مطيافية التألق

مطيافية التألق (المعروفة أيضًا باسم قياس التألق أو قياس الطيف التألقي ) هي نوع من أنواع المطيافية الكهرومغناطيسية التي تحلل التألق المنبعث من عينة. وتعتمد هذه التقنية على استخدام شعاع ضوئي، عادةً ما يكون ضوءًا فوق بنفسجيًا ، لإثارة الإلكترونات في جزيئات مركبات معينة، مما يؤدي إلى انبعاث الضوء منها؛ وعادةً ما يكون هذا الضوء مرئيًا ، ولكن ليس بالضرورة. وتُعد مطيافية الامتصاص تقنية مكملة لها . في حالة مطيافية التألق لجزيء واحد، تُقاس تقلبات شدة الضوء المنبعث إما من فلوروفورات مفردة أو من أزواج من الفلوروفورات.

تُسمى الأجهزة التي تقيس التألق الفلوري بمقاييس التألق الفلوري .

تمتلك الجزيئات حالاتٍ مختلفة تُعرف بمستويات الطاقة . يهتم علم مطيافية التألق بشكل أساسي بالحالات الإلكترونية والاهتزازية. عمومًا، يمتلك النوع المدروس حالة إلكترونية أساسية (حالة طاقة منخفضة) وحالة إلكترونية مثارة ذات طاقة أعلى. ضمن كل حالة من هذه الحالات الإلكترونية، توجد حالات اهتزازية مختلفة. ^{[ 1 ]}

في عملية التألق، تُثار الجزيئة أولاً، بامتصاص فوتون ، من حالتها الإلكترونية الأرضية إلى إحدى الحالات الاهتزازية المختلفة ضمن الحالة الإلكترونية المثارة. وتؤدي التصادمات مع جزيئات أخرى إلى فقدان الجزيئة المثارة لطاقة اهتزازية حتى تصل إلى أدنى حالة اهتزازية ضمن الحالة الإلكترونية المثارة. وغالبًا ما تُصوَّر هذه العملية باستخدام مخطط جابلونسكي . ^{[ 1 ]}

ثم يعود الجزيء إلى أحد مستويات الاهتزاز المختلفة للحالة الإلكترونية الأرضية، مُصدراً فوتوناً خلال هذه العملية. ^{[ 1 ]} وبما أن الجزيئات قد تعود إلى أي من مستويات الاهتزاز المتعددة في الحالة الأرضية، فإن الفوتونات المنبعثة ستكون لها طاقات مختلفة، وبالتالي ترددات مختلفة. لذلك، من خلال تحليل الترددات المختلفة للضوء المنبعث في مطيافية التألق، إلى جانب شدتها النسبية، يمكن تحديد بنية مستويات الاهتزاز المختلفة.

بالنسبة للذرات، تكون العملية مشابهة؛ إلا أنه نظرًا لعدم امتلاك الذرات مستويات طاقة اهتزازية، فإن الفوتونات المنبعثة غالبًا ما تكون بنفس طول موجة الإشعاع الساقط. تُعرف هذه العملية، المتمثلة في إعادة انبعاث الفوتون الممتص، باسم "التألق الرنيني"، وهي سمة مميزة للتألق الذري، ولكنها تُلاحظ أيضًا في التألق الجزيئي. ^{[ 2 ]}

في قياس التألق (الانبعاث) التقليدي، يكون طول موجة الإثارة (طول موجة الضوء الساقط المستخدم لإثارة الفلوروفور) ثابتًا، بينما يتغير طول موجة الكشف (مما ينتج عنه طيف انبعاث) . أما في قياس إثارة التألق، فيكون طول موجة الكشف ثابتًا، بينما يتغير طول موجة الإثارة عبر منطقة محددة لإنتاج طيف إثارة . تُستخلص مصفوفة الإثارة-الانبعاث بتسجيل أطياف الانبعاث الناتجة عن نطاق من أطوال موجات الإثارة ودمجها معًا. ^{[ 3 ] [ 4 ]} وهذه مجموعة بيانات سطحية ثلاثية الأبعاد: شدة الانبعاث كدالة لأطوال موجات الإثارة والانبعاث، وعادةً ما تُعرض على شكل خريطة كنتورية.

