الطفرات الموجهة للموقع

الموسوعة الحرة

الطفرات الموجهة للموقع هي طريقة في البيولوجيا الجزيئية تُستخدم لإحداث طفرات محددة ومقصودة في تسلسل معين من الحمض النووي ، مثل جين ، أو في منتجاته الجينية . تُعرف أيضًا باسم الطفرات الموجهة للموقع أو الطفرات الموجهة بالأوليغونوكليوتيدات ، وتُستخدم على نطاق واسع لدراسة بنية ونشاط جزيئات الحمض النووي (DNA ) والحمض النووي الريبوزي ( RNA ) والبروتينات ، ولهندسة البروتينات . يشمل هذا المصطلح العديد من التقنيات التي تعمل بآليات متنوعة ومختلفة، ولكنها جميعًا تهدف إلى إحداث طفرة نيوكليوتيدية واحدة أو أكثر بدقة واستهداف (إما إدخالات أو حذف أو استبدالات) ضمن تسلسل محدد من الأحماض النووية.

لا تزال الطفرات الموجهة للموقع إحدى أهم الطرق المختبرية لإنشاء مكتبات الحمض النووي عن طريق إدخال طفرات في تسلسلات الحمض النووي، ولكن مع انخفاض تكاليف تصنيع النيوكليوتيدات من الصفر ، أصبح التخليق الجيني الاصطناعي بديلاً شائعًا بشكل متزايد لتعديل تسلسلات الحمض النووي الموجودة. ولا تزال التقنيات الجديدة لتحقيق الطفرات الموجهة للموقع قيد التطوير. على سبيل المثال، سمح تطوير تقنيات CRISPR /Cas9، القائمة على نظام دفاع فيروسي بدائي النواة، بالتعديل الدقيق والموجه للجينوم داخل الكائن الحي ، والذي يُعتبر أحيانًا نوعًا من الطفرات الموجهة للموقع. [ 1 ]

تاريخ

لم تكن المحاولات المبكرة للطفرات باستخدام الإشعاع أو المطفرات الكيميائية موجهة لمواقع محددة، بل كانت تُحدث طفرات عشوائية في مواقع غير متوقعة. [ 2 ] استُخدمت نظائر الأحماض النووية ومواد كيميائية أخرى لاحقًا لإحداث طفرات نقطية موضعية ؛ [ 3 ] ومن أمثلة هذه المواد الكيميائية الأمينوبورين ، [ 4 ] والنيتروسوغوانيدين ، [ 5 ] والبيسلفيت . [ 6 ] تحققت الطفرات الموجهة للموقع لأول مرة عام 1974 في مختبر تشارلز وايزمان باستخدام نظير النيوكليوتيد N4- هيدروكسي سيتيدين ، الذي يحفز طفرات انتقالية من GC إلى AT. [ 7 ] [ 8 ] ومع ذلك، فإن هذه الطرق للطفرات محدودة بأنواع الطفرات التي يمكنها إحداثها، وهي أكثر عرضة للتسبب في طفرات غير محددة خارج الهدف مقارنةً بطرق الطفرات الموجهة للموقع اللاحقة.

في عام 1971، أثبت كلايد هاتشيسون ومارشال إدجيل إمكانية إنتاج طفرات باستخدام أجزاء صغيرة من العاثية ΦX174 وإنزيمات القطع المحددة . [ 9 ] [ 10 ] لاحقًا، طور هاتشيسون بالتعاون مع مايكل سميث منهجًا أكثر مرونةً للطفرات الموجهة للموقع باستخدام قليل النوكليوتيدات في طريقة تمديد البادئ مع بوليميراز الحمض النووي . [ 11 ] تقديرًا لمساهمته في تطوير هذه العملية، تقاسم سميث جائزة نوبل في الكيمياء في أكتوبر 1993 مع كاري ب. موليس ، مخترع تفاعل البوليميراز المتسلسل .

