علم الوراثة العكسي

الطفرات الموجهة للموقع هي تقنية متطورة يمكنها إما تغيير المناطق التنظيمية في محفز الجين أو إجراء تغييرات طفيفة في الكودون في إطار القراءة المفتوح لتحديد بقايا الأحماض الأمينية المهمة لوظيفة البروتين .

بدلاً من ذلك، يمكن استخدام هذه التقنية لإنشاء أليلات معدومة بحيث يصبح الجين غير وظيفي. على سبيل المثال، يمكن حذف جين عن طريق استهداف الجينات ( إقصاء الجين ) في بعض الكائنات الحية، مثل الخميرة والفئران والطحالب . ومن بين النباتات، يتميز نبات فيزكوميتريلا باتنس (Physcomitrella patens ) بأن إقصاء الجين عبر إعادة التركيب المتماثل لإنشاء طحلب معطل (انظر الشكل) يكاد يكون بنفس كفاءة الخميرة. ^{[ 4 ]} في حالة الخميرة كنظام نموذجي، تم إنشاء عمليات حذف موجهة في كل جين غير أساسي في جينوم الخميرة. ^{[ 5 ]} أما في حالة النباتات كنظام نموذجي، فقد تم إنشاء مكتبات طفرات ضخمة بناءً على تركيبات تعطيل الجينات. ^{[ 6 ]} في إدخال الجين ، يتم استبدال الإكسون الأصلي بتسلسل معدل ذي أهمية. ^{[ 7 ]}

في الآونة الأخيرة، جعلت النيوكليازات المهندسة، وخاصة CRISPR-Cas9، طفرات الإقصاء الجيني العكسي وغيرها من التغييرات المحددة في التسلسل عملية في العديد من الكائنات الحية وأنواع الخلايا التي كان من الصعب سابقًا التلاعب بها وراثيًا. ^{[ 8 ]}

في بعض الحالات، يمكن استخدام الأليلات المشروطة لضمان استمرار عمل الجين بشكل طبيعي إلى حين تنشيط الأليل المشروط. قد يتضمن ذلك إدخال مواقع إعادة التركيب (مثل مواقع lox أو frt) التي تُسبب حذفًا في الجين المستهدف عند تحفيز إنزيم إعادة تركيب مُحدد (مثل CRE أو FLP). يمكن تحفيز إنزيمات إعادة التركيب Cre أو Flp باستخدام المعالجات الكيميائية أو المعالجة بالصدمة الحرارية، أو حصرها في مجموعة فرعية مُحددة من الأنسجة.

هناك تقنية أخرى يمكن استخدامها وهي تقنية TILLING . وهي طريقة تجمع بين تقنية قياسية وفعالة للطفرات مع مادة مطفرة كيميائية مثل إيثيل ميثان سلفونات (EMS) مع تقنية فحص الحمض النووي الحساسة التي تحدد الطفرات النقطية في الجين المستهدف.

في مجال علم الفيروسات، يمكن استخدام تقنيات الهندسة الوراثية العكسية لاستعادة فيروسات معدية كاملة الطول مع طفرات أو إضافات مرغوبة في جينومات الفيروس أو في جينات فيروسية محددة. تشمل التقنيات التي تسمح بهذه التعديلات تفاعل تمديد البوليميراز الدائري (CPER)، والذي استُخدم لأول مرة لإنتاج الحمض النووي التكميلي المعدي لفيروس كونجين، وهو قريب من فيروس غرب النيل. ^{[ 9 ]} كما استُخدم تفاعل تمديد البوليميراز الدائري بنجاح لإنتاج مجموعة من فيروسات الحمض النووي الريبي أحادي السلسلة الموجبة، مثل فيروس سارس-كوف-2، ^{[ 10 ]} المسبب لمرض كوفيد-19.

أدى اكتشاف تقنية إسكات الجينات باستخدام الحمض النووي الريبوزي المزدوج، والمعروفة أيضًا باسم التداخل الريبوزي (RNAi)، وتطوير تقنية تثبيط الجينات باستخدام مورفولينو أوليغومرات، إلى جعل تعطيل التعبير الجيني أسلوبًا متاحًا للعديد من الباحثين. غالبًا ما يُشار إلى هذه الطريقة باسم تثبيط الجينات لأن تأثيرات هذه الكواشف تكون مؤقتة بشكل عام، على عكس تعطيل الجينات الذي يكون دائمًا. ^{[ 11 ]}

