صبغة هوكست

تُعدّ أصباغ هوكست جزءًا من عائلة الأصباغ الفلورية الزرقاء المستخدمة لتلوين الحمض النووي (DNA) . ^{[ 1 ] [ 2 ]} طُوّرت هذه الأصباغ ثنائية البنزيميد في الأصل من قِبل شركة هوكست إيه جي ، التي رقّمت جميع مركباتها بحيث يكون صبغ هوكست 33342 هو المركب رقم 33342 الذي أنتجته الشركة. توجد ثلاثة أصباغ هوكست ذات صلة: هوكست 33258، وهوكست 33342، وهوكست 34580. يُعدّ صبغ هوكست 33258 وهوكست 33342 الأكثر استخدامًا، ولهما أطياف إثارة - انبعاث متشابهة .

يُثار كلا الصبغين بواسطة الأشعة فوق البنفسجية عند حوالي 350 نانومتر ، ويُصدران ضوءًا فلوريًا أزرقًا سماويًا حول ذروة طيف الانبعاث عند 461 نانومتر. ويبلغ انبعاث الفلورة الأقصى للصبغ غير المرتبط نطاق 510-540 نانومتر. ويمكن إثارة صبغات هوكست باستخدام مصباح زينون أو مصباح قوس زئبقي أو ليزر فوق بنفسجي . ويوجد انزياح ستوكس كبير بين طيفي الإثارة والانبعاث، مما يجعل صبغات هوكست مفيدة في التجارب التي تُستخدم فيها عدة فلوروفورات . كما تزداد شدة فلورة صبغات هوكست مع ارتفاع درجة حموضة المذيب . ^{[ 3 ]}   

تذوب أصباغ هوكست في الماء وفي المذيبات العضوية مثل ثنائي ميثيل فورماميد أو ثنائي ميثيل سلفوكسيد . ويمكن الوصول إلى تركيزات تصل إلى 10  ملغم/مل. وتكون المحاليل المائية مستقرة عند درجة حرارة 2-6  درجة مئوية لمدة ستة أشهر على الأقل عند حمايتها من الضوء. أما للتخزين طويل الأمد، فيتم تجميد المحاليل عند درجة حرارة -20  درجة مئوية أو أقل. ^{[ 3 ]}

ترتبط الأصباغ بالأخدود الصغير للحمض النووي المزدوج، مع ميلٍ واضحٍ للتسلسلات الغنية بالأدينين والثايمين . ورغم قدرة هذه الأصباغ على الارتباط بجميع الأحماض النووية، إلا أن سلاسل الحمض النووي المزدوجة الغنية بالأدينين والثايمين تُعزز التألق بشكلٍ ملحوظ. [ ^{4 ] تتميز} أصباغ هوكست بنفاذيتها للخلايا وقدرتها على الارتباط بالحمض النووي في الخلايا الحية أو المثبتة . ولذلك، تُسمى هذه الأصباغ غالبًا بالأصباغ فوق الحيوية ، أي أن الخلايا الحية تبقى حية بعد معالجتها بهذه المركبات. كما تستطيع الخلايا التي تُعبر عن بروتينات ناقلة خاصة بكاسيت ربط الأدينوسين ثلاثي الفوسفات (ATP) نقل هذه الأصباغ بنشاط خارج سيتوبلازمها .

يُستخدم عادةً تركيز يتراوح بين 0.1 و12  ميكروغرام/مل لتلوين الحمض النووي في البكتيريا أو الخلايا حقيقية النواة . تُلوّن الخلايا لمدة تتراوح بين دقيقة واحدة و30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة أو عند 37  درجة مئوية، ثم تُغسل لإزالة الصبغة غير المرتبطة. قد يُلاحظ توهج أخضر لصبغة هوكست غير المرتبطة على العينات التي لُوّنت بكمية زائدة من الصبغة أو التي غُسلت جزئيًا. ^{[ 3 ]} غالبًا ما تُستخدم صبغات هوكست كبديل لصبغة أخرى للأحماض النووية تُسمى DAPI .

تتمثل الاختلافات الرئيسية بين أصباغ هوكست وصبغة DAPI فيما يلي:

• تُعد أصباغ هوكست أقل سمية من صبغة DAPI، مما يضمن حيوية أعلى للخلايا المصبوغة. ^{[ 5 ]}
• إن مجموعة الإيثيل الإضافية في بعض أصباغ هوكست (هوكست 33342) تجعلها أكثر نفاذية للخلايا. ^{[ 6 ]}
• توجد أصباغ لتلوين النوى تسمح بمعرفة مدى حيوية الخلايا بعد التلوين.

يُخمد كل من هوكست 33342 و33258 بواسطة بروموديوكسي يوريدين (BrdU)، الذي يُستخدم عادةً للكشف عن الخلايا المنقسمة. يتميز هوكست 33342 بنفاذية خلوية أكبر بعشرة أضعاف من هوكست 33258. تستطيع الخلايا دمج BrdU في الحمض النووي المُصنّع حديثًا كبديل للثيميدين . عند دمج BrdU في الحمض النووي، يُفترض أن البروم يُشوه الأخدود الصغير، مما يمنع أصباغ هوكست من الوصول إلى موقع ارتباطها الأمثل. يكون ارتباط أصباغ هوكست بالحمض النووي المُستبدل بـ BrdU أقوى، ومع ذلك، لا ينتج عنه أي تألق. يمكن استخدام أصباغ هوكست مع BrdU لمراقبة تقدم دورة الخلية . ^{[ 7 ] [ 8 ]}

تُستخدم أصباغ هوكست بشكل شائع لتلوين الحمض النووي الجينومي في التطبيقات التالية:

• المجهر الفلوري والكيمياء المناعية ، غالباً مع الفلوروفورات الأخرى ^{[ 9 ]}
• يُستخدم قياس التدفق الخلوي لعدّ الخلايا أو فرزها. ومن الأمثلة على ذلك استخدام أصباغ هوكست لتحليل عدد الخلايا في كل مرحلة من مراحل دورة الخلية ضمن مجموعة معينة ^{[ 10 ].}
• الكشف عن الحمض النووي في وجود الحمض النووي الريبي في هلامات الأغاروز ^{[ 11 ]}
• تحديد الحمض النووي الآلي ^{[ 12 ]}
• فرز الكروموسومات ^{[ 11 ]}

يُستخدم تدفق صبغة هوكست أيضًا لدراسة الخلايا الجذعية المكونة للدم والخلايا الجذعية الجنينية. ولأن هذه الخلايا قادرة على إخراج الصبغة بكفاءة، يمكن الكشف عنها باستخدام قياس التدفق الخلوي فيما يُعرف باسم المجموعة الجانبية . ويتم ذلك بتمرير الفلورة المنبعثة من صبغة هوكست المُثارة عبر مرشحين أحمر وأزرق، ثم رسم منحنى فلورة هوكست الأحمر مقابل الأزرق.

نظرًا لأن صبغات هوكست ترتبط بالحمض النووي، فإنها تعيق تضاعف الحمض النووي أثناء انقسام الخلايا . ونتيجة لذلك، فهي قد تكون مُسببة للطفرات والسرطانات ، لذا يجب توخي الحذر عند التعامل معها والتخلص منها. تُستخدم صبغة هوكست لفرز الحيوانات المنوية في الماشية والبشر، وقد أُثير جدل حول سلامتها. ^{[ 13 ] [ 14 ]}

• الآثار الطيفية للأصباغ الفلورية
• دليل استخدام صبغات هوكست
• دليل إلكتروني للمجسات الفلورية وتقنيات الوسم التجارية