الآلية الأساسية

تتطلب العملية الأساسية للطفرات الموجهة للموقع تصنيع بادئ أوليغونوكليوتيدي قصير من الحمض النووي . يحتوي هذا البادئ الاصطناعي على الطفرة المطلوبة، وهو مكمل لتسلسل الحمض النووي المحيط بموقع الطفرة، مما يسمح له بالتهجين مع قالب الحمض النووي. قد تتكون الطفرة من استبدال قاعدة واحدة أو أكثر ( طفرة نقطية )، أو حذف ، أو إدخال . يُستخدم البادئ أحادي السلسلة كنقطة بداية لتصنيع جزيء حمض نووي جديد بواسطة بوليميراز الحمض النووي ، الذي ينسخ باقي الجين من القالب المكمل. يحتوي الجزيء المُصنّع حديثًا على موقع الطفرة، ثم يُدخل إلى خلية مضيفة في ناقل بلازميدي ويُستنسخ . أخيرًا، يُستخدم تسلسل الحمض النووي للبلازميد المُستخلص من المستعمرات النامية من الخلايا المُحوّلة للتحقق من احتوائها على الطفرة المطلوبة.

الأساليب

كانت الطريقة الأصلية التي تستخدم تمديد البادئ الأحادي غير فعالة بسبب انخفاض إنتاج الطفرات. يحتوي هذا المزيج الناتج على كلٍ من القالب الأصلي غير المُطفر والسلسلة المُطفرة، مما يُنتج مجموعة مختلطة من النسل الطافر وغير الطافر. علاوة على ذلك، يكون القالب المستخدم مثيلًا بينما تكون السلسلة المُطفرة غير مثيلة، وقد يتم استبعاد الطفرات بسبب وجود نظام إصلاح عدم التطابق الذي يُفضل الحمض النووي القالب المُثيلي، مما يؤدي إلى عدد أقل من الطفرات. ومنذ ذلك الحين، تم تطوير العديد من الطرق لتحسين كفاءة الطفرات.

تتوفر الآن عدد كبير من التقنيات لتحقيق الطفرات الموجهة للموقع، [ 12 ] على الرغم من أن معظمها نادرًا ما تم استخدامه في المختبرات منذ أوائل العقد الأول من القرن الحادي والعشرين، حيث سمحت التقنيات الأحدث بطرق أسرع وأسهل لإدخال طفرات خاصة بالموقع في الجينات.

طريقة كونكل

في عام ١٩٨٥، قدّم توماس كونكل تقنيةً تُقلّل الحاجة إلى انتقاء الطفرات. [ ١٣ ] تُدخَل قطعة الحمض النووي المراد تحويرها في بلازميد بكتيريا مثل M13mp18/19 ، ثم تُحوَّل إلى سلالة من بكتيريا الإشريكية القولونية تفتقر إلى إنزيمين: ديوتروبيتاز ( dUTPase ) ويوراسيل ديجليكوسيداز ( udg ). يُعدّ كلا الإنزيمين جزءًا من مسار إصلاح الحمض النووي الذي يحمي الكروموسوم البكتيري من الطفرات عن طريق نزع الأمين التلقائي من ديسيتيدين ثلاثي الفوسفات (dCTP) إلى ديوتروبيتاز (dUTP ) . يمنع نقص إنزيم ديوتروبيتاز (dUTPase) تحلّل ديوتروبيتاز (dUTP)، مما يؤدي إلى ارتفاع مستواه في الخلية. أما نقص إنزيم يوراسيل ديجليكوسيداز (udg) فيمنع إزالة اليوراسيل من الحمض النووي المُصنَّع حديثًا. أثناء تضاعف الحمض النووي للفيروس في بكتيريا الإشريكية القولونية المتحولة المزدوجة ، قد تُدخل آلياتها الإنزيمية dUTP بدلاً من dTTP، مما ينتج عنه حمض نووي أحادي السلسلة يحتوي على بعض اليوراسيل (ssUDNA). يُستخلص ssUDNA من الفيروس الذي يُطلق في الوسط، ثم يُستخدم كقالب للطفرات. يُستخدم قليل النوكليوتيدات الذي يحتوي على الطفرة المطلوبة لتمديد البادئ. يتكون الحمض النووي الهجين الناتج من سلسلة أصلية غير متحولة تحتوي على dUTP وسلسلة متحولة تحتوي على dTTP. يُنقل الحمض النووي بعد ذلك إلى سلالة من الإشريكية القولونية تحمل جيني dut و udg من النوع البري . هنا، تتحلل سلسلة الحمض النووي الأصلية المحتوية على اليوراسيل، بحيث يتكون الحمض النووي الناتج بالكامل تقريبًا من السلسلة المتحولة.

