الفصل الكهربائي الهلامي للبروتينات

يُعدّ الفصل الكهربائي للبروتينات طريقةً لتحليل البروتينات في السوائل أو المستخلصات. يُمكن إجراء هذا الفصل باستخدام حجم صغير من العينة بعدة طرق بديلة، مع أو بدون وسط داعم، مثل الأغاروز أو البولي أكريلاميد . تشمل أنواع الفصل الكهربائي الهلامي: الفصل الكهربائي الهلامي SDS-PAGE ، والفصل الكهربائي الحر، والتركيز الكهربائي ، والفصل الكهربائي متساوي السرعة ، والفصل الكهربائي التقاربي ، والفصل الكهربائي المناعي ، والفصل الكهربائي المعاكس ، والفصل الكهربائي الشعيري . لكل نوع منها العديد من الأنواع الفرعية ذات المزايا والعيوب الخاصة. غالبًا ما يُجرى الفصل الكهربائي الهلامي بالتزامن مع النقل الكهربائي أو النقل المناعي للحصول على معلومات إضافية حول بروتين مُحدد. ^{[ 1 ]}

تُستخدم الهلامات الأصلية، والمعروفة أيضًا بالهلامات غير المشوهة، لتحليل البروتينات التي لا تزال في حالتها المطوية. وبالتالي، فإن الحركة الكهربائية لا تعتمد فقط على نسبة الشحنة إلى الكتلة، بل تعتمد أيضًا على الشكل الفيزيائي والحجم ونقطة التعادل الكهربائي للبروتين. ^{[ 4 ]}

تُجرى معظم عمليات فصل البروتينات باستخدام نظام محلول منظم "غير متصل" (أو DISC) يُحسّن بشكل ملحوظ وضوح الحزم داخل الهلام. أثناء الفصل الكهربائي في نظام هلام غير متصل، يتشكل تدرج أيوني في المرحلة المبكرة، مما يؤدي إلى تركيز جميع البروتينات في حزمة واحدة حادة. ويتحقق تشكل هذا التدرج الأيوني باختيار قيمة أس هيدروجيني (pH) تكون عندها أيونات المحلول المنظم مشحونة بشكل معتدل مقارنةً بالبروتينات المغلفة بـ SDS. توفر هذه الظروف بيئةً تحدد فيها تفاعلات كولراوش الموصلية المولية . ونتيجةً لذلك، تتركز البروتينات المغلفة بـ SDS عدة أضعاف في منطقة رقيقة بسمك 19  ميكرومتر تقريبًا خلال دقائق معدودة. في هذه المرحلة، تهاجر جميع البروتينات بنفس سرعة الهجرة عبر عملية الفصل الكهربائي متساوي السرعة . يحدث هذا في منطقة من الهلام ذات مسام أكبر، بحيث لا تعيق مصفوفة الهلام الهجرة أثناء عملية التركيز أو "التكديس". ^{[ 10 ] [ 11 ]} يتم فصل البروتينات حسب الحجم في الجزء السفلي من الهلام، وهو الجزء المسؤول عن الفصل. يتميز هذا الجزء بمسام أصغر بكثير، مما يؤدي إلى تأثير غربلة يحدد بدوره الحركة الكهربائية للبروتينات. في الوقت نفسه، يتميز الجزء المسؤول عن الفصل من الهلام بقيمة أس هيدروجيني تجعل أيونات المحلول المنظم تحمل شحنة أكبر في المتوسط، مما يجعلها تسبق البروتينات المغطاة بـ SDS، وبالتالي تلغي تدرج الأيونات وتمنع تراكمها.

يُعد نظام التريس-جليسين، أو نظام " ليملي "، من أنظمة المحاليل المنظمة غير المتصلة واسعة الانتشار، حيث يتراكم عند درجة حموضة 6.8 وينفصل عند درجة حموضة تتراوح بين 8.3 و9.0. ومن عيوب هذا النظام أن هذه القيم قد تُحفز تكوين روابط ثنائية الكبريتيد بين بقايا السيستين في البروتينات، نظرًا لأن قيمة pKa للسيستين تتراوح بين 8 و9، ولأن العامل المُختزل الموجود في محلول التحميل لا يهاجر مع البروتينات. وقد ساهمت التطورات الحديثة في تقنية المحاليل المنظمة في التخفيف من هذه المشكلة من خلال فصل البروتينات عند درجة حموضة أقل بكثير من قيمة pKa للسيستين (مثل نظام بيس-تريس ، درجة حموضة 6.5)، وتضمين عوامل مُختزلة (مثل بيسلفيت الصوديوم) تنتقل إلى الهلام قبل البروتينات للحفاظ على بيئة مُختزلة. ومن الفوائد الإضافية لاستخدام محاليل منظمة ذات قيم حموضة منخفضة أن هلام الأكريلاميد يكون أكثر استقرارًا عند هذه القيم، مما يسمح بتخزين الهلام لفترات طويلة قبل الاستخدام. ^{[ 12 ] [ 13 ]}

