التثبيت (علم الأنسجة)

يُستخدم التثبيت الحراري لتثبيت الكائنات وحيدة الخلية، وأكثرها شيوعًا البكتيريا والعتائق . تُخلط الكائنات عادةً بالماء أو محلول ملحي فسيولوجي، مما يُساعد على توزيع العينة بالتساوي. بعد التخفيف، تُفرد العينة على شريحة مجهرية . تُسمى عينة البكتيريا المخففة هذه عادةً بالمسحة بعد وضعها على الشريحة. بعد أن تجف المسحة في درجة حرارة الغرفة، تُمسك الشريحة بملقط أو مشبك غسيل وتُمرر فوق لهب موقد بنسن عدة مرات لقتل الكائن الحي حراريًا وتثبيته على الشريحة. يمكن أيضًا استخدام جهاز حرق دقيق . بعد التسخين، تُصبغ العينات عادةً ثم تُصوّر باستخدام المجهر. ^{[ 4 ]} يحافظ التثبيت الحراري عمومًا على الشكل العام، لكنه لا يحافظ على التراكيب الداخلية. تُؤدي الحرارة إلى تغيير طبيعة الإنزيم المحلل للبروتين وتمنع التحلل الذاتي. لا يُمكن استخدام التثبيت الحراري في طريقة صبغ الكبسولة، لأنه يُؤدي إلى انكماش الكبسولة ( الغليكوكس ) أو تدميرها، وبالتالي لا يُمكن رؤيتها في الصبغات. ^{[ 5 ]}

يمكن استخدام تقنية الغمر لتثبيت العينات النسيجية، بدءًا من خلية واحدة وصولًا إلى كائن حي كامل. تُغمر عينة النسيج في محلول التثبيت لفترة زمنية محددة. يجب أن يكون حجم محلول التثبيت أكبر بعشر مرات على الأقل من حجم النسيج. ^{[ 6 ]} ولضمان نجاح التثبيت، يجب أن ينتشر المثبت في جميع أنحاء النسيج، لذا يجب مراعاة حجم النسيج وكثافته، بالإضافة إلى نوع المثبت. تُعد هذه التقنية شائعة في التطبيقات الخلوية، ولكن يمكن استخدامها أيضًا مع الأنسجة الأكبر حجمًا. استخدام عينة أكبر يعني ضرورة غمرها لفترة أطول حتى يصل المثبت إلى أعماق النسيج. ^{[ 7 ]}

التروية هي مرور السوائل عبر الأوعية الدموية أو القنوات الطبيعية للعضو أو الكائن الحي. في تثبيت الأنسجة بالتروية، يُضخ المُثبِّت إلى الدورة الدموية، عادةً عبر إبرة تُدخل في البطين الأيسر . يمكن القيام بذلك بتوجيه الموجات فوق الصوتية، أو بفتح تجويف الصدر. ^{[ 8 ]} يُحقن المُثبِّت في القلب بحجم يُطابق الناتج القلبي الطبيعي. باستخدام الدورة الدموية الطبيعية، يتوزع المُثبِّت في جميع أنحاء الجسم، ولا تموت الأنسجة إلا بعد تثبيتها. عند استخدام هذه الطريقة، يجب إضافة منفذ تصريف في مكان ما في الدورة الدموية لاستيعاب حجم المُثبِّت والمحلول المنظم، ويتم ذلك عادةً في الأذين الأيمن . يُضخ المُثبِّت إلى الدورة الدموية حتى يحل محل كل الدم. يتميز استخدام التثبيت بالتروية بميزة الحفاظ على الشكل المورفولوجي ^{[ 9 ]} ، لكن من عيوبه موت الكائن الحي، وارتفاع حجم المثبت اللازم للكائنات الأكبر حجمًا، مما قد يزيد التكاليف. ويمكن تقليل حجم السائل اللازم لإجراء التثبيت بالتروية عن طريق إغلاق الشرايين التي تغذي الأنسجة غير ذات الصلة بالبحث. ويُستخدم التثبيت بالتروية بشكل شائع لتصوير أنسجة الدماغ والرئة والكلى في القوارض، كما يُستخدم في تشريح الجثث البشرية ^{[ 7 ] [ 10 ] .}