الطفرات المستحثة بالكاسيت

على عكس الطرق الأخرى، لا تتطلب الطفرات الموجهة بالكاسيت استخدام إطالة البادئ باستخدام بوليميراز الحمض النووي. في هذه الطريقة، يتم تصنيع قطعة من الحمض النووي ثم إدخالها في بلازميد. [ 14 ] تتضمن هذه الطريقة قطعًا بواسطة إنزيم تقييد عند مواقع التقييد في البلازميد، ثم ربط زوج من النيوكليوتيدات المتكاملة التي تحتوي على الطفرة في الجين المستهدف بالبلازميد. عادةً ما تكون إنزيمات التقييد التي تقطع عند البلازميد والنيوكليوتيد هي نفسها، مما يسمح للأطراف اللزجة للبلازميد والقطعة المُدخلة بالارتباط ببعضها. يمكن لهذه الطريقة توليد طفرات بكفاءة تقارب 100%، ولكنها محدودة بتوافر مواقع التقييد المناسبة المحيطة بالموقع المراد تحويره.

الطفرات الموجهة للموقع بواسطة تفاعل البوليميراز المتسلسل

يوضح الشكل إحدى الطرق الشائعة لاستنساخ مكتبة الطفرات الموجهة للموقع (أي باستخدام قليل النوكليوتيدات المتغيرة). يتم تضخيم الجين المستهدف بواسطة تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR) باستخدام قليل النوكليوتيدات التي تحتوي على منطقة مكملة تمامًا للقالب (باللون الأزرق)، ومنطقة أخرى تختلف عن القالب بنوكليوتيد واحد أو أكثر (باللون الأحمر). يتم تجميع العديد من هذه البادئات التي تحتوي على تغير في المنطقة غير المكملة في نفس تفاعل PCR، مما ينتج عنه العديد من نواتج PCR المختلفة ذات الطفرات المختلفة في تلك المنطقة (الطفرات الفردية موضحة بألوان مختلفة أدناه).

يمكن التغلب على محدودية مواقع التقييد في الطفرات المُستحثة باستخدام الكاسيت باستخدام تفاعل البوليميراز المتسلسل مع بادئات قليلة النوكليوتيدات ، مما يُنتج قطعة أكبر تغطي موقعي تقييد مناسبين. يُنتج التضخيم الأسي في تفاعل البوليميراز المتسلسل قطعة تحتوي على الطفرة المطلوبة بكميات كافية لفصلها عن البلازميد الأصلي غير المُطفر بواسطة الرحلان الكهربائي الهلامي ، والتي يمكن بعد ذلك إدخالها في السياق الأصلي باستخدام تقنيات البيولوجيا الجزيئية المُعاد تركيبها القياسية. توجد العديد من الاختلافات لنفس التقنية. أبسط طريقة هي وضع موقع الطفرة بالقرب من أحد طرفي القطعة، حيث يحتوي أحد قليلي النوكليوتيدات المُستخدمين في توليد القطعة على الطفرة. تتضمن هذه الطريقة خطوة واحدة من تفاعل البوليميراز المتسلسل، ولكنها لا تزال تعاني من مشكلة أساسية تتمثل في الحاجة إلى موقع تقييد مناسب بالقرب من موقع الطفرة ما لم يتم استخدام بادئ طويل جدًا. لذا، تستخدم بعض الطرق الأخرى ثلاثة أو أربعة نيوكليوتيدات قليلة، اثنان منها قد يكونان نيوكليوتيدات غير مُطفرة تغطي موقعين مناسبين للتقييد، مما يُنتج قطعة قابلة للهضم والربط في بلازميد. أما النيوكليوتيد المُطفر فقد يكون مُكملاً لموقع داخل تلك القطعة بعيدًا عن أي موقع تقييد مناسب. تتطلب هذه الطرق عدة خطوات من تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR) لضمان احتواء القطعة النهائية المراد ربطها على الطفرة المطلوبة. قد تكون عملية تصميم قطعة تحتوي على الطفرة المطلوبة ومواقع التقييد المناسبة مُعقدة. يمكن لبرامج مثل SDM-Assist [ 15 ] تبسيط هذه العملية.

