الرحلان الكهربائي الهلامي

📅 آخر تحديث: ٣ أغسطس ٢٠٢٦
✍️ نُشر في: ٣ أغسطس ٢٠٢٦
📷 يحتوي على 8 صور
الموسوعة الحرة

تُظهر الصورة أعلاه كيف تهاجر شظايا الحمض النووي الصغيرة بسرعة عبر الأغاروز، بينما تتحرك شظايا الحمض النووي الكبيرة ببطء أكبر أثناء عملية الفصل الكهربائي. ويُبين الرسم البياني على اليمين العلاقة غير الخطية بين حجم شظية الحمض النووي والمسافة التي قطعتها.
الرحلان الكهربائي الهلامي هو عملية يتم فيها تطبيق تيار كهربائي على عينات الحمض النووي مما يؤدي إلى إنشاء أجزاء يمكن استخدامها للمقارنة بين عينات الحمض النووي.
  1. يتم استخلاص الحمض النووي.
  2. عزل وتضخيم الحمض النووي.
  3. تمت إضافة الحمض النووي إلى تجاويف الجل.
  4. تم تطبيق تيار كهربائي على الجل.
  5. يتم فصل نطاقات الحمض النووي حسب الحجم.
  6. تم تلوين شرائط الحمض النووي.

الرحلان الكهربائي الهلامي هو طريقة فصل وتحليل الجزيئات الحيوية الكبيرة ( الحمض النووي DNA ، الحمض النووي RNA ، البروتينات ، إلخ) وشظاياها، بناءً على حجمها وشحنتها عبر الهلام . يُستخدم في الكيمياء السريرية لفصل البروتينات حسب الشحنة أو الحجم (باستخدام هلام الأغاروز IEF، الذي لا يعتمد أساسًا على الحجم)، وفي الكيمياء الحيوية والبيولوجيا الجزيئية لفصل مجموعة مختلطة من شظايا الحمض النووي DNA والحمض النووي RNA حسب الطول، أو لتقدير حجم شظايا الحمض النووي DNA والحمض النووي RNA، أو لفصل البروتينات حسب الشحنة. [ 1 ]

تُفصل جزيئات الأحماض النووية بتطبيق مجال كهربائي لتحريك الجزيئات سالبة الشحنة عبر مصفوفة هلامية من الأغاروز أو البولي أكريلاميد أو مواد أخرى. تتحرك الجزيئات الأقصر بسرعة أكبر وتهاجر لمسافة أبعد من الجزيئات الأطول لأنها تتدفق بسهولة أكبر عبر مسام الهلام. تُعرف هذه الظاهرة بالغربلة. [ 2 ] تُفصل البروتينات بناءً على الشحنة في الأغاروز لأن مسام الهلام كبيرة جدًا بحيث لا تسمح بغربلة البروتينات. يمكن أيضًا استخدام الرحلان الكهربائي الهلامي لفصل الجسيمات النانوية .

يستخدم الفصل الكهربائي الهلامي الهلام كوسيط مضاد للحمل الحراري أو وسيط غربلة أثناء عملية الفصل الكهربائي. تعمل الهلامات على كبح الحمل الحراري الناتج عن تطبيق المجال الكهربائي، كما يمكنها الحفاظ على الفصل النهائي، مما يسمح بتطبيق صبغة بعد الفصل الكهربائي. [ 3 ] يُجرى الفصل الكهربائي الهلامي للحمض النووي عادةً لأغراض تحليلية، غالبًا بعد تضخيم الحمض النووي باستخدام تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR)، ولكن يمكن استخدامه كتقنية تحضيرية لأساليب أخرى مثل قياس الطيف الكتلي ، وتعدد أطوال قطع التقييد ( RFLP )، وتفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR) ، والاستنساخ ، وتسلسل الحمض النووي ، أو تقنية ساوثرن بلوت ، وذلك لمزيد من التحليل.

الأساس المادي

نظرة عامة على الرحلان الكهربائي الهلامي.

الرحلان الكهربائي عملية تُمكّن من فرز الجزيئات بناءً على الشحنة أو الحجم أو الشكل. باستخدام مجال كهربائي، يمكن تحريك جزيئات مثل الحمض النووي (DNA) عبر هلام مصنوع من الأغاروز أو البولي أكريلاميد . يتكون المجال الكهربائي من شحنة سالبة عند أحد طرفيه تدفع الجزيئات عبر الهلام، وشحنة موجبة عند الطرف الآخر تسحبها عبره. تُوضع الجزيئات المراد فرزها في بئر ضمن مادة الهلام. يُوضع الهلام في حجرة الرحلان الكهربائي، والتي تُوصل بدورها بمصدر طاقة. عند تطبيق المجال الكهربائي، تتحرك الجزيئات الأكبر حجمًا ببطء عبر الهلام، بينما تتحرك الجزيئات الأصغر حجمًا بسرعة أكبر. تُشكّل الجزيئات ذات الأحجام المختلفة نطاقات مميزة على الهلام. [ 4 ]

يشير مصطلح " الهلام " في هذه الحالة إلى المادة الأساسية المستخدمة لاحتواء الجزيئات المستهدفة وفصلها. في معظم الحالات، يكون الهلام بوليمرًا متشابكًا ، ويتم اختيار تركيبه ومساميته بناءً على الوزن والتركيب النوعيين للجزيء المستهدف المراد تحليله. عند فصل البروتينات أو الأحماض النووية الصغيرة ( DNA ، RNA ، أو قليل النوكليوتيدات )، يتكون الهلام عادةً من تراكيز مختلفة من الأكريلاميد ومادة رابطة ، مما ينتج عنه شبكات من متعدد الأكريلاميد بأحجام مختلفة. أما عند فصل الأحماض النووية الأكبر حجمًا (أكثر من بضع مئات من القواعد )، فإن المادة الأساسية المفضلة هي الأغاروز النقي. في كلتا الحالتين، يشكل الهلام مادة صلبة ولكنها مسامية. على عكس متعدد الأكريلاميد، يُعد الأكريلاميد مادة سامة للأعصاب ، ويجب التعامل معه بحذر شديد لتجنب التسمم. يتكون الأغاروز من سلاسل طويلة غير متفرعة من الكربوهيدرات غير المشحونة بدون روابط متقاطعة، مما ينتج عنه هلام ذو مسام كبيرة تسمح بفصل الجزيئات الكبيرة والمعقدات الجزيئية الكبيرة . [ 5 ]

