اختبار الإليزا

📅 آخر تحديث: ٢٥ يوليو ٢٠٢٦
✍️ نُشر في: ٢٥ يوليو ٢٠٢٦
📷 يحتوي على 10 صور
الموسوعة الحرة
اختبار الإليزا
ELISA قيد التطوير باستخدام ركيزة TMB للأجسام المضادة الثانوية المرتبطة ببيروكسيداز الفجل
شبكةد004797
[تعديل على ويكي بيانات]

اختبار الممتز المناعي المرتبط بالإنزيم ( ELISA ) ( / ɪˈlaɪzə / ، / ˌiːˈlaɪzə / ) هو اختبار كيميائي حيوي تحليلي شائع الاستخدام ، وصفه لأول مرة إيفا إنجفال وبيتر بيرلمان في عام 1971. [ 1 ] الاختبار هو نوع من اختبار المناعة الإنزيمية في الطور الصلب ( EIA) للكشف عن وجود ربيطة (عادةً بروتين) في عينة سائلة باستخدام أجسام مضادة موجهة ضد الربيطة المراد قياسها. تم استخدام ELISA كأداة تشخيصية في الطب وعلم أمراض النبات والتكنولوجيا الحيوية ، بالإضافة إلى فحص مراقبة الجودة في مختلف الصناعات.

في أبسط أشكال اختبار ELISA، يتم ربط المستضدات من العينة المراد اختبارها بسطح ما. ثم يتم وضع جسم مضاد مطابق على السطح حتى يتمكن من ربط المستضد. يتم ربط هذا الجسم المضاد بإنزيم ثم تتم إزالة أي أجسام مضادة غير مرتبطة. في الخطوة الأخيرة، تتم إضافة مادة تحتوي على ركيزة الإنزيم . إذا كان هناك ارتباط، فإن التفاعل اللاحق ينتج إشارة يمكن اكتشافها، وغالبًا ما تكون تغيرًا في اللون.

يتضمن إجراء اختبار ELISA وجود جسم مضاد واحد على الأقل يتميز بخصوصية مستضد معين. يتم تثبيت العينة التي تحتوي على كمية غير معروفة من المستضد على دعامة صلبة (عادةً ما تكون لوحة ميكروتيتر من البوليسترين ) إما بشكل غير محدد (عبر الامتصاص على السطح) أو بشكل محدد (عبر الالتقاط بواسطة جسم مضاد آخر خاص بنفس المستضد، في اختبار ELISA "الساندويتش"). بعد تثبيت المستضد، تتم إضافة الجسم المضاد الكاشف، مما يشكل معقدًا مع المستضد. يمكن ربط الجسم المضاد الكاشف تساهميًا بإنزيم أو يمكن اكتشافه هو نفسه بواسطة جسم مضاد ثانوي مرتبط بإنزيم من خلال الاقتران الحيوي . بين كل خطوة، يتم غسل اللوحة عادةً بمحلول منظف خفيف لإزالة أي بروتينات أو أجسام مضادة غير مرتبطة بشكل محدد. بعد خطوة الغسيل النهائية، يتم تطوير اللوحة عن طريق إضافة ركيزة إنزيمية لإنتاج إشارة مرئية ، والتي تشير إلى كمية المستضد في العينة.

من الجدير بالذكر أن ELISA يمكنها إجراء أشكال أخرى من اختبارات ربط الربيطة بدلاً من الاختبارات "المناعية" الصارمة، على الرغم من أن الاسم يحمل "المناعي" الأصلي بسبب الاستخدام الشائع وتاريخ تطوير هذه الطريقة. تتطلب التقنية بشكل أساسي أي كاشف ربط يمكن تثبيته على الطور الصلب جنبًا إلى جنب مع كاشف كشف سيرتبط بشكل خاص ويستخدم إنزيمًا لتوليد إشارة يمكن قياسها بشكل صحيح. بين عمليات الغسيل، يبقى فقط الربيطة ونظرائه المرتبطين بشكل خاص مرتبطين بشكل خاص أو "ممتصين مناعيًا" من خلال تفاعلات المستضد والأجسام المضادة مع الطور الصلب، بينما يتم غسل المكونات غير المحددة أو غير المرتبطة. على عكس تنسيقات اختبار المختبر الرطب الطيفي الأخرى حيث يمكن إعادة استخدام نفس بئر التفاعل (على سبيل المثال، كوفيت) بعد الغسيل، فإن ألواح ELISA تحتوي على منتجات التفاعل الممتصة مناعيًا على الطور الصلب، وهو جزء من اللوحة، وبالتالي لا يمكن إعادة استخدامها بسهولة.