الطفرات التي تحدث في البلازميد الكامل

في مجال التلاعب بالبلازميدات، حلت تقنيات أخرى للتطفير الموجه للموقع محل تقنيات أخرى إلى حد كبير، وهي تقنيات عالية الكفاءة وبسيطة نسبيًا وسهلة الاستخدام ومتوفرة تجاريًا كمجموعة أدوات. ومن أمثلة هذه التقنيات طريقة "Quikchange" [ 16 ] ، حيث يُستخدم زوج من البادئات الطافرة المتكاملة لتضخيم البلازميد بأكمله في تفاعل تدوير حراري باستخدام بوليميراز DNA عالي الدقة لا يُزيح السلسلة، مثل بوليميراز Pfu . يُنتج التفاعل جزيء DNA دائريًا مُشقّقًا . يجب التخلص من قالب DNA عن طريق الهضم الأنزيمي باستخدام إنزيم تقييد مثل Dpn I ، وهو إنزيم متخصص في DNA المُمَثْيَل. جميع DNA المُتضاعف في خلايا معظم سلالات الإشريكية القولونية مُمَثْيَل. وبالتالي، سيتم هضم البلازميد القالب المُصنّع حيويًا في بكتيريا الإشريكية القولونية ، بينما سيبقى البلازميد المُطفر، المُنتج في المختبر وبالتالي غير المُمَثْيَل، دون هضم. تجدر الإشارة إلى أنه في طرق الطفرات هذه للبلازميد ثنائي السلاسل، ورغم إمكانية استخدام تفاعل التدوير الحراري، فإن الحمض النووي لا يتضاعف أُسّيًا إذا صُممت البادئتان بحيث ترتبطان بشكل متناظر بنفس المنطقة المحيطة بموقع الطفرة، كما هو موضح في البروتوكول الأصلي. في هذه الحالة، يكون التضخيم خطيًا، ولذلك من غير الدقيق وصف الإجراء بأنه تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR)، نظرًا لعدم وجود تفاعل متسلسل. مع ذلك، إذا صُممت البادئتان للارتباط بطريقة مُزاحة بحيث يكون موقع الطفرة قريبًا من النهاية 5' لكلتا البادئتين، فإن المناطق 3' للبادئتين يمكن أن ترتبط أيضًا بالمنتجات المُضخمة، وبالتالي يُلاحظ تكوين المنتج أُسّيًا. اسم "Quikchange" مشتق من العلامة التجارية المسجلة "QuikChange mutagenesis" لشركة ستراتاجين ، التي أصبحت الآن شركة أجيلنت تكنولوجيز ، والمخصصة لمجموعات الطفرات الموجهة للموقع. وقد طوّر هذه الطريقة علماء يعملون في شركة ستراتاجين. [ 16 ]

تجدر الإشارة إلى أن بوليميراز Pfu قد يُسبب إزاحة السلسلة عند درجات حرارة التمديد المرتفعة (≥70  درجة مئوية)، مما قد يؤدي إلى فشل التجربة، لذا يُنصح بإجراء تفاعل التمديد عند درجة الحرارة الموصى بها وهي 68  درجة مئوية. في بعض التطبيقات، لوحظ أن هذه الطريقة تؤدي إلى إدخال نسخ متعددة من البادئات. [ 17 ] يُمنع حدوث هذه التشوهات في طريقة مُعدّلة تُسمى SPRINP، وقد استُخدمت في أنواع مختلفة من الطفرات الموجهة للموقع. [ 17 ]

تستخدم تقنيات أخرى، مثل تقنية المسح الطفري للأهداف الموجهة بالأوليغونوكليوتيدات (SMOOT)، دمج الأوليغونوكليوتيدات المطفرة بشكل شبه عشوائي في عملية الطفرات البلازميدية. [ 18 ] ويمكن لهذه التقنية إنشاء مكتبات طفرات بلازميدية تتراوح من الطفرات الفردية إلى الطفرات الشاملة للرموز الجينية عبر جين كامل.