يشير مصطلح الرحلان الكهربائي إلى القوة الدافعة الكهربائية المستخدمة لتحريك الجزيئات عبر مصفوفة الهلام. عند وضع الجزيئات في تجاويف الهلام وتطبيق مجال كهربائي، تتحرك الجزيئات عبر المصفوفة بسرعات مختلفة، تتحدد بشكل كبير بكتلتها عندما تكون نسبة الشحنة إلى الكتلة (Z) لجميع الأنواع متجانسة. مع ذلك، عندما لا تكون الشحنات متجانسة، يتسبب المجال الكهربائي الناتج عن عملية الرحلان الكهربائي في هجرة الجزيئات بشكل تفاضلي وفقًا للشحنة. تهاجر الأنواع ذات الشحنة الموجبة الصافية نحو المهبط ( الذي يحمل شحنة سالبة لأنه خلية تحليلية وليست جلفانية )، بينما تهاجر الأنواع ذات الشحنة السالبة الصافية نحو المصعد الموجب. تبقى الكتلة عاملاً مؤثراً في سرعة هجرة هذه الجزيئات غير المتجانسة الشحنة عبر المصفوفة نحو أقطابها الكهربائية. [ 6 ]

إذا تم تحميل عدة عينات في آبار متجاورة في الهلام، فإنها ستعمل بالتوازي في مسارات منفصلة. وبحسب عدد الجزيئات المختلفة، يُظهر كل مسار فصل المكونات عن الخليط الأصلي على شكل حزمة واحدة أو أكثر، حزمة واحدة لكل مكون. قد يؤدي عدم اكتمال فصل المكونات إلى تداخل الحزم، أو ظهور لطخات غير قابلة للتمييز تمثل مكونات متعددة غير مفصولة. [ 7 ] تحتوي الحزم في المسارات المختلفة التي تنتهي على نفس المسافة من الأعلى على جزيئات مرت عبر الهلام بنفس السرعة، مما يعني عادةً أنها متقاربة في الحجم. تتوفر علامات لتحديد الوزن الجزيئي تحتوي على خليط من جزيئات ذات أحجام معروفة. إذا تم تشغيل مثل هذه العلامة على مسار واحد في الهلام بالتوازي مع العينات المجهولة، يمكن مقارنة الحزم المرصودة بتلك الخاصة بالعينات المجهولة لتحديد حجمها. تتناسب المسافة التي تقطعها الحزمة عكسيًا تقريبًا مع لوغاريتم حجم الجزيء. (وبالتالي، تتناسب المسافة المقطوعة عكسيًا مع لوغاريتم الوزن الجزيئي للعينات). [ 8 ]

توجد حدود لتقنيات الفصل الكهربائي. فبما أن تمرير التيار الكهربائي عبر الهلام يُسبب تسخينه، فقد ينصهر أثناء الفصل الكهربائي. يُجرى الفصل الكهربائي في محاليل منظمة لتقليل تغيرات الرقم الهيدروجيني الناتجة عن المجال الكهربائي، وهو أمر بالغ الأهمية لأن شحنة الحمض النووي DNA والحمض النووي الريبي RNA تعتمد على الرقم الهيدروجيني، ولكن التشغيل لفترة طويلة جدًا قد يُفقد المحلول قدرته على تنظيم الرقم الهيدروجيني. كما توجد قيود على تحديد الوزن الجزيئي باستخدام تقنية SDS-PAGE، خاصةً عند محاولة تحديد الوزن الجزيئي لبروتين غير معروف. يصعب أو يستحيل تقليل بعض المتغيرات البيولوجية، والتي قد تؤثر على الهجرة الكهربائية. تشمل هذه العوامل بنية البروتين، والتعديلات اللاحقة للترجمة، وتركيب الأحماض الأمينية. على سبيل المثال، يُعد التروبوميوسين بروتينًا حمضيًا يهاجر بشكل غير طبيعي على هلام SDS-PAGE. ويعود ذلك إلى أن البقايا الحمضية تتنافر مع SDS سالب الشحنة، مما يؤدي إلى نسبة غير دقيقة بين الكتلة والشحنة والهجرة. [ 9 ] علاوة على ذلك، قد لا تهاجر مستحضرات مختلفة من المادة الوراثية بشكل متسق مع بعضها البعض، لأسباب مورفولوجية أو غيرها.

أنواع الجل

أكثر أنواع الجل استخدامًا هي جل الأجاروز وجل البولي أكريلاميد. كل نوع من الجل مناسب لأنواع وأحجام مختلفة من المادة المراد تحليلها. يُستخدم جل البولي أكريلاميد عادةً للبروتينات، ويتميز بقدرة فصل عالية جدًا لقطع الحمض النووي الصغيرة (5-500 زوج قاعدي). أما جل الأجاروز، فلديه قدرة فصل أقل للحمض النووي، ولكنه يوفر نطاق فصل أوسع، ولذلك يُستخدم عادةً لقطع الحمض النووي التي يتراوح حجمها بين 50 و20000 زوج قاعدي. (يمكن فصل أكثر من 6 ميجابايت باستخدام الرحلان الكهربائي الهلامي النبضي (PFGE)). [ 10 ] يُجرى فصل جل البولي أكريلاميد عموديًا، بينما يُجرى فصل جل الأجاروز أفقيًا في وضع الغمر. كما يختلفان في طريقة الصب، حيث يتصلب الأجاروز حراريًا، بينما يتشكل البولي أكريلاميد من خلال تفاعل بلمرة كيميائي.

الأغاروز

إدخال مشط الجل في حجرة الترحيل الكهربائي لهلام الأغاروز

تُصنع هلامات الأغاروز من بوليمرات عديد السكاريد الطبيعية المستخلصة من الأعشاب البحرية . تتميز هلامات الأغاروز بسهولة صبها والتعامل معها مقارنةً بالمواد الأخرى، لأن تصلبها عملية فيزيائية وليست كيميائية. كما يسهل استخلاص العينات. بعد انتهاء التجربة، يمكن حفظ الهلام الناتج في كيس بلاستيكي في الثلاجة.

