ]} هذه إحدى الوسائل التي يمكن من خلالها تحقيق محاذاة الحمض النووي على سطح صلب.

يُنتج المجهر الإلكتروني النافذ (TEM) صورًا عالية التكبير والدقة عن طريق تمرير حزمة من الإلكترونات عبر عينة رقيقة جدًا. وبينما تم إثبات دقة ذرية باستخدام المجهر الإلكتروني النافذ التقليدي، فإن تحسين الدقة المكانية يتطلب تصحيح الانحرافات الكروية واللونية لعدسات المجهر . وقد أصبح هذا ممكنًا فقط في المجهر الإلكتروني النافذ الماسح، حيث تُحصل الصورة عن طريق مسح الجسم بحزمة إلكترونية دقيقة التركيز، بطريقة مشابهة لأنبوب أشعة الكاثود . ومع ذلك، فإن التحسن المُحقق في الدقة يأتي مصحوبًا بتعريض الجسم المدروس لإشعاع ذي شدة حزمة أعلى بكثير، وما يترتب على ذلك من تلف في العينة وظهور تشوهات في الصورة. ^{[ 15 ]} وتُطبق تقنيات تصوير مختلفة اعتمادًا على ما إذا كانت العينة تحتوي على ذرات ثقيلة أو خفيفة.

• يقيس التصوير الحلقي ذو المجال المظلم تشتت الإلكترونات عند انحرافها عن أنوية الذرات في عينة المجهر الإلكتروني النافذ. ^{[ 5 ]} يُعد هذا الأسلوب الأمثل للعينات التي تحتوي على ذرات ثقيلة، لأنها تُسبب تشتتًا أكبر للإلكترونات. وقد استُخدمت هذه التقنية لتصوير ذرات خفيفة مثل البورون والنيتروجين والكربون ؛ ^{[ 5 ]} إلا أن الإشارة تكون ضعيفة جدًا بالنسبة لهذه الذرات الخفيفة. إذا استُخدم المجهر الحلقي ذو المجال المظلم في تسلسل الحمض النووي (DNA ) باستخدام المجهر الإلكتروني النافذ، فسيكون من الضروري بالتأكيد وسم قواعد الحمض النووي بذرات ثقيلة لضمان الحصول على إشارة قوية.
• يكشف التصوير الحلقي ذو المجال الساطع عن الإلكترونات التي تخترق العينة مباشرةً، ويقيس تداخل الموجات الناتج عن تفاعلاتها مع نوى الذرات. تتميز هذه التقنية بقدرتها على كشف الذرات الخفيفة بحساسية أعلى من طرق التصوير الحلقي ذي المجال المظلم. في الواقع، ^تم تصوير الأكسجين ^{[ 16 ]} ، والنيتروجين ^{[ 16 ]} ، والليثيوم ^{[ 17 ]} ، والهيدروجين ^{[ 18} ] في المواد الصلبة البلورية باستخدام المجهر الإلكتروني الحلقي ذي المجال الساطع. لذا، من الممكن نظريًا الحصول على صور مباشرة للذرات في سلسلة الحمض النووي DNA؛ إلا أن بنية الحمض النووي DNA أقل هندسية بكثير من المواد الصلبة البلورية، لذا قد لا يكون التصوير المباشر ممكنًا دون وسم مسبق.

يتم تحليل البقع الداكنة والساطعة على الصورة المجهرية الإلكترونية، والتي تتوافق مع قواعد الحمض النووي الموسومة بشكل مختلف، بواسطة برامج الكمبيوتر.

عند تسلسل الجينوم، يجب تقسيمه إلى أجزاء قصيرة بما يكفي لتسلسلها في قراءة واحدة. ثم تُعاد هذه القراءات إلى بعضها البعض كقطع أحجية، وذلك بمحاذاة المناطق المتداخلة بين القراءات؛ وتُسمى هذه العملية بتجميع الجينوم من الصفر . كلما زاد طول القراءة التي توفرها منصة التسلسل، زادت المناطق المتداخلة، وأصبح تجميع الجينوم أسهل. من الناحية الحسابية، لا يزال تسلسل سانجر الميكروفلويدي الطريقة الأكثر فعالية لتسلسل وتجميع الجينومات التي لا يوجد لها تسلسل جينومي مرجعي . توفر أطوال القراءة الطويلة نسبيًا تداخلًا كبيرًا بين قراءات التسلسل الفردية، مما يسمح بمزيد من الثقة الإحصائية في التجميع. بالإضافة إلى ذلك، تستطيع قراءات سانجر الطويلة تغطية معظم مناطق تسلسل الحمض النووي المتكرر التي قد تُعيق تجميع التسلسل بسبب التسبب في محاذاة خاطئة. مع ذلك، يُعد تجميع الجينوم من الصفر باستخدام تسلسل سانجر مكلفًا للغاية ويستغرق وقتًا طويلاً. على الرغم من أن تقنيات التسلسل من الجيل الثاني [ ^{19 ]} أقل تكلفة، إلا أنها غير مناسبة عمومًا لتجميع الجينوم من الصفر نظرًا لقصر طول قراءاتها. وبشكل عام، تهدف تقنيات التسلسل من الجيل الثالث ^{[ 11 ] ، بما في ذلك تسلسل الحمض النووي باستخدام} المجهر الإلكتروني النافذ، إلى تحسين طول القراءة مع الحفاظ على انخفاض تكلفة التسلسل. وبالتالي، مع تطور تقنيات التسلسل من الجيل الثالث، سيصبح تجميع الجينوم من الصفر بسرعة وبتكلفة منخفضة أمرًا ممكنًا.

