نظرية تسلسل الحمض النووي

تعتمد جميع الطرق الشائعة لتسلسل الحمض النووي على قراءة أجزاء صغيرة منه، ثم إعادة بناء هذه البيانات لاستنتاج الحمض النووي المستهدف الأصلي، إما عن طريق التجميع أو المحاذاة مع مرجع. ويتمثل المفهوم المجرد المشترك لهذه الطرق في مسألة التغطية الرياضية . ^{[ 2 ]} على سبيل المثال، يمكن تخيل قطعة مستقيمة تمثل الهدف، وعملية لاحقة يتم فيها "إسقاط" أجزاء أصغر على مواقع عشوائية من الهدف. ويُعتبر الهدف "متسلسلاً" عند تراكم تغطية كافية (أي عند عدم وجود فجوات).

درس علماء الرياضيات الخصائص المجردة للتغطية لأكثر من قرن. ^{[ 3 ]} ومع ذلك، لم يكن التطبيق المباشر لهذه النتائج ممكنًا بشكل عام. فالحلول الرياضية المغلقة، وخاصة لتوزيعات الاحتمالات، غالبًا ما يصعب تقييمها بسهولة. أي أنها تتطلب وقتًا حاسوبيًا هائلاً لمعاملات مميزة لتسلسل الحمض النووي . يُعد تكوين ستيفنز مثالًا على ذلك. ^{[ 4 ]} كما أن النتائج المُستخلصة من منظور الرياضيات البحتة لا تُراعي العوامل المهمة في التسلسل، مثل التداخل القابل للكشف في أجزاء التسلسل، وازدواج السلاسل، وتأثيرات الحواف، وتعدد الأهداف. ونتيجة لذلك، سار تطوير نظرية التسلسل وفقًا لفلسفة الرياضيات التطبيقية . وعلى وجه الخصوص، ركزت هذه النظرية على حل المشكلات، واستخدمت التقريبات والمحاكاة وغيرها بكفاءة.

يمكن إيجاد النتيجة الأولى مباشرةً من نظرية الاحتمالات الأولية . لنفترض أننا نمذج العملية المذكورة أعلاه مع الأخذ في الاعتبار${\displaystyle L}$و${\displaystyle G}$على التوالي، يمثل طول الجزء وطول الهدف. ومن ثم، فإن احتمال "تغطية" أي موقع معين على الهدف بجزء معين هو${\displaystyle L/G}$(هذا يفترض${\displaystyle L\ll G}$(وهو أمر صحيح في كثير من الأحيان، ولكن ليس في جميع حالات العالم الحقيقي). وبالتالي، فإن احتمال عدم تغطية جزء واحد لموقع معين على الهدف هو${\displaystyle 1-L/G}$، و${\displaystyle \left[1-L/G\right]^{N}}$ل${\displaystyle N}$وبالتالي ، فإن احتمال تغطية موقع معين على الهدف بقطعة واحدة على الأقل هو

${\displaystyle P=1-\left[1-{\frac {L}{G}}\right]^{N}.}$

استُخدمت هذه المعادلة لأول مرة لتوصيف مكتبات البلازميدات ، ^{[ 5 ]} ولكنها قد تظهر في شكل مُعدَّل. بالنسبة لمعظم المشاريع${\displaystyle N\gg 1}$بحيث يكون ذلك، بدرجة جيدة من التقريب

${\displaystyle \left[1-{\frac {L}{G}}\right]^{N}\sim \exp(-NL/G),}$

أين${\displaystyle R=NL/G}$يُطلق على هذا اسم التكرار . لاحظ أهمية التكرار كونه يُمثل متوسط ​​عدد مرات تغطية موضع ما بأجزاء. لاحظ أيضًا أنه عند النظر في عملية التغطية على جميع المواضع في الهدف، فإن هذا الاحتمال يُطابق القيمة المتوقعة للمتغير العشوائي${\displaystyle C}$، نسبة تغطية الهدف. النتيجة النهائية،

${\displaystyle E\langle C\rangle =1-e^{-R},}$

لا يزال يستخدم على نطاق واسع كأداة تقدير " تقريبية " ويتوقع أن التغطية لجميع المشاريع تتطور على طول منحنى عالمي هو دالة فقط للتكرار.

في عام ١٩٨٨، نشر إريك لاندر ومايكل ووترمان بحثًا هامًا ^{[ ٦ ]} تناول مشكلة التغطية من منظور الفجوات. ورغم تركيزهما على ما يُعرف بمشكلة التعيين ، إلا أن تطبيقها على التسلسل يبقى مشابهًا إلى حد كبير. وقدّما عددًا من النتائج المفيدة التي اعتُمدت كنظرية معيارية منذ بدايات تسلسل الجينوم "واسع النطاق". ^{[ ٧ ]} كما استُخدم نموذجهما في تصميم مشروع الجينوم البشري ، ولا يزال يلعب دورًا هامًا في تسلسل الحمض النووي.