لا تتميز هلامات الأغاروز بحجم مسام موحد، لكنها مثالية لفصل البروتينات التي يزيد حجمها عن 200 كيلو دالتون باستخدام الرحلان الكهربائي. [ 11 ] كما يمكن استخدام الرحلان الكهربائي على هلام الأغاروز لفصل شظايا الحمض النووي التي يتراوح طولها من 50 زوجًا قاعديًا إلى عدة ميغابايت (ملايين القواعد)، [ 12 ] والتي تتطلب أكبرها أجهزة متخصصة. تتأثر المسافة بين حزم الحمض النووي ذات الأطوال المختلفة بنسبة الأغاروز في الهلام، حيث تتطلب النسب الأعلى أوقات تشغيل أطول، قد تصل إلى أيام. لذا، يُنصح بتشغيل هلامات الأغاروز ذات النسب العالية باستخدام الرحلان الكهربائي النبضي (PFE) أو الرحلان الكهربائي العكسي .

تُصنع معظم هلامات الأغاروز من أغاروز مُذاب في محلول منظم للرحلان الكهربائي، بتركيز يتراوح بين 0.7% (لفصل أو تمييز جيد لقطع الحمض النووي الكبيرة التي يتراوح حجمها بين 5 و10 كيلوبايت) و2% (لتمييز جيد لقطع الحمض النووي الصغيرة التي يتراوح حجمها بين 0.2 و1 كيلوبايت). يمكن استخدام تركيز يصل إلى 3% لفصل القطع الصغيرة جدًا، ولكن يُعد هلام البولي أكريلاميد العمودي أكثر ملاءمة في هذه الحالة. تكون الهلامات ذات التركيز المنخفض ضعيفة جدًا وقد تنكسر عند محاولة رفعها. أما الهلامات ذات التركيز العالي فغالبًا ما تكون هشة ولا تتصلب بشكل متساوٍ. تُعد الهلامات بتركيز 1% شائعة الاستخدام في العديد من التطبيقات. [ 13 ]

بولي أكريلاميد

يُستخدم الفصل الكهربائي الهلامي متعدد الأكريلاميد (PAGE) لفصل البروتينات التي يتراوح حجمها بين 5 و2000 كيلو دالتون، وذلك بفضل حجم المسام الموحد الذي يوفره هلام متعدد الأكريلاميد. ويتم التحكم في حجم المسام عن طريق تعديل تركيز مسحوق الأكريلاميد ومسحوق ثنائي الأكريلاميد، بالإضافة إلى مدة البلمرة المستخدمة في تكوين الهلام. ويجب توخي الحذر عند تحضير هذا النوع من الهلام، لأن الأكريلاميد مادة سامة للأعصاب قوية في حالتيه السائلة والمسحوقة.

كانت تقنيات تسلسل الحمض النووي التقليدية ، مثل طريقتي ماكسام-جيلبرت وسانجر ، تستخدم هلامات البولي أكريلاميد لفصل شظايا الحمض النووي التي تختلف في طولها بزوج قاعدي واحد فقط، ما يسمح بقراءة التسلسل. أما معظم طرق فصل الحمض النووي الحديثة فتستخدم هلامات الأغاروز، باستثناء شظايا الحمض النووي الصغيرة جدًا. ويُستخدم هذا النوع من الفصل حاليًا بكثرة في مجال علم المناعة وتحليل البروتينات، حيث يُستخدم غالبًا لفصل البروتينات المختلفة أو الأشكال المتغايرة من البروتين نفسه إلى نطاقات منفصلة. ويمكن نقل هذه النطاقات إلى غشاء من النيتروسليلوز أو البولي فينيليدين فلورايد (PVDF) لفحصها باستخدام الأجسام المضادة والعلامات المناسبة، كما هو الحال في تقنية ويسترن بلوت .

تُصنع هلامات الفصل عادةً بتركيزات 4%، 6%، 8%، 10%، 12%، أو 15% من المحلول T. يُسكب هلام التكديس (بتركيز 5% من المحلول T) فوق هلام الفصل، ثم يُدخل مشط الهلام (الذي يُشكّل الآبار ويُحدد المسارات التي ستُوضع فيها البروتينات، ومحلول العينة، والسلالم). تعتمد النسبة المئوية المختارة على حجم البروتين المراد تحديده أو فحصه في العينة. كلما قلّ الوزن المعروف، زادت النسبة المئوية المطلوبة. يُمكن أن تُساعد التغييرات في نظام المحلول المنظم للهلام على فصل البروتينات ذات الأحجام الصغيرة جدًا بشكلٍ أفضل. [ 14 ]

النشا

يُعدّ نشا البطاطس المُحلّل جزئيًا وسطًا غير سام آخر لفصل البروتينات بالرحلان الكهربائي. وتكون الهلامات الناتجة أكثر عتامة بقليل من هلامات الأكريلاميد أو الأغاروز. ويمكن فصل البروتينات غير المُتَمَسِّخة وفقًا لشحنتها وحجمها، وتُرى باستخدام صبغة نفثال بلاك أو أميدو بلاك. وتتراوح تركيزات هلام النشا النموذجية بين 5% و10%. [ 15 ] [ 16 ] [ 17 ]

ظروف الجل

التشويه

تُظهر أنماط TTGE تنوع البكتيريا المشقوقة في عينات البراز من متطوعين سليمين (أ و ب) قبل وبعد العلاج بـ AMC (أموكسيسيلين-حمض الكلافولانيك عن طريق الفم).

تُجرى عملية الفصل الكهربائي الهلامي المُشوِّه في ظروف تُخلّ بالبنية الطبيعية للمادة المراد تحليلها، مما يؤدي إلى تفككها إلى سلسلة خطية. وبالتالي، تعتمد حركة كل جزيء كبير فقط على طوله الخطي ونسبة كتلته إلى شحنته. ومن ثم، تتفكك المستويات الثانوية والثالثية والرابعة من البنية الجزيئية الحيوية ، فلا يتبقى سوى البنية الأولية للتحليل.

