ناقل ديوكسي نيوكليوتيديل الطرفي

إنزيم ناقل النيوكليوتيدات الطرفي ( TdT )، المعروف أيضًا باسم ناقل النيوكليوتيدات الطرفي ( DNTT ) أو الناقل الطرفي ، هو بوليميراز DNA متخصص يُعبَّر عنه في الخلايا اللمفاوية غير الناضجة، والخلايا اللمفاوية ما قبل B، والخلايا اللمفاوية ما قبل T ، وخلايا سرطان الدم الليمفاوي الحاد /الورم اللمفاوي. يُضيف TdT نيوكليوتيدات N إلى الإكسونات V وD وJ لجينات مستقبلات الخلايا التائية (TCR) ومستقبلات الخلايا البائية (BCR) أثناء إعادة تركيب جينات الأجسام المضادة ، مما يُتيح ظاهرة التنوع الوصلي . في البشر، يُشفَّر الناقل الطرفي بواسطة جين DNTT . ^{[ 5 ] [ 6 ]} وبصفته عضوًا في عائلة X من إنزيمات بوليميراز DNA ، فإنه يعمل بالتزامن مع بوليميراز λ وبوليميراز μ، وكلاهما ينتمي إلى نفس عائلة X من إنزيمات البوليميراز. وقد لعب التنوع الذي يُدخله TdT دورًا هامًا في تطور الجهاز المناعي للفقاريات، مما زاد بشكل كبير من تنوع مستقبلات المستضدات التي تمتلكها الخلية لمكافحة مسببات الأمراض. أظهرت دراسات أجريت على فئران معدلة وراثيًا (فئران مُستأصلة جين TdT) انخفاضًا حادًا (عشرة أضعاف) في تنوع مستقبلات الخلايا التائية (TCR) مقارنةً بالفئران الطبيعية. ويؤدي التنوع الأكبر في مستقبلات الخلايا التائية لدى الكائن الحي إلى زيادة مقاومته للعدوى. ^{[ 7 ] [ 8 ]} على الرغم من أن TdT كان من أوائل بوليميرازات الحمض النووي التي تم تحديدها في الثدييات عام 1960، ^{[ 9 ]} إلا أنه لا يزال من أقل بوليميرازات الحمض النووي فهمًا. ^{[ 7 ]} في الفترة ما بين 2016 و2018، اكتُشف أن TdT يُظهر قدرة على تخليق الحمض النووي في مناطق قصيرة بطريقة تعتمد على القالب ، بالإضافة إلى سلوكه المعروف على نطاق أوسع والذي لا يعتمد على القالب. ^{[ 10 ] [ 11 ]}

يغيب إنزيم TdT في الخلايا الجذعية المكونة للدم في كبد الجنين ، مما يؤدي إلى إضعاف تنوع الوصلات في الخلايا البائية بشكل كبير خلال فترة الحمل. ^{[ 12 ]}

بشكل عام، يحفز إنزيم TdT إضافة النيوكليوتيدات إلى الطرف 3' لجزيء الحمض النووي DNA . وعلى عكس معظم بوليميرازات الحمض النووي، لا يتطلب هذا الإنزيم قالبًا. الركيزة المفضلة لهذا الإنزيم هي الطرف 3' البارز ، ولكنه قادر أيضًا على إضافة النيوكليوتيدات إلى الأطراف 3' غير البارزة أو المتراجعة. علاوة على ذلك، يُعد TdT البوليميراز الوحيد المعروف بقدرته على تحفيز تخليق بوليمرات الحمض النووي DNA التي يتراوح طولها بين 2 و15 نيوكليوتيدًا من النيوكليوتيدات الحرة في المحلول داخل الكائن الحي . ^{[ 13 ]} في المختبر ، يحفز هذا السلوك التكوين العام لبوليمرات الحمض النووي DNA دون تحديد طول معين. ^{[ 14 ]} يُفترض أن شظايا الحمض النووي DNA التي يتراوح طولها بين 2 و15 نيوكليوتيدًا، والتي تُنتج داخل الكائن الحي، تعمل في مسارات الإشارات المتعلقة بإصلاح الحمض النووي DNA و/أو آليات إعادة التركيب. ^{[ 13 ]} مثل العديد من البوليميرازات، يتطلب إنزيم TdT عاملًا مساعدًا من الكاتيونات ثنائية التكافؤ ، ^{[ 15 ] [ 16 ] وفقًا لآلية أيوني المعدنين الشائعة في جميع البوليميرازات. مع ذلك} ، يتميز TdT بقدرته على استخدام نطاق أوسع من الكاتيونات مثل Mg²⁺ و ^Mn²⁺ و Zn²⁺ و ^Co²⁺ . ^{[ 15 ] يعتمد معدل النشاط الإنزيمي على الكاتيونات ثنائية التكافؤ} المتاحة والنيوكليوتيد المُضاف، [ ^{17 ] [ 15 ] وقد} دُرست التفاصيل البنيوية للدورة التحفيزية بالتفصيل لهذه الأيونات المختلفة. ^{[ 18 ]}

