الميتا-ترانسكريبتومية

يُعدّ HUMAnN2 نظامًا حيويًا معلوماتيًا مُصممًا من برنامج HUMAnN السابق، الذي طُوّر خلال مشروع الميكروبيوم البشري (HMP)، ويُطبّق نهج "البحث المُتدرّج". في المستوى الأول، يقوم HUMAnN2 بفحص قراءات الحمض النووي (DNA) أو الحمض النووي الريبوزي (RNA) باستخدام MetaPhlAn2 لتحديد الميكروبات المعروفة مسبقًا، وإنشاء قاعدة بيانات خاصة بكل عينة من خلال دمج الجينومات الشاملة للأنواع المُصنّفة. في المستوى الثاني، تُجري الخوارزمية عملية ربط للقراءات بقاعدة بيانات الجينوم الشامل المُجمّعة. في المستوى الثالث، تُستخدم القراءات غير المُحاذية لإجراء بحث مُترجم في قاعدة بيانات البروتينات. ^{[ 19 ]}

MetaTrans عبارة عن نظام معالجة بيانات يستغل تقنية تعدد الخيوط لتحسين الكفاءة. تُستخلص البيانات من تسلسل الحمض النووي الريبوزي (RNA-Seq) ثنائي الأطراف، وخاصةً من الحمض النووي الريبوزي 16S للتصنيف، ومن الحمض النووي الريبوزي الرسول (mRNA) لمستويات التعبير الجيني. ينقسم النظام إلى أربع خطوات رئيسية. أولًا، تُصفّى قراءات الحمض النووي الريبوزي ثنائي الأطراف لضمان الجودة، ثم تُفرز وتُصفّى للتحليل التصنيفي (عن طريق إزالة تسلسلات الحمض النووي الريبوزي الناقل tRNA) أو التحليل الوظيفي (عن طريق إزالة قراءات الحمض النووي الريبوزي الناقل tRNA والحمض النووي الريبوزي الريبوسومي rRNA). في التحليل التصنيفي، تُطابق التسلسلات مع قاعدة بيانات Greengenes v13.5 الخاصة بالحمض النووي الريبوزي الريبوسومي 16S باستخدام SOAP2، بينما في التحليل الوظيفي، تُطابق التسلسلات مع قاعدة بيانات وظيفية مثل MetaHIT-2014 باستخدام أداة SOAP2 أيضًا. يتميز هذا النظام بمرونة عالية، إذ يتيح إمكانية استخدام أدوات خارجية وتحسين الوحدات الفردية مع الحفاظ على البنية العامة. ^{[ 20 ]}

صُممت هذه المنظومة خصيصًا لتحليل بيانات الميتاترانسكريبتوميات، وذلك بالعمل بالتزامن مع خادم MG-RAST الخاص بالميتاجينوميات. تتميز هذه المنظومة بسهولة استخدامها، وقلة متطلباتها التقنية والحسابية، وإمكانية تطبيقها على نطاق واسع من الكائنات الدقيقة. في البداية، تُصفّى التسلسلات من بيانات التسلسل الخام لضمان جودتها، ثم تُرسل إلى MG-RAST (الذي يُجري خطوات إضافية مثل مراقبة الجودة، وتحديد الجينات، وتجميع تسلسلات الأحماض الأمينية ، واستخدام sBLAT على كل مجموعة لاكتشاف أفضل التطابقات). بعد ذلك، تُجمع التطابقات لأغراض التحليل التصنيفي والوظيفي. ^{[ 21 ]}