مبدأ

كاختبار كيميائي حيوي تحليلي وتقنية "مختبر رطب"، تتضمن تقنية ELISA الكشف عن محلل (أي المادة المحددة التي يتم تحليل وجودها كميًا أو نوعيًا) في عينة سائلة من خلال طريقة تستمر في استخدام الكواشف السائلة أثناء التحليل (أي التسلسل المتحكم فيه للتفاعلات الكيميائية الحيوية التي ستولد إشارة يمكن قياسها بسهولة وتفسيرها كمقياس لكمية المحلل في العينة) والتي تظل سائلة وتظل داخل حجرة التفاعل أو البئر المطلوب لإبقاء المتفاعلات محتوية. [2] [3] وهذا على النقيض من تقنيات "المختبر الجاف" التي تستخدم الشرائط الجافة. حتى إذا كانت العينة سائلة (على سبيل المثال، قطرة صغيرة مقاسة)، فإن خطوة الكشف النهائية في التحليل "الجاف" تتضمن قراءة الشريط المجفف بطرق مثل الانعكاس ولا تحتاج إلى حجرة احتواء التفاعل لمنع الانسكاب أو الاختلاط بين العينات. [4]

كاختبار غير متجانس، يفصل ELISA بعض مكونات خليط التفاعل التحليلي عن طريق امتصاص مكونات معينة على طور صلب مثبت فعليًا. في ELISA، تُضاف عينة سائلة إلى طور صلب ثابت بخصائص ربط خاصة ويتبع ذلك العديد من الكواشف السائلة التي تُضاف بشكل متتابع، وتُحضن، وتُغسل، يتبعها بعض التغيير البصري (على سبيل المثال، تطور اللون بواسطة ناتج التفاعل الأنزيمي) في السائل النهائي في البئر الذي يتم قياس كمية المحلل منه. تعتمد "القراءة" الكمية عادةً على اكتشاف شدة الضوء المنقول بواسطة مطيافية ضوئية ، والتي تتضمن تحديد كمية انتقال بعض الأطوال الموجية المحددة للضوء عبر السائل (وكذلك الجزء السفلي الشفاف من البئر في شكل لوحة متعددة الآبار). [2] [3] تعتمد حساسية الكشف على تضخيم الإشارة أثناء التفاعلات التحليلية. نظرًا لأن تفاعلات الإنزيم هي عمليات تضخيم معروفة جدًا، فإن الإشارة يتم إنشاؤها بواسطة الإنزيمات المرتبطة بكاشفات الكشف بنسب ثابتة للسماح بالقياس الدقيق، ومن هنا جاء اسم "مرتبط بالإنزيم". [5]

يُطلق على المحلل أيضًا اسم الربيطة لأنه سيرتبط أو يترابط بشكل خاص مع كاشف الكشف، وبالتالي يقع اختبار ELISA ضمن الفئة الأكبر من اختبارات ربط الربيطة . [2] يكون كاشف الربط الخاص بالربيطة "مُثَبَّتًا"، أي أنه عادةً ما يُطلى ويُجفف على القاع الشفاف وأحيانًا أيضًا على الجدار الجانبي لبئر [6] ("الطور الصلب"/"الركيزة الصلبة" الثابتة هنا على عكس الجسيمات الدقيقة/الخرز الصلبة التي يمكن غسلها)، والتي عادةً ما تكون مبنية على شكل صفيحة متعددة الآبار تُعرف باسم "صفيحة ELISA". تقليديًا، مثل الأشكال الأخرى من الاختبارات المناعية ، تُستخدم خصوصية تفاعل نوع المستضد - الجسم المضاد لأنه من السهل رفع جسم مضاد بشكل خاص ضد مستضد بكميات كبيرة ككاشف. بدلاً من ذلك، إذا كان المحلل نفسه جسمًا مضادًا، فيمكن استخدام مستضده المستهدف ككاشف رابط. [7]