يُعبَّر عن إنزيم TdT بشكل رئيسي في الأعضاء اللمفاوية الأولية، مثل الغدة الزعترية ونخاع العظم. ويتم تنظيم تعبيره عبر مسارات متعددة، تشمل تفاعلات البروتين-بروتين، مثل تفاعله مع TdIF1. يُعد TdIF1 بروتينًا آخر يتفاعل مع TdT لتثبيط وظيفته عن طريق حجب منطقة ارتباط الحمض النووي لبوليميراز TdT. كما يوجد تنظيم لتعبير TdT على المستوى النسخي، حيث يتأثر هذا التنظيم بعوامل خاصة بمرحلة معينة، ويحدث بطريقة مقيدة نمائيًا. ^{[ 7 ] [ 19 ] [ 20 ]} على الرغم من أن التعبير يُلاحظ عادةً في الأعضاء اللمفاوية الأولية، فقد أشارت دراسات حديثة إلى أن التحفيز بواسطة المستضد قد يؤدي إلى تعبير ثانوي عن TdT إلى جانب إنزيمات أخرى ضرورية لإعادة ترتيب الجينات خارج الغدة الزعترية للخلايا التائية. ^{[ 21 ]} يُفرط مرضى ابيضاض الدم الليمفاوي الحاد في إنتاج TdT بشكل كبير. ^{[ 17 ]} شكلت خطوط الخلايا المشتقة من هؤلاء المرضى أحد المصادر الأولى لإنزيم TdT النقي، وأدت إلى اكتشاف وجود اختلافات في النشاط بين الأشكال المتماثلة البشرية والبقرية. ^{[ 17 ]}

الآلية

على غرار العديد من البوليميرازات ، يحتوي الموقع التحفيزي لإنزيم TdT على كاتيونين ثنائيي التكافؤ في نطاق راحة اليد، مما يساعد في ربط النيوكليوتيدات، ويساهم في خفض قيمة pKa _{لمجموعة} 3'-OH، ويسهل في النهاية خروج ناتج البيروفوسفات الثانوي. ^{[ 22 ] [ 23 ]}

دورها في إعادة تركيب V(D)J

بفعل إنزيمات RAG 1/2، يتبقى من الحمض النووي المزدوج المقطوع بنية حلقية في نهاية كل قطعة من الحمض النووي الناتجة عن عملية القطع. يقوم مركب أرتيميس بفتح هذه البنية الحلقية ، حيث يمتلك نشاطًا نوويًا داخليًا عند فسفرته، مما يوفر نهايات 3' OH حرة ليعمل عليها إنزيم TdT. بمجرد أن يُكمل مركب أرتيميس عمله ويضيف نيوكليوتيدات متناظرة (P-nucleotides) إلى البنية الحلقية المفتوحة حديثًا، يصبح TdT جاهزًا للقيام بوظيفته. يستطيع TdT الآن إضافة نيوكليوتيدات N-nucleotides إلى نيوكليوتيدات P-nucleotides الموجودة في اتجاه 5' إلى 3'، وهو الاتجاه الذي تعمل فيه البوليميرازات. في المتوسط، تتم إضافة 2-5 أزواج قاعدية عشوائية إلى كل نهاية 3' تتكون بعد عمل مركب أرتيميس. يكفي عدد القواعد المضافة لكي تخضع قطعتي الحمض النووي أحادي السلسلة المُصنّعتين حديثًا لعملية محاذاة التماثل الجزئي أثناء ربط النهايات غير المتماثلة وفقًا لأنماط اقتران قواعد واتسون-كريك الطبيعية (AT، CG). بعد ذلك، تُستأصل النيوكليوتيدات غير المزدوجة بواسطة إنزيم إكسونوكلياز، مثل مُركّب أرتميس (الذي يمتلك نشاط إكسونوكلياز بالإضافة إلى نشاط إندونوكلياز)، ثم تقوم بوليميرازات تعتمد على القالب بملء الفجوات، لتُنشئ في النهاية وصلة الترميز الجديدة بفعل الليغاز لربط القطعتين. على الرغم من أن إنزيم TdT لا يُميّز بين أزواج القواعد الأربعة عند إضافتها إلى قطع النيوكليوتيدات N، إلا أنه أظهر ميلًا نحو أزواج قواعد الجوانين والسيتوزين . ^{[ 7 ]}