يُعدّ صبغ كوماسي الأزرق اللامع أشهر أنواع صبغات البروتينات . وهو صبغ أنيوني يرتبط بالبروتينات بشكل غير انتقائي. تُثبّت البروتينات في الهلام بواسطة حمض الخليك وتُصبغ في الوقت نفسه. يمكن إزالة الصبغ الزائد المُدمج في الهلام عن طريق إزالة الصبغة الزائدة باستخدام نفس المحلول الخالي من الصبغة. تظهر البروتينات على شكل أشرطة زرقاء على خلفية شفافة. ^{[ 16 ] [ 17 ]}

عند الحاجة إلى طريقة أكثر حساسية من التلوين باستخدام صبغة كوميسي، يُستخدم عادةً التلوين بالفضة. يُعد التلوين بالفضة إجراءً حساسًا للكشف عن كميات ضئيلة من البروتينات في الهلام، ولكنه يُمكنه أيضًا تصوير الأحماض النووية أو السكريات المتعددة. ^{[ 17 ]}

تتوفر في الأسواق طرق تصوير لا تستخدم صبغات مثل كوميسي والفضة. ^{[ 18 ]} فعلى سبيل المثال، تُسوّق شركة Bio-Rad Laboratories هلامات "خالية من الصبغات" لفصل البروتينات باستخدام تقنية SDS-PAGE. كما يمكن استخدام صبغات فلورية قابلة للعكس، مثل تلك التي تُنتجها شركة Azure Biosystems، كصبغة AzureRed أو Azure TotalStain Q. ^{[ 17 ] [ 18 ] [ 19 ]}

كما هو الحال في الفصل الكهربائي الهلامي للأحماض النووية، يُستخدم صبغ التتبع غالبًا. وعادةً ما تُضاف أصباغ أنيونية ذات حركة كهربائية معروفة إلى محلول العينة. ومن أشهر أصباغ التتبع صبغة بروموفينول الأزرق . تتلون هذه الصبغة في الوسط القلوي والوسط المتعادل، وهي جزيء صغير سالب الشحنة يتحرك باتجاه المصعد. ونظرًا لكونه جزيئًا عالي الحركة، فإنه يتقدم على معظم البروتينات. ^{[ 20 ]}

في الطب ، يُعدّ الفصل الكهربائي للبروتينات طريقة لتحليل البروتينات الموجودة بشكل رئيسي في مصل الدم . قبل الاستخدام الواسع النطاق للفصل الكهربائي الهلامي ، كان يتم إجراء الفصل الكهربائي للبروتينات إما عن طريق الفصل الكهربائي الحر (على الورق) أو عن طريق الفصل الكهربائي المناعي.

تقليديًا، يُصنف بروتين الدم إلى فئتين : ألبومين المصل والغلوبولين . وهما متساويان في النسبة عمومًا، إلا أن جزيء الألبومين أصغر حجمًا بكثير ويحمل شحنة سالبة خفيفة، مما يؤدي إلى تراكمه على هلام الرحلان الكهربائي. ويمثل الشريط الصغير الذي يسبق الألبومين بروتين الترانسثيريتين (المعروف أيضًا باسم ما قبل الألبومين). قد تُسبب بعض الأدوية أو المواد الكيميائية في الجسم ظهور شريط خاص بها، ولكنه عادةً ما يكون صغيرًا. وتُلاحظ أشرطة غير طبيعية (نتوءات) في اعتلال غاما أحادي النسيلة ذي الأهمية غير المحددة والورم النخاعي المتعدد ، وهي مفيدة في تشخيص هذه الحالات.

يتم تصنيف الغلوبولينات حسب نمط التخطيط الخاص بها (مع ممثليها الرئيسيين):

• يتكون نطاق ألفا ( α ) من جزأين، 1 و 2:
  • α ₁ - α _{1 -} مضاد التربسين ، α ₁ - بروتين سكري حمضي.
  • α ₂ - هابتوغلوبين ، α _{2 -} ماكروغلوبولين ، α ₂ - أنتيبلازمين ، سيرولوبلازمين .
• النطاق بيتا (β) - الترانسفيرين ، البروتين الدهني منخفض الكثافة ، المتمم
• الشريط غاما ( γ ) - الغلوبولين المناعي (IgA، IgD، IgE، IgG وIgM). عادةً ما تظهر البروتينات الشاذة (في الورم النخاعي المتعدد) في هذا الشريط.

• الفصل الكهربائي بالتقارب
• النقل الكهربائي
• التركيز الكهربائي
• التحلل البروتيني المتوازي السريع (FASTpp)
• الرحلان الكهربائي الهلامي
• الرحلان المناعي الكهربائي
• التثبيت المناعي
• الرحلان الكهربائي الهلامي الأصلي
• البروتين الشاذ
• SDD-AGE

• مورد تعليمي لفصل البروتينات بالكهرباء
• الفصل الكهربائي الهلامي للبروتينات ( مؤرشف بتاريخ 26 يناير 2021 في أرشيف الإنترنت)