تعمل المثبتات الرابطة عن طريق تكوين روابط كيميائية تساهمية بين البروتينات في الأنسجة. وهذا يُثبّت البروتينات الذائبة بالهيكل الخلوي ، ويُضفي صلابة إضافية على النسيج. ويُمكن الحفاظ على بنية الهيكل الخلوي العابرة أو الدقيقة، مثل الانقباضات أثناء موجات التمايز الجنيني، على أفضل وجه من خلال المعالجة المسبقة باستخدام الموجات الدقيقة قبل إضافة المثبت الرابط. ^{[ 11 ] [ 12 ]}

يُعد الفورمالديهايد المُثبِّت الأكثر شيوعًا في علم الأنسجة . ويُستخدم عادةً على شكل فورمالين مُحايد مُخفَّف بنسبة 10% (NBF)، أي ما يُقارب 3.7%–4.0% فورمالديهايد في محلول فوسفات مُخفَّف، بدرجة حموضة 7. ولأن الفورمالديهايد غاز في درجة حرارة الغرفة، يُستخدم الفورمالين - غاز الفورمالديهايد مُذاب في الماء (حوالي 37% وزن/حجم) - عند تحضير المُثبِّت الأول. يُثبِّت الفورمالديهايد الأنسجة عن طريق ربط البروتينات، وخاصةً بقايا حمض الليسين الأميني القاعدي . ويمكن عكس تأثيره بإضافة كمية زائدة من الماء، كما أنه يمنع تصبغ الفورمالين. يُستخدم البارافورمالديهايد أيضًا بشكل شائع، ويتحلل إلى فورمالين عند تسخينه، مما يجعله مُثبِّتًا فعالًا. ومن فوائد البارافورمالديهايد الأخرى إمكانية تخزينه لفترات طويلة واختراقه الجيد للأنسجة. وهو مناسب بشكل خاص لتقنيات الكيمياء المناعية النسيجية. كما يُمكن استخدام بخار الفورمالديهايد كمُثبِّت لمسحات الخلايا.

يُعدّ الغلوتارالدهيد من الألدهيدات الشائعة الأخرى للتثبيت . وهو يعمل بطريقة مشابهة للفورمالديهايد، حيث يُسبب تشوهًا في الحلزونات ألفا للبروتينات. إلا أن جزيء الغلوتارالدهيد أكبر حجمًا من جزيء الفورمالديهايد، وبالتالي يخترق الأغشية ببطء أكبر. ونتيجةً لذلك، قد يكون تثبيت عينات الأنسجة السميكة بالغلوتارالدهيد صعبًا؛ ويمكن التغلب على هذه المشكلة بتقليل حجم عينة النسيج. من مزايا التثبيت بالغلوتارالدهيد أنه قد يُنتج مُثبّتًا أكثر صلابة أو ترابطًا ، إذ يسمح طوله الأكبر ومجموعتي الألدهيد فيه بربط أزواج جزيئات البروتين المتباعدة. يُحدث الغلوتارالدهيد تغييرات سريعة وغير قابلة للعكس، وهو مناسب تمامًا للمجهر الإلكتروني، ويعمل بكفاءة عند درجة حرارة 4 درجات مئوية، ويُعطي أفضل تفاصيل شاملة للسيتوبلازم والنواة. مع ذلك، فهو ليس مثاليًا لتلوين الكيمياء المناعية النسيجية. 

تتطلب بعض بروتوكولات التثبيت مزيجًا من الفورمالديهايد والجلوتارالديهايد بحيث تكمل قوة كل منهما الأخرى.

تميل هذه المثبتات المتشابكة، وخاصة الفورمالديهايد، إلى الحفاظ على البنية الثانوية للبروتينات وقد تحافظ أيضًا على معظم البنية الثالثية .