يوجد نوعان عامان من الأجهزة: أجهزة قياس الفلورة التي تستخدم المرشحات لعزل الضوء الساقط والضوء الفلوري ، وأجهزة قياس الطيف الفلوري التي تستخدم أحادي اللون ذي محزز الحيود لعزل الضوء الساقط والضوء الفلوري.

يستخدم كلا النوعين الآلية التالية: يمر الضوء الصادر من مصدر الإثارة عبر مرشح أو مُوحِّد اللون، ثم يسقط على العينة. يمتص جزء من الضوء الساقط بواسطة العينة، فتتألق بعض جزيئاتها. ينبعث الضوء المتألق في جميع الاتجاهات. يمر جزء من هذا الضوء المتألق عبر مرشح أو مُوحِّد لون ثانٍ ويصل إلى كاشف، يُوضع عادةً بزاوية 90 درجة بالنسبة لشعاع الضوء الساقط لتقليل خطر وصول الضوء الساقط المنقول أو المنعكس إلى الكاشف.

يمكن استخدام مصادر ضوئية متنوعة كمصادر إثارة، بما في ذلك الليزر، ومصابيح LED، والمصابيح العادية؛ وخاصةً أقواس الزينون ومصابيح بخار الزئبق  . يُصدر الليزر ضوءًا عالي الإشعاع ضمن نطاق ضيق جدًا من الأطوال الموجية، عادةً أقل من 0.01 نانومتر، مما يجعل استخدام مُوحِّد اللون أو المرشح للإثارة غير ضروري. لكن يعيب هذه الطريقة عدم إمكانية تغيير الطول الموجي لليزر بشكل كبير. أما مصباح بخار الزئبق فهو مصباح خطي، أي أنه يُصدر ضوءًا بالقرب من ذروة الأطوال الموجية. في المقابل، يتميز قوس الزينون بطيف انبعاث مستمر بكثافة ثابتة تقريبًا في نطاق 300-800  نانومتر، وبإشعاع كافٍ لإجراء قياسات تصل إلى ما يزيد قليلاً عن 200  نانومتر.

يمكن استخدام المرشحات و/أو أحاديات اللون في أجهزة قياس الفلورية. ينقل أحادي اللون ضوءًا بطول موجي قابل للتعديل وبتفاوت قابل للتعديل. يستخدم النوع الأكثر شيوعًا من أحاديات اللون محزز حيود، أي أن الضوء المتوازي يُضيء محززًا ويخرج بزاوية مختلفة تبعًا للطول الموجي. يمكن بعد ذلك ضبط أحادي اللون لاختيار الأطوال الموجية المراد نقلها. للسماح بقياسات التباين، يلزم إضافة مرشحين للاستقطاب: أحدهما بعد أحادي اللون أو مرشح الإثارة، والآخر قبل أحادي اللون أو مرشح الانبعاث.

كما ذُكر سابقًا، يُقاس التألق غالبًا بزاوية 90° بالنسبة لضوء الإثارة. يُستخدم هذا الوضع بدلًا من وضع المستشعر على خط ضوء الإثارة بزاوية 180° لتجنب تداخل ضوء الإثارة المنقول. لا يوجد مُوحِّد لون مثالي، إذ يُمرِّر بعض الضوء الشارد ، أي الضوء ذي الأطوال الموجية المختلفة عن الطول الموجي المستهدف. يُفترض أن يُمرِّر مُوحِّد اللون المثالي الضوء ضمن النطاق المُحدد فقط، وأن يتمتع بنقل عالٍ لا يعتمد على الطول الموجي. عند القياس بزاوية 90°، يكون الضوء الشارد ناتجًا فقط عن الضوء المُشتَّت بواسطة العينة. ينتج عن ذلك نسبة إشارة إلى ضوضاء أفضل، ويُخفِّض حد الكشف بمقدار 10000 ضعف تقريبًا ^{[ 5 ]،} مقارنةً بوضع القياس بزاوية 180°. علاوة على ذلك، يُمكن أيضًا قياس التألق من الأمام، وهو ما يُجرى غالبًا للعينات العكرة أو المعتمة ^{[ 6 ] .}

يمكن أن يكون الكاشف أحادي القناة أو متعدد القنوات. يستطيع الكاشف أحادي القناة رصد شدة طول موجي واحد فقط في كل مرة، بينما يرصد الكاشف متعدد القنوات شدة جميع الأطوال الموجية في آن واحد، مما يجعل استخدام أحادي اللون أو المرشح غير ضروري.