تاريخ

قبل تطوير اختبار ELISA، كان الخيار الوحيد لإجراء اختبار مناعي هو اختبار المناعة الإشعاعي ، وهي تقنية تستخدم المستضدات أو الأجسام المضادة المشعة . في اختبار المناعة الإشعاعي، يوفر النشاط الإشعاعي الإشارة، التي تشير إلى ما إذا كان مستضد أو جسم مضاد معين موجودًا في العينة. تم وصف اختبار المناعة الإشعاعي لأول مرة في ورقة علمية كتبها روزالين سوسمان يالو وسولومون بيرسون نُشرت عام 1960. [8]

نظرًا لأن النشاط الإشعاعي يشكل تهديدًا محتملاً للصحة، فقد تم البحث عن بديل أكثر أمانًا. من الممكن أن يحل البديل المناسب للتحليل المناعي الإشعاعي محل الإشارة المشعة بإشارة غير مشعة. عندما تتفاعل الإنزيمات (مثل بيروكسيداز الفجل ) مع الركائز المناسبة (مثل ABTS أو TMB )، يحدث تغيير في اللون، والذي يستخدم كإشارة. ومع ذلك، يجب أن ترتبط الإشارة بوجود جسم مضاد أو مستضد، ولهذا السبب يجب ربط الإنزيم بجسم مضاد مناسب. تم تطوير عملية الربط هذه بشكل مستقل بواسطة Stratis Avrameas وGB Pierce. [9] نظرًا لأنه من الضروري إزالة أي جسم مضاد أو مستضد غير مرتبط بالغسيل، فيجب تثبيت الجسم المضاد أو المستضد على سطح الحاوية؛ أي يجب تحضير الممتز المناعي. تم نشر تقنية لإنجاز ذلك بواسطة Wide و Jerker Porath في عام 1966. [10]

في عام 1971، نشر بيتر بيرلمان وإيفا إنجفال في جامعة ستوكهولم في السويد، وأنتون شورز وباوك فان ويمن في هولندا بشكل مستقل أوراقًا بحثية تلخص هذه المعرفة في طرق لإجراء EIA/ELISA. [11] [12]

تتضمن اختبارات ELISA التقليدية عادةً مراسلين وركائز ملونة تنتج نوعًا من التغيير الملموس في اللون للإشارة إلى وجود مستضد أو محلل. تستخدم تقنيات ELISA الأحدث مراسلين فلوريين وكهروكيميائيين ضوئيين وكميين لتفاعل البوليميراز المتسلسل لإنشاء إشارات قابلة للقياس الكمي. يمكن أن تتمتع هذه المراسلات الجديدة بمزايا مختلفة، بما في ذلك الحساسيات الأعلى والإرسال المتعدد . [13] [14] من الناحية الفنية، فإن الاختبارات الأحدث من هذا النوع ليست اختبارات ELISA بشكل صارم، لأنها ليست "مرتبطة بالإنزيم"، ولكنها مرتبطة بدلاً من ذلك ببعض المراسلين غير الإنزيميين. ومع ذلك، ونظرًا لأن المبادئ العامة في هذه الاختبارات متشابهة إلى حد كبير، فغالبًا ما يتم تجميعها في نفس فئة اختبارات ELISA.