النمط الفرداني هو سلسلة من الأليلات المرتبطة التي تُورَث معًا على كروموسوم واحد. يُمكن استخدام تسلسل الحمض النووي لتحديد النمط الجيني لجميع تعدد أشكال النوكليوتيدات المفردة (SNPs) التي تُشكِّل النمط الفرداني. مع ذلك، غالبًا ما يتعذر تحديد طور قراءات تسلسل الحمض النووي القصيرة؛ أي لا يُمكن إسناد المتغيرات غير المتجانسة إلى النمط الفرداني الصحيح بثقة. في الواقع، يتطلب تحديد النمط الفرداني باستخدام بيانات تسلسل الحمض النووي ذات القراءات القصيرة تغطية عالية جدًا (متوسط ​​تغطية يزيد عن 50 ضعفًا لكل قاعدة من قواعد الحمض النووي) لتحديد تعدد أشكال النوكليوتيدات المفردة بدقة، بالإضافة إلى بيانات تسلسل إضافية من الوالدين حتى يُمكن استخدام قوانين مندل لتقدير الأنماط الفردانية. ^{[ 20 ]} تستطيع تقنيات التسلسل التي تُنتج قراءات طويلة، بما في ذلك تسلسل الحمض النووي باستخدام المجهر الإلكتروني النافذ، التقاط كتل فردانية كاملة في قراءة واحدة. أي أن الأنماط الفردانية لا تتوزع على قراءات متعددة، وتبقى الأليلات المرتبطة جينيًا معًا في بيانات التسلسل. لذلك، فإن القراءات الطويلة تجعل تحديد النمط الفرداني أسهل وأكثر دقة، وهو أمر مفيد لمجال علم الوراثة السكانية .

توجد الجينات عادةً بنسختين في الجينوم البشري ثنائي الصيغة الصبغية ؛ وتُعرف الجينات التي تنحرف عن هذا العدد القياسي للنسخ باسم متغيرات عدد النسخ (CNVs) . قد يكون تباين عدد النسخ حميدًا (وهي عادةً متغيرات شائعة تُسمى تعدد أشكال عدد النسخ) أو مُمرضًا. ^{[ 21 ]} تُكتشف متغيرات عدد النسخ باستخدام التهجين الموضعي الفلوري (FISH) أو التهجين الجينومي المقارن (CGH) . للكشف عن نقاط الانقطاع المحددة التي يحدث عندها حذف، أو للكشف عن الآفات الجينومية الناتجة عن حدث تكرار أو تضخيم، يمكن إجراء التهجين الجينومي المقارن باستخدام مصفوفة متداخلة ( CGH المصفوفة )، أو يمكن تسلسل المنطقة المتغيرة. تُعد قراءات التسلسل الطويلة مفيدة بشكل خاص لتحليل التكرارات أو التضخيمات، حيث يُمكن تحليل اتجاه القطع المُضخمة إذا تم التقاطها في قراءة تسلسل واحدة.

علم جينوم السرطان، أو علم جينوم الأورام ، هو مجال ناشئ يُستخدم فيه تسلسل الحمض النووي عالي الإنتاجية من الجيل الثاني لتسلسل جينومات السرطان الكاملة. يشمل تحليل بيانات التسلسل ذات القراءات القصيرة جميع المشكلات المرتبطة بتجميع الجينوم من الصفر باستخدام هذه البيانات. ^{[ 22 ]} علاوة على ذلك، غالبًا ما تكون جينومات السرطان غير سوية الصبغيات . ^{[ 23 ]} يمكن تحليل هذه التشوهات، التي هي في الأساس اختلافات واسعة النطاق في عدد النسخ، باستخدام تقنيات التسلسل من الجيل الثاني من خلال تردد القراءة لتقدير عدد النسخ. ^{[ 22 ]} مع ذلك، فإن القراءات الأطول ستوفر صورة أكثر دقة لعدد النسخ، واتجاه المناطق المضخمة، والنيوكليوتيدات المفردة المتغيرة الموجودة في جينومات السرطان.