طرق الطفرات الموجهة للموقع في الجسم الحي

  • Delitto perfetto [ 19 ]
  • الانتقال "الظهور المفاجئ والاختفاء المفاجئ"
  • حذف الجينات المباشر والطفرات الموجهة للموقع باستخدام تفاعل البوليميراز المتسلسل وعلامة قابلة لإعادة التدوير
  • حذف الجينات المباشر والطفرات الموجهة للموقع باستخدام تفاعل البوليميراز المتسلسل وعلامة قابلة لإعادة التدوير باستخدام مناطق متماثلة طويلة
  • الطفرات الموجهة للموقع في الجسم الحي باستخدام قليل النوكليوتيدات الاصطناعية [ 20 ]

كريسبر

منذ عام 2013، أتاح تطوير تقنيات تحرير الجينوم CRISPR /Cas9 إمكانية إدخال طفرات متنوعة بكفاءة في الحمض النووي الجينومي لدى مجموعة واسعة من الكائنات الحية. لا تتطلب هذه الطريقة موقع إدخال ترانسبوزون ، ولا تترك أي علامة، وقد جعلتها كفاءتها وبساطتها الطريقة المفضلة لتحرير الجينوم. [ 21 ] [ 22 ]

التطبيقات

الطفرات التشبعية للموقع هي نوع من الطفرات الموجهة للموقع. تُظهر هذه الصورة الطفرات التشبعية لموقع واحد في بروتين نظري مكون من 10 أحماض أمينية. يظهر الشكل الطبيعي للبروتين في الأعلى، حيث يرمز الحرف M إلى الحمض الأميني الأول، وهو الميثيونين، بينما يرمز الحرف * إلى كودون التوقف الذي يُنهي عملية الترجمة. تظهر أدناه جميع الطفرات الـ 19 للإيزولوسين في الموقع 5.

تُستخدم الطفرات الموجهة للموقع لتوليد طفرات قد تنتج بروتينًا مصممًا بشكل عقلاني يتمتع بخصائص محسنة أو خاصة (أي هندسة البروتين).

تتيح أدوات البحث - الطفرات المحددة في الحمض النووي - دراسة وظيفة وخصائص تسلسل الحمض النووي أو البروتين بطريقة منهجية. علاوة على ذلك، يمكن أن تساعد تغييرات الأحماض الأمينية المفردة عن طريق الطفرات الموجهة للموقع في البروتينات على فهم أهمية التعديلات ما بعد الترجمة. على سبيل المثال، يؤدي تغيير سيرين معين (مستقبل للفوسفات) إلى ألانين (غير مستقبل للفوسفات) في بروتين الركيزة إلى منع ارتباط مجموعة الفوسفات، مما يسمح بدراسة الفسفرة. وقد استُخدم هذا النهج للكشف عن فسفرة بروتين CBP بواسطة كيناز HIPK2 [ 23 ]. وهناك نهج شامل آخر هو طفرات تشبع الموقع ، حيث يمكن استبدال كودون واحد أو مجموعة من الكودونات بجميع الأحماض الأمينية الممكنة في مواقع محددة [ 24 ] .