لا يحمل هذا المسار اسمًا رسميًا، ويُشار إليه عادةً باسم المؤلف الأول للمقالة التي وُصف فيها. تتضمن هذه الخوارزمية استخدام أدوات محاذاة مثل BLAST وMegaBLAST. تُجمّع القراءات في مجموعات من التسلسلات المتطابقة، ثم تُعالج لإزالة تسلسلات tRNA و rRNA باستخدام الحاسوب . بعد ذلك، تُربط القراءات المتبقية بقواعد بيانات NCBI باستخدام BLAST وMegaBLAST، ثم تُصنّف حسب قيمة البت الخاصة بها. تُستخدم التسلسلات ذات قيم البت الأعلى للتنبؤ بالأصل التطوري والوظيفة، بينما تُحاذى القراءات ذات القيم الأقل باستخدام BLASTX الأكثر حساسية، ويمكن في النهاية محاذاتها في قواعد بيانات البروتينات لتحديد وظيفتها. ^{[ 12 ]}

يُعدّ برنامج mOTUs2 ، ^{[ 22 ]} الذي يعتمد على جينات الصيانة الخلوية الأساسية ، مناسبًا تمامًا لتحديد كمية النشاط النسخي الأساسي لأفراد المجتمع الميكروبي. يختلف عدد النسخ لكل خلية بالنسبة لمعظم الجينات تبعًا للظروف البيئية. ويُستثنى من ذلك جينات الصيانة الخلوية التي تُعبّر عنها باستمرار وبتباين منخفض في ظل ظروف مختلفة. وبالتالي، يرتبط وفرة النسخ من هذه الجينات ارتباطًا وثيقًا بوفرة الخلايا النشطة في المجتمع الميكروبي.

برز الميكروبيوم المعوي في السنوات الأخيرة كعنصرٍ هام في صحة الإنسان. وتتمثل وظائفه الرئيسية في تخمير مكونات الطعام غير القابلة للهضم، ومنافسة مسببات الأمراض، وتقوية الحاجز المعوي، وتحفيز الجهاز المناعي وتنظيمه. ^{[23] [24] [25] [26] [27] [28 ] [29] على الرغم من التقدم الكبير الذي أُحرز في فهم مجتمع الميكروبيوم خلال السنوات الماضية ، إلا أن التنوع الهائل} للكائنات الدقيقة والجزيئات في الأمعاء يتطلب أدوات جديدة تُمكّن من اكتشافات جديدة. ومن خلال التركيز على التغيرات في التعبير الجيني، يُمكن لعلم الميتا-ترانسكريبتوم أن يُقدم صورة أكثر ديناميكية لحالة الميكروبيوم ونشاطه مقارنةً بعلم الميتاجينوم. وقد لوحظ أن الملامح الوظيفية للميتا-ترانسكريبتوم أكثر تنوعًا مما كان يُمكن استنتاجه من معلومات الميتاجينوم وحدها. وهذا يُشير إلى أن الجينات غير الأساسية لا تُعبر عنها بشكلٍ ثابت في موضعها الأصلي. ^{[ 30 ] [ 31 ]}

من الأمثلة على تطبيقات علم الجينوم الوظيفي دراسة الميكروبيوم المعوي في داء الأمعاء الالتهابي. داء الأمعاء الالتهابي (IBD) هو مجموعة من الأمراض المزمنة التي تصيب الجهاز الهضمي وتؤثر على ملايين الأشخاص حول العالم. ^{[ 32 ]} وقد رُبطت العديد من الطفرات الجينية البشرية بزيادة القابلية للإصابة بداء الأمعاء الالتهابي، ولكن هناك عوامل إضافية ضرورية لتطور المرض بشكل كامل.

فيما يتعلق بالعلاقة بين داء الأمعاء الالتهابي والميكروبيوم المعوي، من المعروف وجود خلل في التوازن الميكروبي لدى مرضى داء الأمعاء الالتهابي، إلا أن التركيب الميكروبي قد يختلف اختلافًا كبيرًا بين المرضى، مما يصعب معه تحديد أنواع أو سلالات ميكروبية معينة مسؤولة عن بدء المرض وتطوره. إضافةً إلى ذلك، يُظهر تركيب الميكروبيوم المعوي تباينًا كبيرًا بمرور الوقت بين الأفراد، مع وجود اختلافات أكثر وضوحًا لدى مرضى داء الأمعاء الالتهابي. ^{[ 33 ] [ 34 ]} لا توفر الإمكانات الوظيفية للكائن الحي، أي الجينات والمسارات المشفرة في جينومه، سوى معلومات غير مباشرة حول مستوى أو مدى تنشيط هذه الوظائف. لذا، يُعد قياس النشاط الوظيفي (التعبير الجيني) أمرًا بالغ الأهمية لفهم آلية خلل التوازن الميكروبي في الأمعاء.