تستطيع أجهزة قياس الفلورية الأكثر تنوعًا، المزودة بموحدي لون مزدوجين ومصدر ضوء إثارة مستمر، تسجيل كلٍ من طيف الإثارة وطيف التألق. عند قياس أطياف التألق، يُحافظ على ثبات طول موجة ضوء الإثارة، ويفضل أن يكون عند طول موجة امتصاص عالٍ، بينما يقوم موحد لون الانبعاث بمسح الطيف. أما عند قياس أطياف الإثارة، فيُحافظ على ثبات طول الموجة المار عبر مرشح الانبعاث أو موحد اللون، بينما يقوم موحد لون الإثارة بالمسح. عادةً ما يكون طيف الإثارة مطابقًا لطيف الامتصاص، حيث تتناسب شدة التألق طرديًا مع الامتصاص. ^{[ 7 ]}

عند التركيزات المنخفضة، ستكون شدة الفلورة متناسبة بشكل عام مع تركيز الفلوروفور .

على عكس مطيافية الأشعة فوق البنفسجية/المرئية، يصعب الحصول على أطياف "قياسية" مستقلة عن الجهاز. تؤثر عدة عوامل على الأطياف وتشوهها، وتُعد التصحيحات ضرورية للحصول على أطياف "حقيقية"، أي مستقلة عن الجهاز. سيتم هنا تصنيف أنواع التشوهات المختلفة إلى تلك المتعلقة بالجهاز أو بالعينة. أولًا، سنناقش التشوه الناتج عن الجهاز. بدايةً، تتغير شدة مصدر الضوء وخصائص الطول الموجي بمرور الوقت خلال كل تجربة وبين التجارب. علاوة على ذلك، لا يوجد مصباح ذو شدة ثابتة عند جميع الأطوال الموجية. لتصحيح ذلك، يمكن استخدام فاصل شعاع بعد أحادي اللون أو مرشح الإثارة لتوجيه جزء من الضوء إلى كاشف مرجعي.

بالإضافة إلى ذلك، يجب مراعاة كفاءة نقل أحادي اللون والمرشحات، والتي قد تتغير بمرور الوقت. كما تختلف كفاءة نقل أحادي اللون تبعًا للطول الموجي. لهذا السبب، يُنصح بوضع كاشف مرجعي اختياري بعد أحادي اللون أو المرشح المستخدم في الإثارة. وتعتمد نسبة الفلورة التي يلتقطها الكاشف أيضًا على النظام. علاوة على ذلك، تختلف الكفاءة الكمية للكاشف، أي نسبة الفوتونات المكتشفة، بين الكواشف المختلفة، ومع تغير الطول الموجي والزمن، نظرًا لتدهور الكاشف مع مرور الوقت.

هناك موضوعان آخران يجب أخذهما في الاعتبار، وهما البصريات المستخدمة لتوجيه الإشعاع ووسيلة حفظ أو احتواء عينة المادة (وتسمى الخلية أو الحُبيبة). في معظم قياسات الأشعة فوق البنفسجية والمرئية والأشعة تحت الحمراء القريبة، يُعد استخدام حُبيبات الكوارتز الدقيقة ضروريًا. في كلتا الحالتين، من المهم اختيار مواد ذات امتصاص منخفض نسبيًا في نطاق الطول الموجي المطلوب. يُعد الكوارتز مثاليًا لأنه ينقل الضوء من 200  نانومتر إلى 2500  نانومتر؛ بل إن الكوارتز عالي الجودة يمكنه نقل الضوء حتى 3500  نانومتر، في حين أن خصائص امتصاص المواد الأخرى قد تحجب التألق الصادر من العينة.