التطبيقات التجارية – يمكن هندسة البروتينات لإنتاج أشكال متحولة مصممة خصيصًا لتطبيق معين. على سبيل المثال، قد تحتوي منظفات الغسيل الشائعة الاستخدام على السبتيليزين ، الذي يحتوي شكله الطبيعي على ميثيونين يمكن أكسدته بواسطة المُبيّض، مما يقلل بشكل كبير من نشاط البروتين. [ 25 ] يمكن استبدال هذا الميثيونين بالألانين أو بقايا أخرى، مما يجعله مقاومًا للأكسدة، وبالتالي يحافظ على نشاط البروتين في وجود المُبيّض. [ 26 ]

تخليق الجينات

مع انخفاض تكلفة تصنيع قليل النوكليوتيدات من الحمض النووي، أصبح التخليق الاصطناعي لجين كامل من الصفر طريقةً فعّالة لإدخال الطفرات في الجينات. تتيح هذه الطريقة إجراء طفرات واسعة النطاق في مواقع متعددة، بما في ذلك إعادة تصميم استخدام الكودونات في الجين بالكامل لتحسين التعبير عنه في كائن حي معين. [ 27 ]

انظر أيضاً

مراجع

  1. ↑ هسو ، ب. د.، لاندر، إ. س.، تشانغ، ف. (يونيو 2014). "تطوير وتطبيقات تقنية كريسبر-كاس9 في هندسة الجينوم" . مجلة سيل . 157 (6): 1262-1278 . doi : 10.1016/j.cell.2014.05.010 . PMC 4343198. PMID 24906146 .  
  2. ↑ كيلبي، بي جيه (1995). " شارلوت أورباخ (1899-1994)" . علم الوراثة . 141 (1): 1-5 . doi : 10.1093/genetics/141.1.1 . PMC 1206709. PMID 8536959 .  
  3. ↑ شورتل، د.؛ ديمايو، د.؛ ناثانز، د. (1981). "الطفرات الموجهة". المراجعة السنوية لعلم الوراثة . 15 : 265-294 . doi : 10.1146/annurev.ge.15.120181.001405 . PMID 6279018 . 
  4. ^ كاراس، آي دبليو؛ ماكينيس، MA؛ بيرسينغ، د. كوفينو، ب. مارتن جونيور، DW (1982). "آلية طفرات 2-أمينوبورين في خلايا الساركومة اللمفاوية التائية في الفأر" . البيولوجيا الجزيئية والخلوية . 2 (9): 1096–1103 . دوى : 10.1128/MCB.2.9.1096 . بمك 369902 . بميد 6983647 .  
  5. ↑ ماكهيو، جي إل؛ ميلر، سي جي (1974). "عزل وتوصيف طفرات ببتيداز البرولين في السالمونيلا التيفية" . مجلة علم البكتيريا . 120 (1): 364-371 . doi : 10.1128/JB.120.1.364-371.1974 . PMC 245771. PMID 4607625 .  
  6. ↑ د. شورتل ود. ناثانز (1978). "الطفرات الموضعية: طريقة لتوليد طفرات فيروسية باستبدال القواعد في مناطق محددة مسبقًا من الجينوم الفيروسي" . وقائع الأكاديمية الوطنية للعلوم . 75 (5): 2170-2174 . Bibcode : 1978PNAS...75.2170S . doi : 10.1073/pnas.75.5.2170 . PMC 392513. PMID 209457 .  
  7. ↑ آر. إيه. فلافيل؛ دي. إل. سابو؛ إي. إف. باندل؛ وسي. وايسمان (1975). " الطفرات الموجهة للموقع: تأثير طفرة خارج الجين على تكاثر الحمض النووي الريبوزي (RNA) لفيروس العاثية Qbeta في المختبر" . وقائع الأكاديمية الوطنية للعلوم في الولايات المتحدة الأمريكية . 72 (1): 367-371 . Bibcode : 1975PNAS...72..367F . doi : 10.1073/pnas.72.1.367 . PMC 432306. PMID 47176 .  