في عام 2012، تمكن اختبار ELISA فائق الحساسية القائم على الإنزيم باستخدام الجسيمات النانوية كمراسل كروموجيني من إعطاء إشارة لونية للعين المجردة، من خلال اكتشاف مخططات بسيطة للمحلل. يظهر اللون الأزرق للنتائج الإيجابية واللون الأحمر للنتائج السلبية. لاحظ أن هذا الكشف يمكنه فقط تأكيد وجود أو غياب المحلل، وليس التركيز الفعلي. [15]

أنواع

هناك العديد من اختبارات ELISA لجزيئات معينة تستخدم الأجسام المضادة المطابقة. تنقسم اختبارات ELISA إلى عدة أنواع من الاختبارات بناءً على كيفية ربط المحللات والأجسام المضادة واستخدامها. [16] [17] يتم وصف الأنواع الرئيسية هنا. [18]

مباشر

مخطط ELISA المباشر

تتبع خطوات اختبار ELISA المباشر [19] الآلية التالية:

  • يتم إضافة محلول منظم من المستضد المراد اختباره إلى كل بئر (عادةً صفائح ذات 96 بئرًا) من صفيحة الميكروتيتر ، حيث يتم منحه الوقت للالتصاق بالبلاستيك من خلال تفاعلات الشحنة.
  • يتم إضافة محلول من البروتين غير المتفاعل، مثل ألبومين مصل البقر أو الكازين ، إلى كل بئر لتغطية أي سطح بلاستيكي في البئر يظل غير مغطى بالمستضد.
  • يتم إضافة الجسم المضاد الأساسي مع إنزيم مرتبط (مترافق)، والذي يرتبط بشكل خاص بمستضد الاختبار الذي يغطي البئر.
  • ثم يتم إضافة ركيزة لهذا الإنزيم. وغالبًا ما يتغير لون هذه الركيزة عند تفاعلها مع الإنزيم.
  • كلما زاد تركيز الأجسام المضادة الأولية الموجودة في المصل، كلما كان تغير اللون أقوى. غالبًا ما يتم استخدام مقياس الطيف لإعطاء قيم كمية لقوة اللون.

يعمل الإنزيم كمضخم؛ حتى لو بقيت عدد قليل من الأجسام المضادة المرتبطة بالإنزيم مرتبطة، فإن جزيئات الإنزيم ستنتج العديد من جزيئات الإشارة. في حدود الفطرة السليمة، يمكن للإنزيم الاستمرار في إنتاج اللون إلى أجل غير مسمى، ولكن كلما زاد عدد الأجسام المضادة المرتبطة، كلما تطور اللون بشكل أسرع. أحد العيوب الرئيسية لـ ELISA المباشر هو أن طريقة تثبيت المستضد ليست محددة؛ عندما يتم استخدام المصل كمصدر لمستضد الاختبار، قد تلتصق جميع البروتينات في العينة بلوحة الميكروتيتر جيدًا، لذلك يجب أن تتنافس تركيزات صغيرة من المحلل في المصل مع بروتينات المصل الأخرى عند الارتباط بسطح البئر. توفر ELISA الساندويتش أو غير المباشر حلاً لهذه المشكلة، باستخدام جسم مضاد "ملتقط" خاص بمستضد الاختبار لسحبه من الخليط الجزيئي للمصل. [ بحاجة لمصدر ]

يمكن إجراء اختبار ELISA بتنسيق نوعي أو كمي. توفر النتائج النوعية نتيجة إيجابية أو سلبية بسيطة (نعم أو لا) لعينة. يتم تحديد الحد الفاصل بين الإيجابية والسلبية من قبل المحلل وقد يكون إحصائيًا. غالبًا ما يتم استخدام ضعف أو ثلاثة أضعاف الانحراف المعياري (الخطأ المتأصل في الاختبار) للتمييز بين العينات الإيجابية والسلبية. في اختبار ELISA الكمي، تتم مقارنة الكثافة الضوئية (OD) للعينة بمنحنى قياسي، وهو عادةً تخفيف متسلسل لمحلول معروف التركيز للجزيء المستهدف. على سبيل المثال، إذا أعادت عينة الاختبار OD 1.0، فيجب أن تكون النقطة على المنحنى القياسي التي أعطت OD = 1.0 من نفس تركيز المحلل مثل العينة. [ بحاجة لمصدر ]