في نهاية المطاف، يتمثل الهدف الرئيسي لمشروع التسلسل في سد جميع الثغرات، لذا كان "منظور الثغرات" أساسًا منطقيًا لتطوير نموذج التسلسل. ومن أكثر النتائج استخدامًا لهذا النموذج هو العدد المتوقع للقطع المتجاورة ، بالنظر إلى عدد القطع التي تم تسلسلها. وإذا تم تجاهل كمية التسلسل التي تُهدر أساسًا بسبب الحاجة إلى اكتشاف التداخلات، فإن نظريتهم تُعطي...

${\displaystyle E\langle contigs\rangle =Ne^{-R}.}$

في عام ١٩٩٥، نشر روتش ^{[ ٨ ]} تحسينات على هذه النظرية، مما مكّن من تطبيقها على مشاريع التسلسل التي كان الهدف منها تسلسل جينوم مستهدف بالكامل. وأكد مايكل ويندل وبوب ووترستون ^{[ ٩ ]} ، استنادًا إلى طريقة ستيفنز ^{[ ٤ ]} ، أن كلا النموذجين يُنتجان نتائج مماثلة عندما يكون عدد القطع المتجاورة كبيرًا، كما هو الحال في مشاريع رسم الخرائط أو التسلسل ذات التغطية المنخفضة. ومع ازدياد مشاريع التسلسل في التسعينيات، واقترابها من الاكتمال، أصبحت تقريبات التغطية المنخفضة غير كافية، وأصبح نموذج روتش الدقيق ضروريًا. ومع ذلك، مع انخفاض تكلفة التسلسل، أصبح من الأسهل اختبار معايير مشاريع التسلسل تجريبيًا بشكل مباشر، وتضاءل الاهتمام والتمويل لعلم الجينوم الاستراتيجي.

أدت الأفكار الأساسية لنظرية لاندر-واترمان إلى عدد من النتائج الإضافية لاختلافات محددة في تقنيات رسم الخرائط. ^{[ 10 ] [ 11 ] [ 12 ]} ومع ذلك، فقد جعلت التطورات التكنولوجية نظريات رسم الخرائط قديمة إلى حد كبير باستثناء الكائنات الحية الأخرى غير الكائنات النموذجية التي خضعت لدراسات مكثفة (مثل الخميرة والذباب والفئران والبشر).

تُشبه استراتيجية تسلسل الحمض النووي عملية ركن السيارات على جانب الطريق. كل سيارة هي نسخة مستنسخة مُسلسلة، وجانب الطريق هو الهدف الجينومي. ^{[ 13 ]} تُفحص كل نسخة مستنسخة مُسلسلة للتأكد من عدم تداخل النسخ المُسلسلة اللاحقة مع أي نسخة مُسلسلة سابقة. لا يوجد جهد تسلسل زائد في هذه الاستراتيجية. مع ذلك، وكما هو الحال مع الفجوات بين السيارات المركونة، تتراكم فجوات غير مُسلسلة، أقل من طول النسخة المستنسخة، بين النسخ المُسلسلة. وقد تكون تكلفة سد هذه الفجوات باهظة.

في عام ١٩٩٥، اقترح روتش وآخرون ^{[ ١٤ ]} ، وأثبتوا من خلال المحاكاة، تعميمًا لمجموعة من الاستراتيجيات التي استكشفها إدواردز وكاسكي سابقًا. ^{[ ١٥ ]} اكتسبت طريقة تسلسل الجينوم الكامل هذه شعبية هائلة، إذ دافعت عنها شركة سيليرا واستخدمتها لتسلسل العديد من الكائنات النموذجية قبل أن تطبقها سيليرا على الجينوم البشري. واليوم، تستخدم معظم مشاريع التسلسل هذه الاستراتيجية، والتي تُعرف غالبًا باسم تسلسل الأطراف المزدوجة.

طوّر علماء الأحياء طرقًا لترشيح المناطق المتكررة للغاية، والتي يصعب تسلسلها أساسًا، من الجينومات. تُعدّ هذه الإجراءات مهمة للكائنات الحية التي تتكون جينوماتها في الغالب من هذا النوع من الحمض النووي، مثل الذرة. فهي تُنتج عددًا كبيرًا من الجزر الصغيرة من منتجات الحمض النووي القابلة للتسلسل. اقترح ويندل وباربازوك ^{[ 16 ]} توسيعًا لنظرية لاندر-واترمان لتفسير "الفجوات" في الهدف الناتجة عن الترشيح وما يُسمى "تأثير الحافة". هذا الأخير هو تحيز في أخذ العينات خاص بموقع معين، فعلى سبيل المثال، يحتوي موقع القاعدة الطرفية على جزء واحد فقط من الحمض النووي.${\displaystyle 1/G}$فرصة التغطية، على عكس${\displaystyle L/G}$للوظائف الداخلية. لـ${\displaystyle R<1}$، لا تزال نظرية لاندر-واترمان الكلاسيكية تعطي تنبؤات جيدة، لكن الديناميكيات تتغير بالنسبة للتكرارات الأعلى.

