تزامن الخلايا

(كانت تُسمى سابقًا: الطرد المركزي ذو التدفق المعاكس) يُمكن استخدام الطرد المركزي لفصل الخلايا في مراحل مختلفة من دورة الخلية بناءً على حجمها وسرعة ترسبها (المرتبطة بمعامل الترسيب ). نظرًا لأنماط النمو الثابتة طوال دورة الخلية، يُمكن للطرد المركزي فصل الخلايا إلى مراحل G1 و S و G2 و M عن طريق زيادة الحجم (وزيادة معاملات الترسيب)، مع انخفاض الدقة بين مرحلتي G2 وM بسبب عدم تجانس الخلايا وعدم وجود تغير واضح في الحجم. ^{[ 1 ]}

تترسب الخلايا الأكبر حجمًا بشكل أسرع، لذا فإن الخلية في المرحلة G2، التي خضعت لفترة نمو أطول، ستترسب أسرع من الخلية في المرحلة G1، وبالتالي يمكن فصلها. تميل الخلايا النامية في معلق إلى أن تكون أسهل في الفصل بالطرد المركزي نظرًا لعدم التصاقها ببعضها البعض وشكلها الدائري المنتظم. مع ذلك، يمكن معالجة بعض أنواع الخلايا الملتصقة بالتريبسين وإعادة تعليقها للفصل بالطرد المركزي، حيث ستتخذ شكلًا أكثر استدارة في المعلق. ^{[ 2 ]}

تتيح تقنية قياس التدفق الخلوي الكشف عن الخلايا وعدّها وقياس خصائصها الفيزيائية والكيميائية. تُعلق الخلايا في سائل وتُمرر عبر جهاز قياس التدفق الخلوي. تُمرر الخلايا واحدة تلو الأخرى عبر شعاع ليزر، ويُقاس تشتت الضوء بواسطة كاشف. يمكن وسم الخلايا أو مكوناتها بعلامات فلورية بحيث تُصدر أطوال موجية مختلفة من الضوء استجابةً لليزر، مما يسمح بجمع بيانات إضافية.

لتحليل دورة الخلية كميًا، تُثبّت الخلايا عادةً بالإيثانول وتُصبغ بأصباغ ترتبط بالحمض النووي مثل بروبيديوم يوديد ، وهوكست 33342 ، و DAPI ، و7-أمينوأكتينوميسين د ، وميثراميسين ، وDRAQ5 ، أو TO-PRO-3، مما يسمح بتحديد الطور من خلال كمية الحمض النووي. ^{[ 3 ]} مع ذلك، إذا تم تثبيت هذه الخلايا، فإنها تموت ولا يمكن الحفاظ عليها لمواصلة النمو. يمكن أيضًا إعادة تعليق الخلايا في وسط غذائي وصبغها بأصباغ غير سامة للحفاظ على مزارع حية. كما يمكن تعديل جينوم الخلايا بحيث تُصنع بعض البروتينات الخلوية مع علامات فلورية مترافقة مثل GFP و mCherry ولوسيفيراز ، والتي يمكن استخدامها للكشف عن هذه المكونات وقياس كميتها. على سبيل المثال، يمكن صنع تركيبات هيستون H2B -GFP هجينة واستخدامها لقياس محتوى الحمض النووي وتحديد حالة التضاعف كوسيلة لتمييز طور الخلية. ^{[ 4 ]} يمكن استخدام قياسات تشتت الضوء لتحديد خصائص مثل الحجم، مما يسمح بالتمييز بين مراحل الخلية دون الحاجة إلى وضع علامات.

يمكن استخدام أجهزة قياس التدفق الخلوي لجمع بيانات قياس التدفق الخلوي متعددة المعايير، ولكن لا يمكن استخدامها لفصل الخلايا أو تنقيتها. يُعد فرز الخلايا المنشط بالفلورة (FACS) تقنية لفرز الخلايا بناءً على الاختلافات التي يمكن رصدها من خلال تشتت الضوء (مثل حجم الخلية) أو انبعاث الفلورة (عن طريق اختراق الحمض النووي DNA أو RNA أو البروتينات أو المستضدات). يعمل النظام بشكل مشابه لقياس التدفق الخلوي، ولكنه يقوم أيضًا بشحن كل قطرة من الخلايا بعد قياسها بناءً على معيار محدد. ثم تواجه القطرة المشحونة نظام انحراف كهروستاتيكي يقوم بفرز الخلية إلى حاوية مختلفة بناءً على تلك الشحنة. يتيح ذلك فصل الخلايا بناءً على محتواها الفلوري أو تشتته.