تشير التغيرات في النشاط النسخي في مرض التهاب الأمعاء، والتي تم تحديدها بناءً على التعبير عن الحمض النووي الريبوزي، إلى أن بعض التجمعات البكتيرية نشطة لدى مرضى التهاب الأمعاء، بينما تكون مجموعات أخرى غير نشطة أو كامنة. ^{[ 35 ]}

يكشف تحليل الميتا-ترانسكريبتوميات، الذي يقيس النشاط الوظيفي للميكروبيوم المعوي، عن رؤى لا يمكن ملاحظتها إلا جزئيًا في الإمكانات الوظيفية للميتاجينوم، بما في ذلك الملاحظات المرتبطة بمرض التهاب الأمعاء. وقد أُفيد بأن العديد من الإشارات الخاصة بمرض التهاب الأمعاء إما أكثر وضوحًا أو لا يمكن اكتشافها إلا على مستوى الحمض النووي الريبوزي (RNA). ^{[ 33 ]} من المحتمل أن تكون أنماط التعبير المتغيرة هذه ناتجة عن تغيرات في بيئة الأمعاء لدى مرضى التهاب الأمعاء، والتي تشمل زيادة مستويات الالتهاب، وارتفاع تركيزات الأكسجين، وانخفاض طبقة المخاط. ^{[ 36 ]} يتميز الميتا-ترانسكريبتوميات بميزة تمكين الباحثين من تخطي فحص المنتجات الكيميائية الحيوية في الموقع (مثل المخاط أو الأكسجين)، ويتيح تقييم تأثيرات التغيرات البيئية على أنماط التعبير الميكروبي في الجسم الحي لدى مجموعات بشرية كبيرة. بالإضافة إلى ذلك، يمكن ربطه بأخذ عينات طولية لربط تعديل النشاط بتطور المرض. في الواقع، لقد ثبت أنه بينما قد يظل مسار معين مستقرًا بمرور الوقت على المستوى الجينومي، فإن التعبير المقابل يختلف باختلاف شدة المرض. ^{[ 33 ]} يشير هذا إلى أن اختلال التوازن الميكروبي يؤثر على صحة الأمعاء من خلال تغيير البرامج الجينية في بيئة ميكروبية مستقرة. وبهذا، يبرز تحليل الميتا-ترانسكريبتوم كأداة مهمة لفهم آليات هذه العلاقة.

ترتبط بعض القيود التقنية لقياسات الحمض النووي الريبي في البراز بحقيقة أن الحمض النووي الريبي المستخلص يمكن أن يتحلل، وإذا لم يتحلل، فإنه لا يزال يمثل فقط الكائنات الحية الموجودة في عينة البراز.

• الاستزراع الموجه: تم استخدامه لفهم التفضيلات الغذائية للكائنات الحية من أجل السماح بإعداد وسط استزراع مناسب، مما يؤدي إلى عزل ناجح للميكروبات في المختبر. ^{[ 1 ]}
• تحديد عوامل الضراوة المحتملة: من خلال علم النسخ المقارن، من أجل مقارنة الاستجابات النسخية المختلفة للسلالات أو الأنواع ذات الصلة بعد محفزات محددة.
• تحديد العمليات والتفاعلات البيولوجية الخاصة بالمضيف. لهذا الغرض، من المهم تطوير تقنيات جديدة تسمح بالكشف، في الوقت نفسه، عن التغيرات في مستويات التعبير عن بعض الجينات.