يُعدّ تصحيح جميع هذه العوامل الآلية للحصول على طيف "قياسي" عمليةً شاقة، ولا تُطبّق عمليًا إلا عند الضرورة القصوى. وينطبق هذا، على سبيل المثال، عند قياس المردود الكمي أو عند تحديد الطول الموجي ذي أعلى شدة انبعاث.

كما ذُكر سابقًا، تنشأ التشوهات أيضًا من العينة نفسها. لذا، يجب مراعاة بعض جوانب العينة. أولًا، قد يُقلل التحلل الضوئي من شدة التألق بمرور الوقت. كما يجب مراعاة تشتت الضوء. من أهم أنواع التشتت في هذا السياق تشتت رايلي وتشتت رامان. يتميز الضوء المتشتت بتشتت رايلي بنفس طول موجة الضوء الساقط، بينما في تشتت رامان، يتغير طول موجة الضوء المتشتت عادةً إلى أطوال موجية أطول. ينتج تشتت رامان عن حالة إلكترونية افتراضية يُحفزها ضوء الإثارة. من هذه الحالة الافتراضية ، قد تعود الجزيئات إلى مستوى اهتزازي آخر غير الحالة الأرضية الاهتزازية. ^{[ 9 ] في أطياف التألق، يُلاحظ دائمًا فرق ثابت في العدد الموجي بالنسبة إلى العدد الموجي للإثارة، على سبيل المثال ،} تظهر الذروة عند عدد موجي أقل بمقدار 3600  سم⁻¹ من ضوء الإثارة في الماء.

من الجوانب الأخرى التي يجب مراعاتها تأثيرات الترشيح الداخلي. ^{[ 10 ] [ 11 ]} وتشمل هذه التأثيرات إعادة الامتصاص. تحدث إعادة الامتصاص نتيجة امتصاص جزيء آخر أو جزء من جزيء كبير عند الأطوال الموجية التي ينبعث منها الإشعاع من الفلوروفور. في هذه الحالة، قد تُمتص بعض أو كل الفوتونات المنبعثة من الفلوروفور مرة أخرى. يحدث تأثير ترشيح داخلي آخر بسبب التركيزات العالية للجزيئات الماصة، بما في ذلك الفلوروفور. والنتيجة هي أن شدة ضوء الإثارة لا تكون ثابتة في جميع أنحاء المحلول. وبالتالي، لا تصل سوى نسبة ضئيلة من ضوء الإثارة إلى الفلوروفورات المرئية لنظام الكشف. تُغير تأثيرات الترشيح الداخلي طيف وشدة الضوء المنبعث، ولذلك يجب أخذها في الاعتبار عند تحليل طيف انبعاث الضوء الفلوري. ^{[ 7 ] [ 12 ]}

يُعدّ تألق البروتين المطوي مزيجًا من تألق الأحماض الأمينية العطرية الفردية. ويعود معظم انبعاث التألق الذاتي للبروتين المطوي إلى إثارة بقايا التربتوفان ، مع بعض الانبعاثات الناتجة عن التيروسين والفينيل ألانين؛ إلا أن روابط ثنائي الكبريتيد تُظهر أيضًا امتصاصًا ملحوظًا في هذا النطاق الموجي. عادةً، يبلغ طول موجة امتصاص التربتوفان القصوى 280  نانومتر، وتكون ذروة انبعاثه متغيرة مع المذيب ، حيث تتراوح من 300 إلى 350  نانومتر تقريبًا اعتمادًا على قطبية البيئة المحيطة ^{[ 13 ].} لذا، يُمكن استخدام تألق البروتين كأداة تشخيصية للحالة البنيوية للبروتين ^{[ 14 ]} . علاوة على ذلك، يتأثر تألق التربتوفان بشدة بقرب الأحماض الأمينية الأخرى ( أي أن المجموعات البروتونية القريبة، مثل الأسبارتات أو الغلوتامات، قد تُسبب إخماد تألق التربتوفان). كذلك، من الممكن حدوث انتقال للطاقة بين التربتوفان والأحماض الأمينية الفلورية الأخرى، مما قد يؤثر على التحليل، لا سيما عند استخدام طريقة فورستر الحمضية. إضافةً إلى ذلك، يُعد التربتوفان حمضًا أمينيًا نادرًا نسبيًا؛ إذ تحتوي العديد من البروتينات على بقايا تربتوفان واحدة أو بضع بقايا فقط. لذا، يُمكن أن يكون قياس فلورية التربتوفان طريقة حساسة للغاية لتحديد الحالة التركيبية لبقايا التربتوفان الفردية. وتكمن ميزته مقارنةً بالمجسات الخارجية في عدم تغيير البروتين نفسه. عمليًا، يقتصر استخدام الفلورية الذاتية لدراسة تركيب البروتين على الحالات التي تحتوي على عدد قليل من بقايا التربتوفان (أو ربما بقايا واحدة فقط)، نظرًا لاختلاف البيئة المحلية التي تتعرض لها كل بقايا، مما يُؤدي إلى أطياف انبعاث مختلفة.