  8. ↑ ويلي مولر؛ هانز ويبر؛ فرانسوا ماير؛ تشارلز فايسمان (1978). "الطفرات الموجهة للموقع في الحمض النووي: توليد طفرات نقطية في الحمض النووي التكميلي لجين بيتا غلوبين المستنسخ في المواضع المقابلة للأحماض الأمينية من 121 إلى 123". مجلة البيولوجيا الجزيئية . 124 (2): 343-358 . doi : 10.1016/0022-2836(78)90303-0 . PMID 712841 . 
  9. ↑ هاتشيسون الثالث، كاليفورنيا؛ إدجيل، إم إتش (1971). "فحص جيني لشظايا صغيرة من الحمض النووي الريبوزي منقوص الأكسجين لفيروس العاثية φX174" . مجلة علم الفيروسات . 8 (2): 181-189 . doi : 10.1128/JVI.8.2.181-189.1971 . PMC 356229. PMID 4940243 .  
  10. ↑ مارشال هـ. إدجيل، كلايد أ. هاتشيسون الثالث، ومورتون سكلير (1972). "شظايا محددة من الحمض النووي الريبوزي منقوص الأكسجين لفيروس العاثية X174 بواسطة الإندونوكلياز R" . مجلة علم الفيروسات . 9 (4): 574-582 . doi : 10.1128/JVI.9.4.574-582.1972 . PMC 356341. PMID 4553678 .  {{cite journal}}: صيانة CS1: أسماء متعددة: قائمة المؤلفين ( رابط )
  11. ↑ هاتشيسون، سي. أ.، فيليبس، إس.، إدجيل، إم. إتش.، جيلام، إس.، جانكي، بي.، سميث، إم. (سبتمبر 1978). "الطفرات في موقع محدد في تسلسل الحمض النووي" (ملف PDF) . مجلة الكيمياء البيولوجية . 253 (18): 6551-6560 . doi : 10.1016/S0021-9258(19)46967-6 . PMID 681366 . 
  12. ↑ برامان، جيف، محرر. (2002). بروتوكولات الطفرات في المختبر . طرق في البيولوجيا الجزيئية. المجلد 182 ( الطبعة الثانية). دار هومانا للنشر. ISBN   978-0-89603-910-0.
  13. ↑ كونكل، ت. أ. (1985). "الطفرات الموجهة السريعة والفعالة في مواقع محددة دون اختيار النمط الظاهري" . وقائع الأكاديمية الوطنية للعلوم . 82 (2 ) : 488-492 . Bibcode : 1985PNAS...82..488K . doi : 10.1073/pnas.82.2.488 . PMC 397064. PMID 3881765 .  
  14. ↑ ويلز، جيه إيه؛ إستيل، دي إيه (1988). "سابتيليزين - إنزيم مصمم ليتم هندسته". اتجاهات في العلوم البيوكيميائية . 13 (8): 291-297 . doi : 10.1016/0968-0004(88)90121-1 . PMID 3154281 . 
  15. ↑ كارنيك، أبهيجيت؛ كارنيك، روشا؛ غريفين، كريستوفر (2013). "برنامج SDM-Assist لتصميم بادئات الطفرات الموجهة للموقع التي تُدخل مواقع تقييد "صامتة" . BMC Bioinformatics . 14 (1): 105. doi : 10.1186/1471-2105-14-105 . ISSN 1471-2105 . PMC 3644487. PMID 23522286 .   
  16. 1 2 بابوورث، سي.، باور، جيه سي، برامان، جيه. ورايت، دي إيه (1996). "الطفرات الموجهة للموقع في يوم واحد بكفاءة تزيد عن 80%". استراتيجيات . 9 (3): 3-4 .{{cite journal}}: صيانة CS1: أسماء متعددة: قائمة المؤلفين ( رابط )
  17. 1 2 إيدلهيت، أو؛ هانوكوغلو، أ؛ هانوكوغلو، إ (2009). "طفرة موجهة للموقع بسيطة وفعالة باستخدام تفاعلين أحاديي البادئ بالتوازي لتوليد طفرات لدراسات بنية البروتين ووظيفته" . BMC Biotechnol . 9 : 61. doi : 10.1186/1472-6750-9-61 . PMC 2711942. PMID 19566935 .  