تعمل المثبتات المُرَسِّبة (أو المُفسِخة ) عن طريق تقليل ذوبان جزيئات البروتين، وغالبًا عن طريق تعطيل التفاعلات الكارهة للماء التي تُعطي العديد من البروتينات بنيتها الثلاثية. ويختلف ترسيب البروتينات وتجمعها اختلافًا كبيرًا عن عملية التشابك التي تحدث مع المثبتات الألدهيدية.

أكثر المواد المثبتة شيوعًا هي الإيثانول والميثانول . تُستخدم هذه المواد عادةً لتثبيت المقاطع المجمدة والمسحات. كما يُستخدم الأسيتون أيضًا ، وقد ثبت أنه يُحقق حفظًا نسيجيًا أفضل من المقاطع المجمدة عند استخدامه في تقنية الأسيتون ميثيل بنزوات الزيلين (AMEX).

نادراً ما يتم استخدام الميثانول والإيثانول والأسيتون، وهي مواد تعمل على تغيير طبيعة البروتين، بمفردها لتثبيت الكتل إلا عند دراسة الأحماض النووية.

حمض الخليك هو مادة مُفسِّخة تُستخدم أحيانًا مع مواد التثبيت المُرسبة الأخرى، مثل محلول ديفيدسون AFA. ^{[ 13 ]} من المعروف أن الكحولات، بمفردها، تُسبب انكماشًا وتصلبًا كبيرًا للأنسجة أثناء التثبيت، بينما يرتبط حمض الخليك وحده بتورم الأنسجة؛ وقد يؤدي الجمع بينهما إلى الحفاظ بشكل أفضل على مورفولوجيا الأنسجة .

تتفاعل المثبتات المؤكسدة مع السلاسل الجانبية للبروتينات والجزيئات الحيوية الأخرى، مما يسمح بتكوين روابط متقاطعة تُثبّت بنية الأنسجة. ومع ذلك، فإنها تُسبب تمسخًا واسع النطاق على الرغم من الحفاظ على البنية الخلوية الدقيقة، وتُستخدم بشكل أساسي كمثبتات ثانوية.

يُستخدم رباعي أكسيد الأوزميوم غالبًا كمثبت ثانوي عند تحضير العينات للفحص المجهري الإلكتروني . (لا يُستخدم في الفحص المجهري الضوئي لأنه يخترق المقاطع السميكة من الأنسجة بشكل ضعيف للغاية).

يُستخدم كل من ثنائي كرومات البوتاسيوم وحمض الكروميك وبرمنجنات البوتاسيوم في بعض التحضيرات النسيجية المحددة.

تتميز المواد الزئبقية، مثل مثبت B-5 ومثبت زينكر، بآلية غير معروفة تزيد من سطوع التلوين وتُظهر تفاصيل نووية ممتازة. ورغم سرعة مفعولها، إلا أن اختراقها ضعيف وتُسبب انكماش الأنسجة. يُعد استخدامها الأمثل لتثبيت الأنسجة المكونة للدم والأنسجة الشبكية البطانية. يُرجى ملاحظة أنه نظرًا لاحتوائها على الزئبق، يجب توخي الحذر عند التخلص منها.

تخترق البيكرات الأنسجة جيدًا لتتفاعل مع الهستونات والبروتينات القاعدية، مكونةً بيكرات بلورية مع الأحماض الأمينية، ومُرسبةً جميع البروتينات. وهي مُثبِّت جيد للأنسجة الضامة، وتحافظ على الجليكوجين بكفاءة، وتستخلص الدهون، مما يُعطي نتائج أفضل من الفورمالديهايد في التلوين المناعي للهرمونات الحيوية والببتيدية. مع ذلك، فإنها تُسبب فقدان الخلايا القاعدية ما لم يتم غسل العينة جيدًا بعد التثبيت.

يُعطي تأثير الحماية من المذيبات العضوية بوساطة محلول منظم حمض الجلوتاميك هيبس (HOPE) شكلاً يشبه الفورمالين، وحفظًا ممتازًا لمستضدات البروتين من أجل الكيمياء المناعية والكيمياء النسيجية الإنزيمية، وإنتاجية جيدة من الحمض النووي الريبي والحمض النووي، وعدم وجود بروتينات متشابكة.