يُعدّ التربتوفان حمضًا أمينيًا فلوريًا جوهريًا هامًا، يُمكن استخدامه لتقدير طبيعة البيئة الدقيقة المحيطة به. عند إجراء تجارب باستخدام عوامل مُفسِّخة أو مواد فعالة سطحية أو جزيئات أخرى ذات خصائص مُحبة للماء وكارهة له ، قد تتغير هذه البيئة. على سبيل المثال، إذا تم تغيير طبيعة بروتين يحتوي على جزيء تربتوفان واحد في نواته الكارهة للماء مع ارتفاع درجة الحرارة، فسيظهر طيف انبعاث مُنزاح نحو الأحمر. ويعود ذلك إلى تعرض التربتوفان لبيئة مائية بدلًا من وجوده داخل البروتين الكاره للماء. في المقابل، ستؤدي إضافة مادة فعالة سطحية إلى بروتين يحتوي على تربتوفان مُعرَّض للمذيب المائي إلى ظهور طيف انبعاث مُنزاح نحو الأزرق إذا كان التربتوفان مُدمجًا في حويصلة أو ميسيل المادة الفعالة السطحية . ^{[ 15 ]} يُمكن ربط البروتينات التي تفتقر إلى التربتوفان بجزيء فلوري .

مع إثارة التألق عند 295 نانومتر، يكون طيف انبعاث التربتوفان هو السائد على تألق التيروسين والفينيل ألانين الأضعف .

البروتينات الفلورية المعتمدة على الزمن (TRFPs) هي جزيئات حيوية مشتقة من بروتينات فلورية طبيعية، مثل البروتين الفلوري الأخضر (GFP) المستخلص من قنديل البحر Aequorea victoria . تتألق هذه البروتينات لفترات زمنية محدودة (1-10 نانوثانية) تتغير تبعًا لعوامل بيئية كدرجة الحموضة أو التفاعلات الجزيئية. وقد بدأ استخدام هذه البروتينات في أوائل العقد الأول من الألفية الثانية، حيث ساهمت في تحسين تصوير المجهر الفلوري المعتمد على الزمن (FLIM)، مما يوفر تباينًا فائقًا مقارنةً بالأساليب القائمة على شدة الإضاءة، وذلك بتقليل التألق الذاتي وتمكين تعدد الإشارات. ^{[ 16 ]}

تُصدر بروتينات TRFP ضوءًا بعد إثارتها، ويتم قياس أعمارها باستخدام تقنية عد الفوتونات المفردة المرتبطة زمنيًا. تتميز أنواعها المختلفة، مثل mTFP1 (أزرق مخضر، ~2.6 نانوثانية) وmScarlet-I (أحمر، ~3.1 نانوثانية)، بعائد كمي عالٍ وثبات ضوئي، مما يجعلها مناسبة لتصوير الخلايا الحية. تندمج بروتينات TRFP المشفرة جينيًا في الخلايا عبر البلازميدات ، مما يسمح بتتبع الأحداث غير الجراحية لطي البروتين، أو إشارات الأيونات، أو النشاط الإنزيمي. ^{[ 16 ]}