تُزال طبيعة الأحماض النووية عادةً بإضافة اليوريا إلى المحلول المنظم، بينما تُزال طبيعة البروتينات باستخدام كبريتات دوديسيل الصوديوم ، عادةً كجزء من عملية الفصل الكهربائي الهلامي SDS-PAGE . ولإزالة طبيعة البروتينات تمامًا، من الضروري أيضًا اختزال روابط ثنائي الكبريتيد التساهمية التي تُثبّت بنيتها الثالثية والرابعية ، وهي طريقة تُسمى الفصل الكهربائي الهلامي الاختزالي. تُحافظ عادةً على ظروف الاختزال بإضافة بيتا-ميركابتوإيثانول أو دايثيوثريتول . يُعد الفصل الكهربائي الهلامي الاختزالي الشكل الأكثر شيوعًا لفصل البروتينات كهربائيًا لتحليل عينات البروتين بشكل عام .

تُعدّ ظروف التمسخ ضرورية لتقدير الوزن الجزيئي للحمض النووي الريبي (RNA) بدقة. يتميز الحمض النووي الريبي بقدرته على تكوين تفاعلات داخلية أكثر من الحمض النووي الريبوزي منقوص الأكسجين (DNA)، مما قد يؤدي إلى تغيير حركته الكهربائية . يُعدّ اليوريا ، وثنائي ميثيل سلفوكسيد (DMSO) ، والجليوكسال من أكثر عوامل التمسخ استخدامًا لتفكيك بنية الحمض النووي الريبي. في الأصل، كان يُستخدم هيدروكسيد ميثيل الزئبق شديد السمية في التمسخ الكهربائي للحمض النووي الريبي، [ 18 ] ولكنه قد يكون الخيار الأمثل لبعض العينات. [ 19 ]

يُستخدم الفصل الكهربائي الهلامي المُشوه في طرق الفصل الكهربائي الهلامي المعتمدة على نمط نطاقات الحمض النووي DNA والحمض النووي الريبي RNA، مثل الفصل الكهربائي الهلامي بتدرج درجة الحرارة (TGGE) [ 20 ] والفصل الكهربائي الهلامي بتدرج درجة الحرارة المُشوه (DGGE) [ 21 ] .

محلي

التلوين المرتبط بالإنزيم المحدد: إنزيمات نازعة هيدروجين الجلوكوز-6-فوسفات في خلايا الدم الحمراء المصابة بالمتصورة المنجلية [ 22 ]

تُجرى عملية الفصل الكهربائي الهلامي الأصلي في ظروف غير مُفسِّخة للحفاظ على البنية الطبيعية للمادة المُحلَّلة. يسمح هذا للحجم الفيزيائي للمركب المطوي أو المُجمَّع بالتأثير على حركته، مما يُتيح تحليل جميع مستويات البنية الجزيئية الحيوية الأربعة. بالنسبة للعينات البيولوجية، تُستخدم المنظفات فقط بالقدر اللازم لتحليل الأغشية الدهنية داخل الخلية . تبقى المركبات - في معظمها - مُرتبطة ومطوية كما لو كانت داخل الخلية. مع ذلك، يتمثل أحد عيوب هذه الطريقة في أن المركبات قد لا تنفصل بشكل واضح أو قابل للتنبؤ، نظرًا لصعوبة التنبؤ بكيفية تأثير شكل الجزيء وحجمه على حركته. وقد تم التغلب على هذه التأثيرات بنجاح باستخدام تقنية الفصل الكهربائي الهلامي الأصلي التحضيري. [ 23 ]

على عكس طرق التشويه، لا يستخدم الفصل الكهربائي الهلامي الأصلي عامل تشويه مشحون. ولذلك، تختلف الجزيئات المراد فصلها (عادةً البروتينات أو الببتيدات أو الأحماض النووية ) ليس فقط في الكتلة الجزيئية والشحنة الذاتية، بل أيضًا في مساحة المقطع العرضي، وبالتالي، تخضع لقوى فصل كهربائي مختلفة تبعًا لشكل بنيتها الكلية. بالنسبة للبروتينات، نظرًا لأنها تبقى في حالتها الأصلية، يمكن تصويرها ليس فقط باستخدام كواشف تلوين البروتينات العامة، بل أيضًا باستخدام التلوين المرتبط بالإنزيمات.

من الأمثلة العملية لتطبيق الرحلان الكهربائي الهلامي الأصلي، التحقق من النشاط الإنزيمي للتأكد من وجود الإنزيم في العينة أثناء تنقية البروتين. على سبيل المثال، بالنسبة لبروتين الفوسفاتاز القلوي ، يكون محلول التلوين مزيجًا من ملح 4-كلورو-2،2-ميثيل بنزين ديازونيوم مع 3-فوسفو-2-نفثويك أسيد-2'-4'-ثنائي ميثيل أنيلين في محلول منظم Tris. يُباع هذا المحلول تجاريًا كمجموعة لتلوين الهلام. في حال وجود البروتين، تتم آلية التفاعل بالترتيب التالي: تبدأ بإزالة الفوسفات من 3-فوسفو-2-نفثويك أسيد-2'-4'-ثنائي ميثيل أنيلين بواسطة الفوسفاتاز القلوي (الماء ضروري للتفاعل). تُحرر مجموعة الفوسفات وتُستبدل بمجموعة كحول من الماء. يستبدل الكاشف الإلكتروفيلي 4-كلورو-2-2-ميثيل بنزين ديازونيوم ( ملح ديازونيوم فاست ريد تي آر ) مجموعة الكحول، مُكَوِّنًا المنتج النهائي، وهو صبغة آزو الحمراء . وكما يوحي اسمه، فهذا هو الناتج النهائي المرئي باللون الأحمر للتفاعل. في التجارب الأكاديمية لطلاب البكالوريوس في تنقية البروتينات، يُجرى عادةً تحليل الهلام الكهربائي بجوار عينات تجارية مُنقَّاة لتصوير النتائج وتحديد ما إذا كانت عملية التنقية ناجحة أم لا. [ 24 ]

يُستخدم الفصل الكهربائي الهلامي الأصلي عادةً في علم البروتينات وعلم المعادن . ومع ذلك، يُستخدم الفصل الكهربائي الهلامي الأصلي أيضًا لفحص الجينات (الحمض النووي) بحثًا عن طفرات غير معروفة كما هو الحال في تعدد أشكال التكوين أحادي السلسلة .