أمثلة على التقنيات المُطبقة: المصفوفات الدقيقة: تسمح برصد التغيرات في مستويات التعبير الجيني للعديد من الجينات بالتوازي لكل من العائل والممرض. وقد أظهرت أولى تطبيقات المصفوفات الدقيقة التحليل الشامل الأول لتغيرات التعبير الجيني في مسببات الأمراض مثل ضمة الكوليرا ، وبوريليا بورغدورفيري ، والمتدثرة الحثرية ، والمتدثرة الرئوية ، والسالمونيلا المعوية ، كاشفةً عن الاستراتيجيات التي تستخدمها هذه الكائنات الدقيقة للتكيف مع العائل. إضافةً إلى ذلك، لا تُقدم المصفوفات الدقيقة سوى رؤى شاملة أولية حول استجابة المناعة الفطرية للعائل تجاه الأنماط الجزيئية المرتبطة بمسببات الأمراض (PAMPs) ، مثل تأثيرات العدوى البكتيرية على التعبير عن عوامل العائل المختلفة. على أي حال، قد يكون الكشف عن كلا الكائنين في الوقت نفسه باستخدام المصفوفات الدقيقة أمرًا صعبًا. المشكلات:

• اختيار المجسات (مئات الملايين من المجسات المختلفة)
• التهجين المتبادل
• الحاجة إلى رقائق باهظة الثمن (بتصميم مناسب؛ مصفوفات عالية الكثافة)
• يتطلب الأمر فصل الخلايا المسببة للأمراض والخلايا المضيفة فعليًا قبل تحليل التعبير الجيني (حيث أن نسخ الخلايا حقيقية النواة أكبر مقارنة بنسخ مسببات الأمراض، لذلك قد يحدث أن تكون الإشارة من الحمض النووي الريبي لمسببات الأمراض مخفية).
• فقدان جزيئات الحمض النووي الريبي أثناء تحلل الخلايا حقيقية النواة .

تقنية تسلسل الحمض النووي الريبوزي المزدوج: تتيح هذه التقنية دراسة النسخ الجيني لكل من العائل والممرض في آن واحد. كما تُمكّن من رصد التعبير الجيني في مراحل مختلفة من عملية العدوى؛ ما يسمح بدراسة التغيرات في الشبكات الخلوية لكلا الكائنين، بدءًا من التلامس الأولي وحتى التلاعب بالعائل (التفاعل بين العائل والممرض).

• الإمكانات: لا حاجة إلى رقائق باهظة الثمن
• نهج مستقل عن المجسات (يوفر تسلسل الحمض النووي الريبوزي معلومات النسخ دون معرفة مسبقة بتسلسلات الحمض النووي الريبوزي الرسول)
• حساسية عالية.
• إمكانية دراسة مستويات التعبير حتى للجينات غير المعروفة في ظل ظروف مختلفة

علاوة على ذلك، يُعدّ تسلسل الحمض النووي الريبوزي (RNA-Seq) أسلوبًا مهمًا لتحديد الجينات المتشاركة في التنظيم، مما يُتيح تنظيم جينومات مسببات الأمراض في وحدات جينية (أوبرونات) . في الواقع، تمّت عملية توصيف الجينوم لبعض مسببات الأمراض حقيقية النواة، مثل المبيضات البيضاء (Candida albicans ) والتريبانوسوما البروسية (Trypanosoma brucei) والمتصورة المنجلية (Plasmodium falciparum ).

على الرغم من تزايد حساسية وعمق تقنيات التسلسل المتاحة حاليًا، لا تزال الدراسات المنشورة حول تسلسل الحمض النووي الريبوزي (RNA-Seq) فيما يتعلق باستجابة الخلية المضيفة الثديية للعدوى قليلة. ^{[ 37 ] [ 38 ]}