  18. ↑ سيركيوني، ديريك؛ لوفلوك، كاثرين؛ تيلوتسون، إريك ل.؛ هاربينسكي، فريد؛ داسيلفا، جين؛ كيلي، تشيس ب.؛ كيستون-سميث، إليز؛ فرنانديز، سيسيليا أ.؛ ماير، فيك إي.؛ جايارام، هاريهاران؛ شتاينبرغ، باريت إي. (16 أبريل 2020). "مكتبات SMOOT والتطور الموجه لـ Cas9 المحفز بواسطة العاثيات لهندسة تقليل النشاط خارج الهدف" . PLOS ONE . 15 (4) e0231716. Bibcode : 2020PLoSO..1531716C . doi : 10.1371/journal.pone.0231716 . ISSN 1932-6203 . PMC 7161989 . PMID 32298334 .   
  19. ↑ ستوريتشي، ف.؛ ريسنيك، م.أ. (2006). "نهج ديليتو بيرفيتو للطفرات الموجهة للموقع وإعادة ترتيب الكروموسومات في الخميرة باستخدام قليل النوكليوتيدات الاصطناعية في الكائن الحي". إصلاح الحمض النووي، الجزء ب . طرق في علم الإنزيمات. المجلد 409. الصفحات 329-345 . doi : 10.1016/S0076-6879(05)09019-1 . ISBN   978-0-12-182814-1PMID 16793410​​ 
  20. ↑ ستوريتشي ف.؛ ريسنيك م.أ. (2003). "التعديل الجيني الموجه بدقة عالية في الخميرة باستخدام قليل النوكليوتيدات". الهندسة الوراثية . 25 : 189-207 . PMID 15260239 . 
  21. ↑ داميان بيوت-بيلتييه؛ فنسنت جيه جيه مارتن (2016). " التعديل الموجه للموقع السلس لجينوم الخميرة Saccharomyces cerevisiae باستخدام CRISPR-Cas9" . مجلة الهندسة البيولوجية . 10 : 6. doi : 10.1186/s13036-016-0028-1 . PMC 4850645. PMID 27134651 .  
  22. ↑ شو س (20 أغسطس 2015). " تطبيق تقنية تحرير الجينوم CRISPR-Cas9 في دودة Caenorhabditis elegans" . مجلة علم الوراثة وعلم الجينوم . 42 (8): 413-421 . doi : 10.1016/j.jgg.2015.06.005 . PMC 4560834. PMID 26336798 .  
  23. ↑ كوفاتش، ك. أ.، شتاينمان، م.، هالفون، أ.، ماجيستريتي، ب. ج.، كاردينو، ج. ر. (نوفمبر 2015). "التنظيم المعقد لبروتين ربط CREB بواسطة كيناز البروتين 2 المتفاعل مع نطاق التماثل" (ملف PDF) . الإشارات الخلوية . 27 (11): 2252-2260 . doi : 10.1016/j.cellsig.2015.08.001 . hdl : 10754/594104 . PMID 26247811 . 
  24. ↑ ريتز، إم تي؛ كارباليرا ، جيه دي (2007). "الطفرات التشبعية المتكررة (ISM) للتطور الموجه السريع للإنزيمات الوظيفية". بروتوكولات الطبيعة . 2 (4): 891-903 . doi : 10.1038/nprot.2007.72 . PMID 17446890. S2CID 37361631 .  
  25. ↑ ستوفر، سي إي، وإتسون، دي (10 أكتوبر 1969). "تأثير أكسدة بقايا الميثيونين على نشاط السبتيليزين" . مجلة الكيمياء البيولوجية . 244 (19): 5333-5338 . doi : 10.1016/S0021-9258(18)63664-6 . PMID 5344139 . 
  26. ↑ إستيل، د. أ.، غرايكار، ت. ب.، ويلز، ج. أ. (10 يونيو 1985). "هندسة إنزيم باستخدام الطفرات الموجهة للموقع ليكون مقاومًا للأكسدة الكيميائية" . مجلة الكيمياء البيولوجية . 260 (11): 6518-21 . doi : 10.1016/S0021-9258(18)88811-1 . PMID 3922976 . 
  27. ↑ يوري إي. خودياكوف، هوارد أ. فيلدز، محرران. (25 سبتمبر 2002). الحمض النووي الاصطناعي: الأساليب والتطبيقات . مطبعة سي آر سي. ص 13. ISBN  978-1-4200-4016-6.