تُحدث تقنية التداخل الرناوي (RNAi) تأثيرًا مُحددًا لتعطيل الجينات دون إحداث طفرات فعلية في الحمض النووي المستهدف. في دودة C. elegans ، استُخدمت تقنية التداخل الرناوي للتدخل بشكل منهجي في التعبير عن معظم الجينات في الجينوم. تعمل هذه التقنية عن طريق توجيه الأنظمة الخلوية لتحليل الحمض النووي الريبوزي الرسول (mRNA) المستهدف. ^{[ 12 ]}

أصبح التداخل الرناوي، وتحديدًا إسكات الجينات، أداةً فعّالةً لكبت التعبير الجيني وتحديد وتحليل النمط الظاهري الناتج عن فقدان الوظيفة. فعندما تحدث طفرات في الأليلات، تتغير الوظيفة التي تمثلها وتشفّرها وتفقدها؛ ويُطلق على هذا عمومًا اسم طفرة فقدان الوظيفة. ^{[ 13 ]} وتتيح القدرة على تحليل النمط الظاهري الناتج عن فقدان الوظيفة تحليل وظيفة الجين حتى في حال عدم توفر الأليلات الطافرة. ^{[ 14 ]}

بينما يعتمد تثبيط التعبير الجيني بواسطة الحمض النووي الريبوزي المتداخل (RNAi) على مكونات خلوية لتحقيق فعاليته (مثل بروتينات دايسر، ومركب RISC)، يُعدّ مورفولينو مضاد الحمض النووي الريبوزي المرسال (Morpholinos antisense oligos) بديلاً بسيطاً لتثبيط الجينات. يرتبط مورفولينو بالحمض النووي الريبوزي المرسال المستهدف ويمنع وصوله إليه دون الحاجة إلى نشاط البروتينات الخلوية ودون تسريع تحلله بالضرورة. يتميز مورفولينو بفعاليته في أنظمة تتفاوت في تعقيدها، بدءاً من الترجمة الخلوية في المختبر وصولاً إلى الدراسات الحيوية على نماذج حيوانية كبيرة.

يتمثل النهج الجيني الجزيئي في إنشاء كائنات معدلة وراثيًا تُفرط في التعبير عن جين طبيعي ذي أهمية. وقد يعكس النمط الظاهري الناتج الوظيفة الطبيعية للجين. ^{[ 15 ]}

بدلاً من ذلك، من الممكن الإفراط في التعبير عن أشكال متحولة من الجين تتداخل مع وظيفة الجين الطبيعي ( النمط البري ). على سبيل المثال، قد يؤدي الإفراط في التعبير عن جين متحول إلى مستويات عالية من بروتين غير وظيفي، مما ينتج عنه تفاعل سلبي مهيمن مع البروتين الطبيعي. في هذه الحالة، سيتفوق الشكل المتحول على البروتينات الطبيعية في التنافس على الارتباط بها، مما يؤدي إلى ظهور النمط الظاهري المتحول.

قد تؤدي بعض الطفرات الأخرى إلى بروتين ذي تنظيم غير طبيعي ونشاط دائم (يبقى نشطًا طوال الوقت). قد يعود ذلك إلى إزالة نطاق تنظيمي أو طفرة في حمض أميني محدد قابل للتعديل بشكل عكسي (عن طريق الفسفرة أو المثيلة أو اليوبيكويتين ). يُعد أي من هذين التغييرين بالغ الأهمية لتعديل وظيفة البروتين، وغالبًا ما ينتج عنه أنماط ظاهرية ذات دلالة.

إحدى الطرق الشائعة لإنتاج لقاح باستخدام تقنيات الهندسة الوراثية العكسية هي استخدام البلازميدات لتخليق فيروسات مُضعَّفة. تُستخدم هذه التقنية بكثرة في الإنتاج السنوي للقاحات الإنفلونزا ، حيث يُمكن لنظام مكون من ثمانية بلازميدات إنتاج لقاح فعال بسرعة. يتكون الجينوم الكامل لفيروس الإنفلونزا A من ثمانية أجزاء من الحمض النووي الريبي (RNA)، لذا فإن دمج ستة بلازميدات من الحمض النووي التكميلي الفيروسي المُضعَّف مع بلازميدين من النوع البري يسمح بإنشاء سلالة لقاح مُضعَّفة. في تطوير لقاحات الإنفلونزا، تُؤخذ القطعتان الرابعة والسادسة من الحمض النووي الريبي، اللتان تُشفِّران بروتيني الهيماغلوتينين والنيورامينيداز على التوالي، من الفيروس المنتشر، بينما تُستخلص القطع الست الأخرى من سلالة رئيسية مُضعَّفة مُسبقًا. يتميز بروتينا HA وNA بتنوع مستضدي عالٍ ، ولذلك يُؤخذان من السلالة الحالية التي يُنتَج اللقاح من أجلها لإنتاج لقاح مُطابق تمامًا. ^{[ 16 ]}