يشير مصطلح الميكروبيوم إلى مجمل الكائنات الدقيقة الموجودة في بيئة دقيقة، بالإضافة إلى جينوماتها. فعلى سبيل المثال، يُقدّر عدد الخلايا الميكروبية التي تستوطن جسم الإنسان في أي وقت بنحو 100 تريليون خلية. ^{[ 24 ]} ويحظى الميكروبيوم البشري باهتمام خاص، إذ تُعدّ هذه البكتيريا المتعايشة ضرورية لصحة الإنسان ومناعته. لم يتم بعد تحديد تسلسل معظم جينومات البكتيريا على سطح الأرض؛ ويتطلب تنفيذ مشروع تسلسل الميكروبيوم تجميعًا جينوميًا جديدًا واسع النطاق ، وهو أمر بالغ الصعوبة في ظل تقنيات تسلسل الحمض النووي ذات القراءات القصيرة. ^{[ 25 ]} من شأن القراءات الأطول أن تُسهّل بشكل كبير تجميع جينومات ميكروبية جديدة.

• أطوال قراءة أطول : قدّرت شركة ZS Genetics أطوال القراءة المحتملة لتسلسل الحمض النووي باستخدام المجهر الإلكتروني النافذ بما يتراوح بين 10,000 و20,000 زوج قاعدي، بمعدل 1.7 مليار زوج قاعدي يوميًا. ^{[ 7 ]} من شأن هذه الأطوال الطويلة للقراءة أن تُسهّل تجميع الجينوم من الصفر والكشف المباشر عن الأنماط الفردية، بالإضافة إلى تطبيقات أخرى. ^{[ 11 ]}
• انخفاض التكلفة : يُقدّر أن تكلفة تسلسل الحمض النووي باستخدام المجهر الإلكتروني النافذ تتراوح بين 5000 و10000 دولار أمريكي فقط لكل جينوم بشري، مقارنةً ببدائل تسلسل الحمض النووي من الجيل الثاني الأكثر تكلفة. ^{[ 10 ]}
• عدم حدوث فقدان التزامن : يُعدّ فقدان التزامن في خيوط الحمض النووي نتيجةً لفقدان التزامن أثناء عملية التخليق مشكلةً رئيسيةً في تقنيات التسلسل من الجيل الثاني. أما في تسلسل الحمض النووي باستخدام المجهر الإلكتروني النافذ، وفي العديد من تقنيات التسلسل الأخرى من الجيل الثالث، فلا حاجة لتزامن القراءات، إذ تُقرأ جزيئة واحدة فقط في كل مرة. ^{[ 7 ] [ 11 ]}
• تقليل وقت الإنجاز : إن القدرة على قراءة أجزاء الحمض النووي الأصلية تجعل تحضير القوالب المعقدة خطوة غير ضرورية في سير العمل العام لتسلسل الجينوم الكامل. وبالتالي، يصبح من الممكن تقليل وقت الإنجاز. ^{[ 11 ]}

• تكلفة رأسمالية مرتفعة : يتطلب تسلسل الحمض النووي باستخدام المجهر الإلكتروني النافذ ذي الدقة الكافية حوالي مليون دولار أمريكي، لذا فإن إجراء تسلسل الحمض النووي بهذه الطريقة يتطلب استثمارًا كبيرًا. ^{[ 10 ]}
• يمثل وضع علامات انتقائية على الذرات الثقيلة وربط الحمض النووي الموسوم بالركيزة وتقويمه تحديًا تقنيًا كبيرًا. [ ^{10 ] علاوة} على ذلك، يجب أن تكون عينة الحمض النووي مستقرة في ظل الفراغ العالي للمجهر الإلكتروني والتشعيع بحزمة مركزة من الإلكترونات عالية الطاقة.
• التحيز المحتمل في تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR) والشوائب : على الرغم من أن تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR) يُستخدم فقط في تسلسل الحمض النووي باستخدام المجهر الإلكتروني النافذ كوسيلة لوسم شريط الحمض النووي بذرات ثقيلة أو معادن، إلا أنه قد يكون هناك احتمال لإدخال تحيز في تمثيل القالب أو أخطاء أثناء عملية التضخيم الفردية. ^{[ 10 ]}

تم تطوير العديد من تقنيات تسلسل الحمض النووي من الجيل الثاني والثالث غير سانجر، أو يجري تطويرها حاليًا، بهدف مشترك هو زيادة الإنتاجية وخفض التكلفة بحيث يمكن تحقيق الطب الجيني الشخصي بشكل كامل.

تساهم كل من جائزة Archon X Prize لعلم الجينوم، التي تبلغ قيمتها 10 ملايين دولار أمريكي والمدعومة من مؤسسة X Prize (سانتا مونيكا، كاليفورنيا، الولايات المتحدة الأمريكية)، وجوائز المنح التي تبلغ قيمتها 70 مليون دولار أمريكي والمدعومة من المعهد الوطني لأبحاث الجينوم البشري التابع للمعاهد الوطنية للصحة (NIH-NHGRI)، في تحفيز النشاط البحثي السريع في تطوير تقنيات تسلسل الحمض النووي الجديدة. ^{[ 7 ]}

نظراً لاختلاف المناهج والتقنيات والاستراتيجيات التي تميز كل تقنية من تقنيات تسلسل الحمض النووي، فإن لكل منها نقاط قوة وضعف. ويُعرض في الجدول 1 مقارنة بين أهم المعايير في مختلف تقنيات تسلسل الحمض النووي من الجيلين الثاني والثالث.