المخازن المؤقتة

تُستخدم المحاليل المنظمة في الفصل الكهربائي الهلامي لتوفير الأيونات التي تحمل التيار وللحفاظ على الرقم الهيدروجيني عند قيمة ثابتة نسبيًا. تحتوي هذه المحاليل على كمية وفيرة من الأيونات، وهو أمر ضروري لمرور التيار الكهربائي خلالها. أما الماء المقطر أو البنزين، فيحتويان على كمية قليلة من الأيونات، مما يجعلهما غير مناسبين للاستخدام في الفصل الكهربائي. [ 25 ] تُستخدم عدة محاليل منظمة في الفصل الكهربائي، وأكثرها شيوعًا للأحماض النووية هو محلول تريس/أسيتات/إيدتا (TAE) ومحلول تريس/بورات/إيدتا (TBE). وقد اقتُرحت محاليل منظمة أخرى، مثل بورات الليثيوم (LB) (الذي نادرًا ما يُستخدم وفقًا لمراجع PubMed)، والهيستيدين متساوي الكهربائية، ومحاليل غود المنظمة ذات قيمة pK المتوافقة، وغيرها. في معظم الحالات، يُعزى ذلك إلى انخفاض التيار (انخفاض الحرارة) وتوافق حركية الأيونات، مما يُطيل عمر المحلول المنظم. يُعدّ البورات إشكاليًا لقدرته على التبلمر أو التفاعل مع ثنائيات الهيدروكسيل من نوع سيس، مثل تلك الموجودة في الحمض النووي الريبي (RNA). يتميز محلول TAE بأقل قدرة على التخزين المؤقت، ولكنه يوفر أفضل دقة لفصل جزيئات الحمض النووي الكبيرة. هذا يعني جهدًا أقل ووقتًا أطول، ولكن بجودة أفضل. أما محلول LB فهو حديث نسبيًا وغير فعال في فصل الشظايا التي يزيد حجمها عن 5 كيلو قاعدة؛ ومع ذلك، بفضل موصليته المنخفضة، يمكن استخدام جهد أعلى بكثير (يصل إلى 35 فولت/سم)، مما يعني تقليل وقت التحليل في عمليات الفصل الكهربائي الروتينية. وقد أمكن فصل اختلافات في الحجم تصل إلى زوج قاعدي واحد في هلام الأغاروز بنسبة 3% باستخدام وسط ذي موصلية منخفضة للغاية (1 ملي مول من بورات الليثيوم). [ 26 ]

تُجرى معظم عمليات فصل البروتينات باستخدام تقنية SDS-PAGE بنظام محلول منظم غير متصل (DISC) يُحسّن بشكل ملحوظ وضوح الحزم داخل الهلام. أثناء الفصل الكهربائي في نظام الهلام غير المتصل، يتشكل تدرج أيوني في المرحلة المبكرة، مما يؤدي إلى تركيز جميع البروتينات على حزمة واحدة واضحة في عملية تُسمى الفصل الكهربائي متساوي السرعة . يتم فصل البروتينات حسب الحجم في المنطقة السفلية من الهلام، وهي منطقة الفصل. يتميز هلام الفصل عادةً بمسام أصغر بكثير، مما يؤدي إلى تأثير غربلة يُحدد بدوره حركة البروتينات أثناء الفصل الكهربائي.

التصور

بعد اكتمال عملية الفصل الكهربائي، يمكن تلوين الجزيئات الموجودة في الهلام لجعلها مرئية. يمكن تصوير الحمض النووي باستخدام بروميد الإيثيديوم الذي يتألق تحت الأشعة فوق البنفسجية عند تداخله مع الحمض النووي ، بينما يمكن تصوير البروتين باستخدام صبغة الفضة أو صبغة كوماسي الزرقاء اللامعة . كما يمكن استخدام طرق أخرى لتصوير فصل مكونات الخليط على الهلام. إذا كانت الجزيئات المراد فصلها تحتوي على مواد مشعة ، كما هو الحال في هلام تسلسل الحمض النووي ، فيمكن تسجيل صورة إشعاعية ذاتية للهلام. يمكن التقاط صور للهلام، غالبًا باستخدام نظام توثيق الهلام . بعد ذلك، تُوسَم الهلامات عادةً لعرضها باستخدام عدد من الأدوات، مثل Adobe Illustrator وGIMP وImageJ وMicrosoft PowerPoint وsciugo.

عمليات المعالجة اللاحقة

بعد الفصل، يمكن استخدام طريقة فصل إضافية، مثل التركيز الكهربائي المتساوي أو الفصل الكهربائي الهلامي SDS-PAGE . ثم يُقطع الهلام ميكانيكيًا، وتُستخلص معقدات البروتين من كل جزء على حدة. بعد ذلك، يمكن تحليل كل مستخلص، مثلاً عن طريق بصمة الكتلة الببتيدية أو تسلسل الببتيدات من الصفر بعد الهضم داخل الهلام . يوفر هذا معلومات قيّمة حول هوية البروتينات في المعقد.

التطبيقات

يُستخدم الفصل الكهربائي الهلامي في الطب الشرعي ، وعلم الأحياء الجزيئي ، وعلم الوراثة ، وعلم الأحياء الدقيقة ، والكيمياء الحيوية . ويمكن تحليل النتائج كميًا من خلال تصوير الهلام باستخدام الأشعة فوق البنفسجية وجهاز تصوير الهلام. تُسجل الصورة بكاميرا مُشغّلة بواسطة الحاسوب، ويُقاس شدة الحزمة أو البقعة المطلوبة وتُقارن بالمعايير أو العلامات المُحمّلة على نفس الهلام. ويتم القياس والتحليل غالبًا باستخدام برامج متخصصة.

اعتمادًا على نوع التحليل الذي يتم إجراؤه، غالبًا ما يتم تطبيق تقنيات أخرى بالتزامن مع نتائج الفصل الكهربائي الهلامي، مما يوفر مجموعة واسعة من التطبيقات الخاصة بكل مجال.

الأحماض النووية

صورة لهلام الأغاروز لمنتج تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR) مقارنةً بسلم الحمض النووي (DNA).