يختلف استخدام ومعنى اسمي "ELISA غير المباشر" و"ELISA المباشر" في الأدبيات وعلى مواقع الويب حسب سياق التجربة. فعند تحليل وجود مستضد، يشير اسم "ELISA المباشر" إلى اختبار ELISA الذي يستخدم فيه جسم مضاد أولي مُسمَّى فقط، ويشير مصطلح "ELISA غير المباشر" إلى اختبار ELISA حيث يرتبط المستضد بالجسم المضاد الأولي الذي يتم اكتشافه بعد ذلك بواسطة جسم مضاد ثانوي مُسمَّى. وفي الحالة الأخيرة، يكون اختبار ELISA الساندويتش مختلفًا بوضوح عن اختبار ELISA غير المباشر. وعندما يكون الجسم المضاد "الأولي" محل اهتمام، على سبيل المثال في حالة تحليلات التحصين، يتم اكتشاف هذا الجسم المضاد مباشرة بواسطة الجسم المضاد الثانوي، وينطبق مصطلح "ELISA غير المباشر" على بيئة بها جسمان مضادان. [ بحاجة لمصدر ]

شطيرة

اختبار الإليزا الساندويتش . (1) يتم طلاء اللوحة بجسم مضاد ملتقط؛ (2) تتم إضافة العينة، ويرتبط أي مستضد موجود بالجسم المضاد الملتقط؛ (3) تتم إضافة الجسم المضاد الكاشف، ويرتبط بالمستضد؛ (4) تتم إضافة الجسم المضاد الثانوي المرتبط بالإنزيم، ويرتبط بالجسم المضاد الكاشف؛ (5) تتم إضافة الركيزة، وتحويلها بواسطة الإنزيم إلى شكل قابل للكشف.

يتم استخدام اختبار ELISA "الساندويتش" للكشف عن مستضد العينة. [20] الخطوات هي:

  1. يتم تحضير السطح بكمية معروفة من الأجسام المضادة الملتقطة.
  2. يتم حظر أي مواقع ربط غير محددة على السطح.
  3. يتم وضع العينة المحتوية على المستضد على الصفيحة، ويتم التقاطها بواسطة الأجسام المضادة.
  4. يتم غسل اللوحة لإزالة المستضد غير المرتبط.
  5. يتم إضافة جسم مضاد محدد، ويرتبط بالمستضد (ومن هنا جاءت فكرة "الساندويتش": حيث يكون المستضد عالقًا بين جسمين مضادين). يمكن أن يكون هذا الجسم المضاد الأساسي موجودًا في مصل المتبرع، ليتم اختباره لمعرفة مدى تفاعله مع المستضد.
  6. يتم تطبيق الأجسام المضادة الثانوية المرتبطة بالإنزيم كأجسام مضادة للكشف، والتي ترتبط بشكل خاص بمنطقة Fc للجسم المضاد (غير محدد).
  7. يتم غسل اللوحة لإزالة المركبات غير المرتبطة بالأجسام المضادة والإنزيم.
  8. يتم إضافة مادة كيميائية ليتم تحويلها بواسطة الإنزيم إلى إشارة ملونة أو فلورية أو كهروكيميائية.
  9. يتم قياس الامتصاص أو الفلورسنت أو الإشارة الكهروكيميائية (على سبيل المثال، التيار) لآبار اللوحة لتحديد وجود وكمية المستضد.

تتضمن الصورة الموجودة على اليمين استخدام جسم مضاد ثانوي مرتبط بإنزيم، على الرغم من أنه من الناحية الفنية، ليس هذا ضروريًا إذا كان الجسم المضاد الأولي مرتبطًا بإنزيم (وهو ما سيكون اختبار ELISA المباشر). ومع ذلك، فإن استخدام جسم مضاد ثانوي مرتبط يتجنب العملية المكلفة المتمثلة في إنشاء أجسام مضادة مرتبطة بالإنزيم لكل مستضد قد يرغب المرء في اكتشافه. من خلال استخدام جسم مضاد مرتبط بالإنزيم يرتبط بمنطقة Fc للأجسام المضادة الأخرى، يمكن استخدام نفس الجسم المضاد المرتبط بالإنزيم في مجموعة متنوعة من المواقف. بدون الطبقة الأولى من الجسم المضاد "الالتقاط"، قد تمتص أي بروتينات في العينة (بما في ذلك بروتينات المصل) بشكل تنافسي على سطح اللوحة، مما يقلل من كمية المستضد المثبت. إن استخدام الجسم المضاد المحدد المنقى لربط المستضد بالبلاستيك يزيل الحاجة إلى تنقية المستضد من الخلطات المعقدة قبل القياس، مما يبسط الاختبار، ويزيد من خصوصية وحساسية الاختبار. لذلك، غالبًا ما تحتاج اختبارات ELISA الساندويتش المستخدمة في الأبحاث إلى التحقق من صحتها، لتقليل خطر النتائج الإيجابية الكاذبة. [21]