تعتمد طرق التسلسل الحديثة عادةً على تسلسل طرفي قطعة كبيرة، مما يوفر معلومات ربط للتجميع من الصفر ويُحسّن احتمالات المحاذاة مع التسلسل المرجعي. ويعتقد الباحثون عمومًا أن أطوال البيانات الأطول (أطوال القراءة) تُحسّن الأداء لأهداف الحمض النووي الكبيرة جدًا، وهي فكرة تتوافق مع تنبؤات نماذج التوزيع. ^{[ 17 ]} مع ذلك، أظهر ويندل ^{[ 18 ]} أن القطع الأصغر توفر تغطية أفضل للأهداف الخطية الصغيرة لأنها تُقلل من تأثير الحواف في الجزيئات الخطية. لهذه النتائج آثار على تسلسل نواتج إجراءات ترشيح الحمض النووي. من الواضح أن اقتران القراءات وحجم القطعة لهما تأثير ضئيل على أهداف فئة الجينوم الكامل الكبيرة.

يُعدّ التسلسل الجيني أداةً بالغة الأهمية في الطب، لا سيما في أبحاث السرطان. ففي هذا المجال، تبرز أهمية القدرة على كشف الطفرات غير المتجانسة ^، ولا يُمكن تحقيق ذلك إلا بالحصول على تسلسل الجينوم ثنائي الصيغة الصبغية . وفي الجهود الرائدة لتسلسل الأفراد، وضع كلٌّ من ليفي وآخرون ^{[ 19 ]} وويلر وآخرون [ ^{20 ]،} الذين قاموا بتسلسل جينوم كريغ فينتر وجيم واتسون على التوالي، نماذج لتغطية كلا الأليلين في الجينوم. ثمّ طوّر ويندل وويلسون ^{[ 21 ]} نظريةً أكثر عموميةً تسمح بعددٍ غير محدود من التغطيات لكل أليل، وبأي عددٍ من الصيغ الصبغية . وتشير هذه النتائج إلى استنتاجٍ عامٍّ مفاده أن كمية البيانات اللازمة لمثل هذه المشاريع أعلى بكثير من تلك اللازمة لمشاريع الجينوم أحادي الصيغة الصبغية التقليدية. وبشكلٍ عام، يُعتبر التكرار بمقدار 30 ضعفًا على الأقل، أي تغطية كل نيوكليوتيد بمتوسط ​​30 قراءة تسلسلية، معيارًا أساسيًا. ^{[ ٢٢ ]} مع ذلك، قد تكون المتطلبات أكبر، اعتمادًا على أنواع الأحداث الجينومية المراد رصدها. على سبيل المثال، في ما يُسمى "طريقة أزواج القراءات غير المتوافقة"، يُمكن استنتاج إدخالات الحمض النووي إذا كانت المسافة بين أزواج القراءات أكبر من المتوقع. تُظهر الحسابات أن هناك حاجة إلى تكرار يصل إلى ٥٠ ضعفًا لتجنب الأخطاء الإيجابية الكاذبة عند عتبة ١٪. ^{[ ٢٣ ]}

أتاح ظهور تقنيات التسلسل الجيني من الجيل التالي إمكانية إجراء تسلسل جيني واسع النطاق للسكان، كما في مشروع الألف جينوم الذي يهدف إلى توصيف التباين في مجموعات السكان البشرية. وبينما يسهل رصد التباين الشائع، يُمثل التباين النادر تحديًا في التصميم: فقلة عدد العينات مع وجود تكرار كبير في التسلسل قد يؤدي إلى عدم وجود متغير في مجموعة العينات، بينما قد تؤدي العينات الكبيرة ذات التكرار المنخفض إلى عدم رصد متغير موجود بالفعل في مجموعة العينات. وقد قدم ويندل وويلسون ^{[ 24 ]} مجموعة بسيطة من قواعد التحسين التي تزيد من احتمالية الاكتشاف لمجموعة معينة من المعايير. فعلى سبيل المثال، لرصد أليل نادر مرتين على الأقل (لاستبعاد احتمالية كونه فريدًا لفرد معين)، ينبغي استخدام تكرار أقل بقليل من أربعة أضعاف، بغض النظر عن حجم العينة.

تُتيح أجهزة الجيل الجديد الآن تسلسل مجتمعات الميتاجينوم الكاملة غير المستزرعة. يُعدّ سيناريو التسلسل هنا أكثر تعقيدًا، وتوجد طرقٌ مُتعددة لصياغة نظريات التصميم لمشروعٍ مُحدد. على سبيل المثال، طوّر ستانهوب ^{[ 25 ]} نموذجًا احتماليًا لكمية التسلسل اللازمة للحصول على قطعة واحدة على الأقل بحجم مُحدد من كل كائن حي جديد في المجتمع، بينما قدّم ويندل وآخرون تحليلًا لمتوسط ​​حجم القطعة أو احتمال استعادة كائن حي جديد بالكامل لندرته المُحددة داخل المجتمع. ^{[ 26 ]} في المقابل، يقترح هوبر وآخرون نموذجًا شبه تجريبي قائمًا على توزيع جاما . ^{[ 27 ]}