باختصار، يمكن استخدام قياس التدفق الخلوي وحده لجمع بيانات كمية حول توزيع مراحل دورة الخلية، ولكن يمكن استخدامه بالتنسيق مع تقنية فرز الخلايا المنشطة بالفلورة (FACS) لجمع بيانات كمية وفصل الخلايا حسب المرحلة لإجراء المزيد من الدراسات. وتشمل القيود ما يلي:

• بالنسبة لقياسات تشتت الضوء، يكون التمييز ضعيفًا بين G2 و M (كما هو الحال مع الفصل بالطرد المركزي).
• بالنسبة للخلايا الثابتة، غير القادرة على الحفاظ على المزارع الحية
• بالنسبة للخلايا غير المثبتة ولكن المصبوغة، قد يحدث خلل أو طفرات في الخلايا بسبب معالجة الصبغة.
• قد يتم الحفاظ على بعض عدم تجانس السكان، حيث أن فصل الحجم قد لا يكون دقيقًا دائمًا لقياس المرحلة، وقد لا تكون جميع الخلايا في نفس النقطة داخل كل مرحلة (المرحلة G1 المبكرة مقابل المرحلة G1 المتأخرة).
• بالنسبة للخلايا المعدلة وراثيًا، قد تستغرق العملية فترة زمنية طويلة.

يمكن تحقيق توقف الانقسام الخلوي من خلال العديد من الطرق وفي نقاط مختلفة داخل طور الانقسام، بما في ذلك الانتقال من طور G2 إلى طور M، والانتقال من الطور الاستوائي إلى الطور الانفصالي، والخروج من الانقسام الخلوي.

عادةً ما يتضمن التوقف في طور S تثبيط تخليق الحمض النووي أثناء تضاعف الجينوم. ويمكن عكس معظم هذه الطرق عن طريق الغسل.

توجد طريقة كيميائية واحدة شائعة الاستخدام لمزامنة الخلايا في المرحلة G1. وتعتمد هذه الطريقة على دواء لوفاستاتين ، وهو مثبط تنافسي قابل للعكس لإنزيم مختزلة 3-هيدروكسي-3-ميثيل غلوتاريل-كوإنزيم أ ، وهو إنزيم حيوي في إنتاج حمض الميفالونيك . يُعد حمض الميفالونيك وسيطًا رئيسيًا في مسار الميفالونات المسؤول عن تخليق الكوليسترول . لا يؤدي إضافة الكوليسترول إلى الخلايا المعالجة باللوفاستاتين إلى إلغاء تأثير التوقف، لذا يبدو أن اللوفاستاتين يثبط تكوين بعض الوسائط المبكرة في المسار الضرورية للتقدم خلال المراحل المبكرة من المرحلة G1. ^{[ 12 ]}

الانتقاء الانقسامي هو إجراء خالٍ من الأدوية لاختيار الخلايا الانقسامية من طبقة أحادية تخضع لنمو أُسّي. ^{[ 13 ]} أثناء الانقسام، تخضع الخلايا لتغيرات في شكلها، ويستفيد الانتقاء الانقسامي من هذه التغيرات في الخلايا الملتصقة النامية في طبقة أحادية . تصبح الخلايا أكثر كروية، مما يقلل من مساحة سطح غشاء الخلية الملتصق بطبق الزراعة. وبالتالي، يمكن فصل الخلايا الانقسامية تمامًا عن طريق الرجّ الخفيف وجمعها من السائل الطافي . ^{[ 3 ]}

يؤدي إزالة المصل من وسط الاستنبات لمدة 24 ساعة تقريبًا إلى تراكم الخلايا عند نقطة الانتقال بين طور السكون G0 وبداية طور G1. ويمكن عكس هذا التوقف بسهولة بإضافة المصل أو المغذيات المحرومة. عند إزالة المصل، يكون تقدم دورة الخلية متفاوتًا، حيث تبقى بعض الخلايا _في حالة سكون بينما تتقدم خلايا أخرى في دورة الخلية بمعدلات متفاوتة. ^{[ 14 ]}

يحدث تثبيط التلامس عندما تُترك الخلايا لتنمو حتى تصل إلى كثافة عالية أو كاملة، مما يزيد من تلامسها مع بعضها البعض. يؤدي هذا إلى توقف دورة الخلية في المرحلة G1 المبكرة في الخلايا الطبيعية. ويمكن عكس هذا التوقف بإعادة زرع الخلايا بكثافة أقل. ^{[ 14 ]} ونظرًا للطفرات المحفزة للتكاثر المتأصلة في السرطان، فإن سلالات الخلايا السرطانية لا تستطيع عادةً الخضوع لتثبيط التلامس، على الرغم من وجود بعض الاستثناءات. ^{[ 15 ]}