يحتوي البلازميد المستخدم في هذا النظام المكون من ثمانية بلازميدات على ثلاثة مكونات رئيسية تُتيح تطوير اللقاح. أولًا، يحتوي البلازميد على مواقع تقييد تسمح بإدخال جينات الإنفلونزا فيه. ثانيًا، يحتوي البلازميد على جين مقاومة للمضادات الحيوية، مما يسمح بانتقاء البلازميدات التي تحتوي على الجين الصحيح فقط. أخيرًا، يحتوي البلازميد على مُحفِّزين، هما مُحفِّز بوليميراز الحمض النووي البشري 1 ومُحفِّز بوليميراز الحمض النووي البشري 2، واللذان ينسخان الجينات في اتجاهين متعاكسين. ^{[ 19 ]}

تُصنّع تسلسلات الحمض النووي التكميلي (cDNA) للحمض النووي الريبي الفيروسي من سلالات رئيسية مُضعّفة باستخدام تفاعل البوليميراز المتسلسل العكسي (RT-PCR ). ^{[ 16 ]} يُمكن بعد ذلك إدخال هذا الحمض النووي التكميلي بين مُحفّز بوليميراز الحمض النووي الريبي الأول (Pol I) وتسلسل الإنهاء من خلال هضم إنزيم التقييد. ثم يُحاط الحمض النووي التكميلي وتسلسل بوليميراز الحمض النووي الريبي الأول بمُحفّز بوليميراز الحمض النووي الريبي الثاني (Pol II) وموقع إضافة ذيل عديد الأدينين . ^{[ 20 ]} يُدخل هذا التسلسل بأكمله في بلازميد. تُنقل ستة بلازميدات مُشتقة من الحمض النووي التكميلي للسلالة الرئيسية المُضعّفة إلى خلية مُستهدفة، غالبًا ما تكون بيضة دجاج، جنبًا إلى جنب مع بلازميدين من سلالة الإنفلونزا البرية المُنتشرة حاليًا. داخل الخلية المُستهدفة، يقوم إنزيمَا بوليميراز الحمض النووي الريبي الأول والثاني "المُكدّسان" بنسخ الحمض النووي التكميلي الفيروسي لتصنيع كلٍ من الحمض النووي الريبي الفيروسي ذي السلسلة السالبة والحمض النووي الريبي الرسول ذي السلسلة الموجبة، مما يُنتج فيروسًا مُضعّفًا. ^{[ 16 ]} والنتيجة هي سلالة لقاح معيبة تشبه سلالة الفيروس الحالية، مما يسمح للمضيف بتكوين مناعة. ويمكن استخدام سلالة اللقاح المصنعة هذه كفيروس أولي لإنتاج لقاحات أخرى.

تتميز اللقاحات المُهندسة وراثيًا بتقنية الهندسة الوراثية العكسية بعدة مزايا مقارنةً بتصاميم اللقاحات التقليدية، وأبرزها سرعة الإنتاج. فبفضل التباين المستضدي الكبير في بروتينات HA وNA السكرية ، تسمح تقنية الهندسة الوراثية العكسية بصياغة النمط الجيني المطلوب (أي النمط الذي يحتوي على بروتينات HA وNA مأخوذة من سلالات فيروسية منتشرة حاليًا) بسرعة. ^{[ 16 ]} إضافةً إلى ذلك، ولأن المنتج النهائي للقاحات الموهنة المُهندسة وراثيًا بتقنية الهندسة الوراثية العكسية هو فيروس حي، فإنها تُظهر قدرةً مناعيةً أعلى من اللقاحات التقليدية المُعطلة، ^{[ 21 ]} التي يجب قتلها باستخدام إجراءات كيميائية قبل استخدامها كلقاح. مع ذلك، ونظرًا لطبيعة الفيروسات الموهنة الحية، قد تنشأ مضاعفات لدى المرضى الذين يعانون من نقص المناعة . ^{[ 22 ]} كما توجد احتمالية أن تؤدي طفرة في الفيروس إلى تحول اللقاح مرة أخرى إلى فيروس حي غير موهن. ^{[ 23 ]}