في حالة الأحماض النووية، يعود اتجاه الهجرة، من الأقطاب السالبة إلى الأقطاب الموجبة، إلى الشحنة السالبة الطبيعية التي يحملها هيكلها السكري الفوسفاتي . [ 27 ]

تتخذ شظايا الحمض النووي المزدوجة بطبيعتها شكل قضبان طويلة، لذا فإن هجرتها عبر الهلام تعتمد على حجمها، أو على نصف قطر دورانها في حالة الشظايا الحلقية . أما الحمض النووي الدائري ، كالبلازميدات ، فقد يُظهر نطاقات متعددة، وقد تعتمد سرعة هجرته على ما إذا كان مرتخيًا أم ملتفًا بشدة. يميل الحمض النووي أحادي السلسلة، سواءً كان DNA أو RNA، إلى الالتفاف على شكل جزيئات ذات أشكال معقدة، ويهاجر عبر الهلام بطريقة معقدة بناءً على بنيته الثلاثية. لذلك، تُستخدم عوامل تُفكك الروابط الهيدروجينية ، مثل هيدروكسيد الصوديوم أو الفورماميد ، لفصل الأحماض النووية وجعلها تتخذ شكل قضبان طويلة مرة أخرى. [ 28 ]

يُجرى الفصل الكهربائي الهلامي للحمض النووي DNA أو RNA الكبير عادةً باستخدام هلام الأغاروز. راجع صفحة " طريقة إنهاء السلسلة " للاطلاع على مثال لهلام تسلسل الحمض النووي DNA متعدد الأكريلاميد. يمكن إجراء توصيف الأحماض النووية أو شظاياها من خلال تفاعلها مع الليجاندات باستخدام تقنية الفصل الكهربائي الهلامي بالتقارب .

يمكن استخدام الفصل الكهربائي لعينات الحمض النووي الريبوزي (RNA) للتحقق من تلوث الحمض النووي الجينومي (DNA) وكذلك للكشف عن تحلل الحمض النووي الريبوزي. يُظهر الحمض النووي الريبوزي من الكائنات حقيقية النواة حزمتين واضحتين من الحمض النووي الريبوزي الريبوسومي 28S و18S، وتكون حزمة 28S أكثر كثافة بمرتين تقريبًا من حزمة 18S. أما الحمض النووي الريبوزي المتحلل، فتظهر حزمته أقل وضوحًا، وله مظهر غير واضح، ونسبة كثافته أقل من 2:1.

البروتينات

التصوير الإشعاعي الذاتي SDS-PAGE – توجد البروتينات المشار إليها بتراكيز مختلفة في العينتين.

تختلف البروتينات عن الأحماض النووية في قدرتها على امتلاك شحنات متفاوتة وأشكال معقدة، لذا قد لا تهاجر جميعها إلى هلام البولي أكريلاميد بنفس المعدلات، أو حتى عند تطبيق مجال كهرومغناطيسي سالب إلى موجب على العينة. ولذلك، تُفقد البروتينات طبيعتها عادةً بوجود منظف مثل دوديسيل كبريتات الصوديوم (SDS) الذي يُغلفها بشحنة سالبة. [ 3 ] عمومًا، تتناسب كمية SDS المرتبطة مع حجم البروتين (عادةً 1.4 غرام من SDS لكل غرام من البروتين)، بحيث تحمل البروتينات المفقدة شحنة سالبة إجمالية، وتكون نسبة الشحنة إلى الكتلة متقاربة بين جميع البروتينات. وبما أن البروتينات المفقدة تتصرف كقضبان طويلة بدلًا من امتلاك شكل ثلاثي معقد، فإن معدل هجرة البروتينات المغلفة بـ SDS في الهلام يعتمد فقط على حجمها وليس على شحنتها أو شكلها. [ 3 ]

عادة ما يتم تحليل البروتينات بواسطة الرحلان الكهربائي لهلام بولي أكريلاميد كبريتات دوديسيل الصوديوم ( SDS-PAGE )، أو بواسطة الرحلان الكهربائي الأصلي الأزرق أو الشفاف الأصلي ، أو بواسطة الرحلان الكهربائي الأصلي التحضيري، أو بواسطة الرحلان الكهربائي ثنائي الأبعاد .

يمكن إجراء التوصيف من خلال تفاعل الربيطة عن طريق النقل الكهربائي أو عن طريق الفصل الكهربائي التقاربي في الأجاروز أو عن طريق الفصل الكهربائي الشعري لتقدير ثوابت الارتباط وتحديد السمات الهيكلية مثل محتوى الغليكان من خلال ارتباط الليكتين .

الجسيمات النانوية

يُعدّ فصل أو توصيف الجسيمات النانوية المعدنية أو جسيمات أكسيد المعادن (مثل الذهب والفضة وأكسيد الزنك وثاني أكسيد السيليكون) من التطبيقات الحديثة للرحلان الكهربائي الهلامي، وذلك من حيث الحجم والشكل والتركيب الكيميائي السطحي لهذه الجسيمات. [ 29 ] ويهدف هذا التطبيق إلى الحصول على عينة أكثر تجانسًا (مثل توزيع أضيق لحجم الجسيمات)، والتي يمكن استخدامها لاحقًا في منتجات أو عمليات أخرى (مثل عمليات التجميع الذاتي). ولفصل الجسيمات النانوية داخل الهلام، يُعدّ عامل نسبة حجم الجسيمات إلى حجم المسام العامل الأساسي، حيث تم تحديد آليتين للهجرة: الآلية غير المقيدة، عندما يكون حجم الجسيمات أصغر بكثير من حجم المسام، والآلية المقيدة، عندما يكون حجم الجسيمات مشابهًا لحجم المسام. [ 30 ]

تاريخ

يستشهد كتابٌ صدر عام ١٩٥٩ عن الرحلان الكهربائي، من تأليف ميلان بير، بمراجع من القرن التاسع عشر. [ ٣٥ ] ومع ذلك، فقد قدّم أوليفر سميثيز إسهاماتٍ كبيرة. يقول بير: "إن طريقة سميثيز... تجد تطبيقًا واسعًا نظرًا لقدرتها الفريدة على الفصل". وبالنظر إلى السياق، يُلمّح بير بوضوح إلى أن طريقة سميثيز تُعدّ تحسينًا.