نشاط يعتمد على القالب

بطريقة تعتمد على القالب، يستطيع إنزيم TdT دمج بضعة نيوكليوتيدات فقط عبر فواصل الحمض النووي المزدوجة بطريقة تُعرف باسم " عبر" (trans)، على عكس آلية "في نفس" (in cis) الموجودة في معظم البوليميرازات. يحدث هذا على النحو الأمثل عند وجود فاصل بطول زوج قاعدي واحد بين السلسلتين، ويقلّ مع ازدياد الفجوة. يُسهّل ذلك جزء فرعي من إنزيم TdT يُسمى الحلقة 1 (Loop1)، والذي يبحث بشكل انتقائي عن فواصل قصيرة في الحمض النووي المزدوج. ^{[ 28 ]} علاوة على ذلك، أدى اكتشاف هذا النشاط المعتمد على القالب إلى فرضيات آلية أكثر إقناعًا حول كيفية نشوء توزيع أطوال إضافات مناطق N في إعادة تركيب V(D)J. ^{[ 29 ]}

يُظهر كلٌّ من بوليميراز μ وبوليميراز λ نشاطًا تركيبيًا مشابهًا لـ TdT، يعتمد على القالب ، ولكن دون اعتماد مماثل على الحمض النووي المزدوج السلسلة في اتجاه المصب. ^{[ 30 ]} علاوة على ذلك، وُجد أن بوليميراز λ يُظهر أيضًا نشاطًا تركيبيًا مشابهًا لا يعتمد على القالب. إلى جانب نشاطه كناقل طرفي، من المعروف أنه يعمل أيضًا بطريقة أكثر عمومية تعتمد على القالب. ^{[ 31 ]} تشير أوجه التشابه بين TdT وبوليميراز μ إلى أنهما مرتبطان تطوريًا بشكل وثيق، وأن استبدالًا بسيطًا للحلقة 1 فيهما يكفي لتحويل TdT إلى بوليميراز μ. ^{[ 32 ]}

يُستخدم إنزيم ناقل الطرفية في البيولوجيا الجزيئية . يُمكن استخدامه في تقنية RACE لإضافة نيوكليوتيدات تُستخدم لاحقًا كقالب لبادئ في تفاعل البلمرة المتسلسل (PCR) . كما يُمكن استخدامه لإضافة نيوكليوتيدات موسومة بنظائر مشعة ، على سبيل المثال في اختبار TUNEL ( اختبار ناقل ديوكسي نيوكليوتيديل الطرفي، ووسم نهايات القطع بواسطة dUTP ) لإثبات موت الخلايا المبرمج (الذي يُشار إليه جزئيًا بتفتت الحمض النووي). ويُستخدم أيضًا في اختبار التألق المناعي لتشخيص ابيضاض الدم الليمفاوي الحاد . ^{[ 33 ]}

في الكيمياء المناعية النسيجية وقياس التدفق الخلوي، يمكن استخدام الأجسام المضادة لإنزيم ناقل الديوكسي ثيوفين (TdT) لإثبات وجود الخلايا التائية والبائية غير الناضجة والخلايا الجذعية المكونة للدم متعددة القدرات ، والتي تحمل هذا المستضد، بينما تكون الخلايا اللمفاوية الناضجة سلبية دائمًا لإنزيم TdT. وعلى الرغم من وجود خلايا إيجابية لإنزيم TdT بأعداد قليلة في العقد اللمفاوية واللوزتين السليمتين، فإن الخلايا الخبيثة في ابيضاض الدم الليمفاوي الحاد تكون أيضًا إيجابية لإنزيم TdT، وبالتالي يمكن استخدام هذا الجسم المضاد كجزء من مجموعة أدوات تشخيصية لتشخيص هذا المرض وتمييزه عن أمراض أخرى، مثل أورام الخلايا الصغيرة لدى الأطفال. ^{[ 34 ]}

شهد إنزيم TdT مؤخرًا استخدامًا في التخليق الحيوي للأوليغونوكليوتيدات، حيث تتميز نظائره المرتبطة بـ TdT-dNTP بقدرتها على إطالة البادئ بمقدار نيوكليوتيد واحد في كل مرة. ^{[ 35 ]} بعبارة أخرى، أثبت إنزيم TdT قدرته على صنع الحمض النووي الاصطناعي عن طريق إضافة حرف واحد في كل مرة إلى تسلسل البادئ.

• الحمض النووي
• بوليميراز الحمض النووي

• إنزيم ناقل الديوكسي ريبونوكليوتيديل الطرفي في رؤوس الموضوعات الطبية (MeSH) بالمكتبة الوطنية الأمريكية للطب