تتميز بروتينات TRFP المُحسّنة بالذكاء الاصطناعي بعمر أطول وانبعاثات أكثر سطوعًا، مما يُحسّن من دقة التصوير المجهري فائق الدقة. تُستخدم هذه البروتينات في الكائنات النموذجية مثل ذبابة الفاكهة وسمك الزيبرا . تشمل التحديات مخاطر التلاشي الضوئي، وتعقيد أجهزة قياس عمر الفلورة (FLIM)، ومحدودية الاختراق في الأنسجة العميقة بسبب التشتت. قد تُعالج المتغيرات ذات الإزاحة الحمراء هذه المشكلة. ^{[ 16 ]}

وتسعى أبحاث أخرى إلى دمج بروتينات TRFP مع تقنية CRISPR لإجراء دراسات جينية مستهدفة. ^{[ 16 ]}

يتطلب دمج تقنية تصوير عمر الفلورة (FLIM) في التشخيص السريري، مثل الكشف عن البيئات الدقيقة للأورام، تقنية فعالة من حيث التكلفة. وتهدف الأبحاث الجارية إلى تحسين السطوع، وتقليل السمية، وتوسيع النطاقات الطيفية. ^{[ 16 ]}

في عام 2025، ابتكر الباحثون 28 بروتينًا جديدًا من بروتينات التألق الفلوري المقاومة للضوء (TRFPs)، مضيفين ألوانًا وفترات زمنية توفر خيارات أوسع لاستخدام هذه التقنية. وقد قاموا بتحوير بعض بقايا الأحماض الأمينية لزعزعة استقرار المنطقة المسؤولة عن توليد الإشارة الفلورية. ^{[ 17 ]}

تُستخدم مطيافية التألق في مجالات بحثية متنوعة، منها الكيمياء الحيوية والطبية والكيميائية، لتحليل المركبات العضوية . كما ورد في تقرير استخدامها في التمييز بين أورام الجلد الخبيثة والحميدة.

تُعد تقنيات مطيافية التألق الذري (AFS) مفيدة في أنواع أخرى من التحليل/القياس لمركب موجود في الهواء أو الماء أو الوسائط الأخرى، مثل CVAFS الذي يستخدم للكشف عن المعادن الثقيلة، مثل الزئبق.

يمكن أيضًا استخدام التألق لإعادة توجيه الفوتونات، انظر جامع الطاقة الشمسية المتألق .

بالإضافة إلى ذلك، يمكن تكييف مطيافية التألق مع المستوى المجهري باستخدام قياس التألق المجهري

في الكيمياء التحليلية، تُستخدم أجهزة الكشف عن الفلورة مع جهاز HPLC .

في مجال أبحاث المياه، يمكن استخدام مطيافية التألق لمراقبة جودة المياه عن طريق الكشف عن الملوثات العضوية. ^{[ 18 ]} وقد مكّنت التطورات الحديثة في علوم الحاسوب والتعلم الآلي من الكشف عن التلوث البكتيري للمياه. ^{[ 19 ]}

في البحوث الطبية الحيوية، تُستخدم مطيافية التألق لتقييم كفاءة توزيع الدواء من خلال الربط المتشابك للعوامل الفلورية مع مختلف الأدوية. ^{[ 20 ]}

يُمكّن التحليل الطيفي الفلوري في البحوث الفيزيائية الحيوية الأفراد من تصوير وتوصيف نطاقات الدهون داخل الأغشية الخلوية. ^{[ 21 ]}

تُستخدم TFRPs في نقل طاقة رنين فورستر (FRET) لدراسة التقارب الجزيئي ومراقبة التغيرات الأيضية في الأمراض بما في ذلك السرطان أو التنكس العصبي .

• مجسات اللانثانيدات
• التألق الضوئي
• التألق الناتج عن الليزر

• Fluorophores.org ، قاعدة بيانات الأصباغ الفلورية
• OpenFluor ، أدوات مجتمعية تدعم التحليل الكيميائي القياسي لتألق المواد العضوية
• قاعدة بيانات للمعادن الفلورية مع الصور والمنشطات والأطياف (fluomin.org)