تنافسي

الاستخدام الثالث لـ ELISA هو من خلال الربط التنافسي. تختلف خطوات هذا الاختبار ELISA إلى حد ما عن المثالين الأولين:

يتم احتضان الجسم المضاد غير المسمى في وجود مستضده (العينة).

  1. يتم بعد ذلك إضافة مجمعات الأجسام المضادة/المستضدات المرتبطة هذه إلى بئر مغطى بالمستضد.
  2. يتم غسل اللوحة، وبالتالي تتم إزالة الأجسام المضادة غير المرتبطة. (كلما زاد عدد المستضدات في العينة، زاد عدد معقدات Ag-Ab المتكونة وبالتالي يقل عدد الأجسام المضادة غير المرتبطة المتاحة للارتباط بالمستضد في البئر، ومن هنا تأتي "المنافسة").
  3. يتم إضافة الجسم المضاد الثانوي الخاص بالجسم المضاد الأولي. يتم ربط هذا الجسم المضاد الثاني بالإنزيم.
  4. يتم إضافة ركيزة، وتقوم الإنزيمات المتبقية باستثارة إشارة كروموجينية أو فلورية.
  5. يتم إيقاف التفاعل لمنع التشبع النهائي للإشارة.

تتضمن بعض مجموعات ELISA التنافسية مستضدًا مرتبطًا بالإنزيم بدلاً من الأجسام المضادة المرتبطة بالإنزيم. يتنافس المستضد المسمى على مواقع ربط الأجسام المضادة الأولية مع مستضد العينة (غير المسمى). كلما قل عدد المستضدات في العينة، كلما تم الاحتفاظ بمزيد من المستضد المسمى في البئر وكلما كانت الإشارة أقوى.

عادة، لا يتم وضع المستضد أولاً في البئر.

للكشف عن الأجسام المضادة لفيروس نقص المناعة البشرية، يتم طلاء آبار صفيحة الميكروتيتر بمستضد فيروس نقص المناعة البشرية. يتم استخدام نوعين من الأجسام المضادة المحددة، أحدهما مرتبط بالإنزيم والآخر موجود في المصل (إذا كان المصل إيجابيًا للجسم المضاد). تحدث منافسة تراكمية بين النوعين من الأجسام المضادة لنفس المستضد، مما يتسبب في رؤية إشارة أقوى. يتم إضافة المصل المراد اختباره إلى هذه الآبار وحضنه عند 37 درجة مئوية، ثم غسله. إذا كانت الأجسام المضادة موجودة، يحدث تفاعل المستضد-الجسم المضاد. لا يتبقى أي مستضد للأجسام المضادة المحددة لفيروس نقص المناعة البشرية الموسومة بالإنزيم. تظل هذه الأجسام المضادة حرة عند الإضافة ويتم غسلها أثناء الغسيل. تتم إضافة الركيزة، ولكن لا يوجد إنزيم للعمل عليها، وبالتالي فإن النتيجة الإيجابية لا تظهر أي تغيير في اللون.