انظر أيضاً

مراجع

  1. ↑ كريندوشكين دي إس؛ ألكسندروف آي إم؛ تير-أفانيسيان إم دي؛ كوشنيروف في في (2003). " تتكون تجمعات بريون الخميرة [ PSI+ ] من بوليمرات Sup35 صغيرة مجزأة بواسطة Hsp104" . مجلة الكيمياء البيولوجية . 278 (49): 49636-49643 . doi : 10.1074/jbc.M307996200 . PMID 14507919 . 
  2. ↑ سامبروك، جوزيف (2001). الاستنساخ الجزيئي: دليل المختبر (بالإسبانية). كولد سبرينغ هاربور، نيويورك: مطبعة مختبر كولد سبرينغ هاربور. ISBN 978-0-87969-576-7. OCLC 45015638 . 
  3. 1 2 3 بيرغ، جيريمي (2002). الكيمياء الحيوية (باللغة الإستونية). نيويورك: دبليو إتش فريمان. ISBN 978-0-7167-4955-4. OCLC 48055706 . 
  4. ↑ ويلسون، كيث (2018). مبادئ وتقنيات ويلسون ووالكر في الكيمياء الحيوية والبيولوجيا الجزيئية . كامبريدج، المملكة المتحدة. نيويورك، نيويورك: مطبعة جامعة كامبريدج. ISBN 978-1-316-61476-1. OCLC 998750377 . 
  5. ↑ بوير، رودني (2000). الكيمياء الحيوية التجريبية الحديثة (باللغة الإستونية). سان فرانسيسكو: بنجامين كامينغز. ISBN 978-0-8053-3111-0. OCLC 44493241 . 
  6. ↑ روبيت، جون (1990). التقنيات البيوكيميائية: النظرية والتطبيق . بروسبكت هايتس، إلينوي: دار نشر ويفلاند. ISBN 978-0-88133-556-9. OCLC 22549624 . 
  7. ^ كورين، بيجي تي. Scofield، R. Hal (2012)، "الأعمال الفنية والأخطاء الشائعة التي تحدث في الرحلان الكهربائي" ، في كورين، بيجي تي؛ Scofield، R. Hal (eds.)، الرحلان الكهربائي للبروتين: الطرق والبروتوكولات ، Totowa، NJ: Humana Press، pp. 633–640 ، doi : 10.1007 / 978-1-61779-821-4_58 ، ISBN  978-1-61779-821-4، PMC 7295095 ، PMID 22585529 ، تم الاطلاع عليه في 26 مارس 2026  
  8. ↑ لي بي واي؛ كوستومبرادو جيه؛ هسو سي واي؛ كيم واي إتش (2012). "الترحيل الكهربائي على هلام الأغاروز لفصل شظايا الحمض النووي" . مجلة التجارب المرئية (62). doi : 10.3791/3923 . PMC 4846332. PMID 22546956 .  
  9. ↑ "تحديد الوزن الجزيئي بواسطة SDS-PAGE، الإصدار ب" (ملف PDF) . www.bio-rad.com . مؤرشف (ملف PDF) من الأصل بتاريخ 17 نوفمبر 2021. تم الاطلاع عليه بتاريخ 23 مارس 2022 .
  10. ↑ توم مانياتيس؛ إي إف فريتش؛ جوزيف سامبروك (1982). "الفصل 5، البروتوكول 1". الاستنساخ الجزيئي - دليل المختبر . المجلد 1 ( الطبعة الثالثة). مختبر كولد سبرينغ هاربور. ص 5.2-5.3. ISBN    978-0-87969-136-3.
  11. ↑ سميسك، ديفيد ل.؛ هوغلاند، ديفيد أ. (1989). "الرحلان الكهربائي على هلام الأغاروز للبوليمرات الإلكتروليتية الاصطناعية ذات الوزن الجزيئي العالي". الجزيئات الكبيرة . 22 (5). الجمعية الكيميائية الأمريكية (ACS): 2270-2277 . Bibcode : 1989MaMol..22.2270S . doi : 10.1021/ma00195a048 . ISSN 0024-9297 . 
  12. ↑ فويتاس، دانيال (مايو 2001). "الرحلان الكهربائي على هلام الأغاروز". البروتوكولات الحالية في علم المناعة . الفصل 10: 10.4.1–10.4.8. doi : 10.1002/0471142735.im1004s02 . ISSN 1934-368X . PMID 18432695. S2CID 39623776 .   
  13. ↑ "الترحيل الكهربائي على هلام الأغاروز (الطريقة الأساسية)" . بروتوكولات بيولوجية . مؤرشف من الأصل في 11 أكتوبر 2018. تم الاطلاع عليه في 23 مارس 2022 .
  14. ↑ شاغر هـ (2006). "Tricine-SDS-PAGE". Nat Protoc . 1 (1): 16–22 . doi : 10.1038 / nprot.2006.4 . PMID 17406207. S2CID 209529082 .  
  15. ↑ غوردون، أ.هـ. (1969). الفصل الكهربائي للبروتينات في هلامات البولي أكريلاميد والنشا: تقنيات مخبرية في الكيمياء الحيوية والبيولوجيا الجزيئية . أمستردام: دار نشر نورث هولاند. ISBN 978-0-7204-4202-1. OCLC 21766 . 
  16. 1 2 سميثيز ، أو. (1955). "الرحلان الكهربائي النطاقي في هلام النشا: اختلافات جماعية في بروتينات مصل الدم لدى البالغين الأصحاء" . مجلة الكيمياء الحيوية . 61 (4): 629-41 . doi : 10.1042/bj0610629 . PMC 1215845. PMID 13276348 .  
  17. ↑ راكسال، ب. ج.؛ كوليفورد، ب. ج. (1968). "طريقة هلام النشا ذي الطبقة الرقيقة لتحديد النمط الإنزيمي لبقع الدم". مجلة جمعية علوم الطب الشرعي . 8 (2): 81-82 . doi : 10.1016/s0015-7368(68)70449-7 . PMID 5738223 . 
  18. ↑ بويل جي إن؛ ويكنز إم بي؛ بايفار إف؛ شيمكي آر تي (1978). "تخليق الحمض النووي التكميلي كامل الطول من أربعة جزيئات mRNA من قناة البيض منقاة جزئيًا" . مجلة الكيمياء البيولوجية . 253 (7): 2471-82 . doi : 10.1016/S0021-9258(17)38097-3 . PMID 632280 . 
  19. ↑ شيلب سي، كادن أو آر (1989). "تحسين النسخ الكامل لحمض نووي ريبوزي فيروس سيندبيس عن طريق التمسخ الفعال باستخدام هيدروكسيد ميثيل الزئبق". مجلة علم الفيروسات . 33 (3): 297-302 . PMID 2570517 . 
  20. ↑ فرومين ن؛ هاملين ج؛ تارناوسكي س؛ روستي د؛ جوردان-ميزيريز ك؛ فوريستير ن؛ وآخرون (2002). "التحليل الإحصائي لأنماط بصمة الفصل الكهربائي الهلامي المشوه (DGE)" . علم الأحياء الدقيقة البيئية . 4 (11): 634-43 . Bibcode : 2002EnvMi...4..634F . doi : 10.1046/j.1462-2920.2002.00358.x . PMID 12460271 .  
  21. ↑ فيشر إس جي؛ ليرمان إل إس (1979). "فصل شظايا الحمض النووي المقيدة غير المعتمد على الطول في الرحلان الكهربائي الهلامي ثنائي الأبعاد". الخلية . 16 ( 1): 191-200 . doi : 10.1016/0092-8674(79)90200-9 . PMID 369706. S2CID 9369012 .  
  22. ↑ هيمبلمان إي؛ ويلسون آر جيه (1981). "الكشف عن إنزيم نازع هيدروجين الجلوكوز-6-فوسفات في طفيليات الملاريا". مجلة الكيمياء الحيوية الجزيئية وعلم الطفيليات . 2 ( 3-4 ): 197-204 . doi : 10.1016/0166-6851(81)90100-6 . PMID 7012616 . 
  23. ↑ كاستنهولز، بيرند (2004). "الرحلان الكهربائي الهلامي المستمر التحضيري متعدد الأكريلاميد الأصلي (PNC-PAGE): طريقة فعالة لعزل العوامل المساعدة للكادميوم في الأنظمة البيولوجية" . رسائل تحليلية . 37 (4): 657-665 . doi : 10.1081/AL-120029742 . ISSN 0003-2719 . S2CID 97636537 .  
  24. ↑ نينفا إيه جيه، بالو دي بي (1998). مناهج أساسية في الكيمياء الحيوية والتكنولوجيا الحيوية . بيثيسدا، ماريلاند: دار فيتزجيرالد للعلوم. ISBN 978-1-891786-00-6.
  25. ↑ نينفا، ألكسندر جيه؛ بالو، ديفيد بي؛ بينور، ماريلي (2009). مناهج المختبر الأساسية للكيمياء الحيوية والتكنولوجيا الحيوية . هوبوكين، نيوجيرسي: وايلي. ص 161. ISBN  978-0-470-08766-4.
  26. ↑ برودي جيه آر؛ كيرن إس إي (2004). "تاريخ ومبادئ الأوساط الموصلة للرحلان الكهربائي القياسي للحمض النووي". مجلة الكيمياء الحيوية التحليلية . 333 (1): 1-13 . doi : 10.1016/j.ab.2004.05.054 . PMID 15351274 . 
  27. ↑ لوديش هـ؛ بيرك أ؛ ماتسودايرا ب (2004). بيولوجيا الخلية الجزيئية ( الطبعة الخامسة). دبليو إتش فريمان: نيويورك، نيويورك. ISBN  978-0-7167-4366-8.
  28. ↑ استكشاف أخطاء الترحيل الكهربائي للهلام الأغاروزي للحمض النووي وإصلاحها. فوكس 19:3 ص.66 (1997).
  29. ^ هاناور، ماتياس. بييرات، سيباستيان. زينس، إنجا؛ لوتز، الكسندر. سونيشسن، كارستن (2007). "فصل الجسيمات النانوية بالرحلان الكهربائي الهلامي حسب الحجم والشكل" . رسائل النانو . 7 (9): 2881–2885 . بيب كود : 2007NanoL...7.2881H . دوى : 10.1021/nl071615y . بميد 17718532 . 
  30. ↑ باراسينسكي، ماثيوس؛ غارنويتنر، جورج (12 فبراير 2020). "آليات الهجرة المقيدة وغير المقيدة لجزيئات السيليكا النانوية في هلام الأغاروز واستخدامها لفصل المخاليط الثنائية". مجلة الكيمياء الفيزيائية ج . 124 (9). الجمعية الكيميائية الأمريكية (ACS): 5157-5166 . doi : 10.1021/acs.jpcc.9b10644 . ISSN 1932-7447 . S2CID 213566317 .  
  31. ↑ ثورن إتش في (1966). "الفصل الكهربائي لحمض نووي فيروس البوليوما عن حمض نووي الخلية المضيفة". علم الفيروسات . 29 (2): 234-239 . doi : 10.1016/0042-6822(66)90029-8 . PMID 4287545 . 
  32. ↑ ويبر ك؛ أوزبورن م (1969). "موثوقية تحديد الوزن الجزيئي بواسطة الرحلان الكهربائي على هلام بولي أكريلاميد مع كبريتات دوديسيل" . مجلة الكيمياء البيولوجية . 244 (16): 4406-12 . doi : 10.1016/S0021-9258(18)94333-4 . PMID 5806584 . 
  33. ↑ Aaij C; Borst P (1972). "الرحلان الكهربائي الهلامي للحمض النووي". Biochim Biophys Acta . 269 (2): 192–200 . doi : 10.1016/0005-2787(72)90426-1 . PMID 5063906 . 
  34. ↑ كاستنهولز، ب (2004). "الرحلان الكهربائي التحضيري المستمر على هلام بولي أكريلاميد (PNC-PAGE): طريقة فعالة لعزل العوامل المساعدة للكادميوم في الأنظمة البيولوجية". رسائل تحليلية . 37 (4). إنفورما المملكة المتحدة المحدودة: 657-665 . doi : 10.1081/al-120029742 . ISSN 0003-2719 . S2CID 97636537 .  
  35. ↑ بير، ميلان (1959). الرحلان الكهربائي: النظرية والأساليب والتطبيقات . دار النشر الأكاديمية. ص 225. OCLC 1175404 .  
  36. ↑ ميندي، ديفيد ب.؛ موريس، ماديلون م.؛ روديجر، ستيفان ج. د. (3 أكتوبر 2012). أوفيرسكي، فلاديمير ن. (محرر). "تحديد استقرار البروتين الفيزيائي الحيوي في المستخلصات بواسطة اختبار التحلل البروتيني السريع، FASTpp" . PLOS ONE . 7 (10) e46147. مكتبة العلوم العامة (PLoS). Bibcode : 2012PLoSO...746147M . doi : 10.1371 / journal.pone.0046147 . ISSN 1932-6203 . PMC 3463568. PMID 23056252 .