غير مباشر

لا يستخدم اختبار ELISA الرابع الآبار التقليدية، بل يترك المستضدات معلقة في سائل الاختبار. [22] [23]

  1. يتم تحضين الجسم المضاد غير المسمى في وجود مستضده (العينة)
  2. يتم توفير فترة حضانة كافية للسماح للأجسام المضادة بالارتباط بالمستضدات.
  3. يتم بعد ذلك تمرير العينة عبر حاوية Scavenger. يمكن أن تكون هذه الحاوية عبارة عن أنبوب اختبار أو قناة تدفق مصممة خصيصًا. يرتبط سطح حاوية Scavenger أو القناة بـ "مستضدات Scavenger". يمكن أن تكون هذه المستضدات متطابقة أو مشابهة بدرجة كافية للمستضدات الأولية التي سترتبط بها الأجسام المضادة الحرة.
  4. يجب أن يكون لدى حاوية Scavenger مساحة سطح كافية ووقت كافٍ للسماح لمستضدات Scavenger بالارتباط بجميع الأجسام المضادة الزائدة التي تم إدخالها إلى العينة.
  5. يتم تمرير العينة، التي تحتوي الآن على الأجسام المضادة المحددة والمرتبطة، عبر جهاز الكشف. يمكن أن يكون هذا الجهاز عبارة عن مقياس تدفق خلوي أو جهاز آخر يضيء العلامات ويسجل الاستجابة. [24]

يتيح هذا الاختبار تحديد مستضدات متعددة وحسابها في نفس الوقت. ويسمح هذا بتحديد سلالات معينة من البكتيريا من خلال علامتين مختلفتين (أو أكثر). إذا كانت العلامتان موجودتين على خلية، فإن الخلية هي تلك السلالة المحددة. إذا كانت واحدة فقط موجودة، فهي ليست كذلك.

يتم إجراء هذا الاختبار، بشكل عام، باختبار واحد في كل مرة ولا يمكن إجراؤه باستخدام لوحة الميكروتيتر . عادةً ما تكون المعدات المطلوبة أقل تعقيدًا ويمكن استخدامها في الميدان.

العلامات الأنزيمية المستخدمة بشكل شائع

يوضح الجدول التالي العلامات الأنزيمية المستخدمة عادة في اختبارات ELISA، والتي تسمح بقياس نتائج الاختبار عند الانتهاء.

  • يتحول OPD ( أو -فينيلينديامين ديهيدروكلوريد) إلى اللون الكهرماني للكشف عن HRP ( بيروكسيداز الفجل )، والذي يستخدم غالبًا كبروتين مترافق . [25]
  • يتحول لون TMB (3,3',5,5'-tetramethylbenzidine) إلى اللون الأزرق عند اكتشاف HRP ويتحول إلى اللون الأصفر بعد إضافة حمض الكبريتيك أو الفوسفوريك. [25]
  • يتحول لون ABTS (ملح ثنائي الأمونيوم 2,2'-Azinobis [3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid]) إلى اللون الأخضر عند اكتشاف HRP. [25]
  • يتحول PNPP ( فوسفات p -Nitrophenyl، ملح ثنائي الصوديوم) إلى اللون الأصفر عند الكشف عن الفوسفاتاز القلوي . [25]

التطبيقات

اختبار ELISA المزدوج المضاد لـ IgG البشري

نظرًا لأنه يمكن إجراء اختبار ELISA لتقييم وجود المستضد أو وجود الأجسام المضادة في العينة، فهو أداة مفيدة لتحديد تركيزات الأجسام المضادة في المصل (مثل اختبار فيروس نقص المناعة البشرية [26] أو فيروس غرب النيل ). كما وجد تطبيقات في صناعة الأغذية في الكشف عن مسببات الحساسية الغذائية المحتملة ، مثل الحليب والفول السوداني والجوز واللوز والبيض [27] وكاختبار دم مصلي لمرض الاضطرابات الهضمية . [28] [29] يمكن أيضًا استخدام ELISA في علم السموم كفحص افتراضي سريع لفئات معينة من الأدوية.

لوحة اختبار الممتز المناعي المرتبط بالإنزيم

كان اختبار ELISA هو أول اختبار فحص يستخدم على نطاق واسع للكشف عن فيروس نقص المناعة البشرية نظرًا لحساسيته العالية. في اختبار ELISA، يتم تخفيف مصل الشخص 400 مرة ووضعه على صفيحة ملتصقة بمستضدات فيروس نقص المناعة البشرية. إذا كانت الأجسام المضادة لفيروس نقص المناعة البشرية موجودة في المصل، فقد ترتبط بمستضدات فيروس نقص المناعة البشرية هذه. ثم يتم غسل الصفيحة لإزالة جميع المكونات الأخرى للمصل. ثم يتم وضع "جسم مضاد ثانوي" مُجهز خصيصًا - جسم مضاد يرتبط بأجسام مضادة أخرى - على الصفيحة، يليه غسل ​​آخر. يرتبط هذا الجسم المضاد الثانوي كيميائيًا مسبقًا بإنزيم.

وبالتالي، فإن الصفيحة سوف تحتوي على إنزيم بنسبة تتناسب مع كمية الأجسام المضادة الثانوية المرتبطة بالصفيحة. يتم وضع ركيزة للإنزيم، ويؤدي التحفيز بواسطة الإنزيم إلى تغيير في اللون أو الفلورسنت. يتم الإبلاغ عن نتائج ELISA كرقم؛ الجانب الأكثر إثارة للجدل في هذا الاختبار هو تحديد نقطة "القطع" بين النتيجة الإيجابية والسلبية.

يمكن تحديد نقطة القطع من خلال مقارنتها بمعيار معروف. إذا تم استخدام اختبار ELISA لفحص المخدرات في مكان العمل، يتم تحديد تركيز قطع، 50 نانوجرام/مل، على سبيل المثال، ويتم تحضير عينة تحتوي على التركيز القياسي للمحلل. تكون العينات غير المعروفة التي تولد إشارة أقوى من العينة المعروفة "إيجابية". أما العينات التي تولد إشارة أضعف فهي "سلبية".

توجد اختبارات ELISA للكشف عن أنواع مختلفة من الأمراض، مثل حمى الضنك والملاريا وداء شاغاس [30] ومرض جون وغيرها. [31] تُستخدم اختبارات ELISA أيضًا على نطاق واسع في التشخيص المخبري في المختبرات الطبية . تشمل الاستخدامات الأخرى لاختبار ELISA ما يلي :

مخطط انسيابي تخطيطي: ELISA وCOVID-19 doi.org/10.7717/peerj.10180

اعتبارًا من عام 2023، أصبحت ELISA هي الطريقة الأساسية للكشف عن مسببات الأمراض النباتية في جميع أنحاء العالم. [33]

مجموعة الجزيئات المفردة المرتبطة بالإنزيم (eSimoa)

يمثل eSimoa (مجموعة الجزيئات الفردية المرتبطة بالإنزيم) تطورًا كبيرًا لتقنية ELISA التقليدية (اختبار الممتز المناعي المرتبط بالإنزيم)، والتي تُستخدم على نطاق واسع في التشخيصات السريرية والبحث. من خلال تعزيز حساسية ودقة الكشف عن الجزيئات الحيوية بشكل كبير، يعمل eSimoa على توسيع قدرات ELISA، مما يتيح اكتشاف الجزيئات الحيوية عند تركيزات لم يكن من الممكن تحقيقها سابقًا باستخدام الاختبارات القياسية. [34]

تكنولوجيا

بناءً على المبادئ الأساسية لـ ELISA، يستخدم eSimoa حبيبات مغناطيسية لعزل الجزيئات الحيوية أو الإنزيمات بطريقة تشبه الكشف القائم على الألواح في ELISA. ومع ذلك، فإن eSimoa يطور هذا المفهوم من خلال تمكين قياسات التفاعل الأنزيمي على مستوى الجزيء الفردي، مما يحسن بشكل كبير حدود الكشف للإنزيمات والجزيئات الحيوية المختلفة. تسمح هذه الطريقة بالقياس الدقيق للبروتينات ذات الوفرة المنخفضة ونشاط الإنزيمات الحرجة مثل بروتين كيناز والتيلوميراز، والتي غالبًا ما تكون أقل من عتبة الكشف لـ ELISA التقليدية.

التطبيقات

إن الحساسية المعززة لـ eSimoa أمر بالغ الأهمية للكشف المبكر والدقيق عن المؤشرات الحيوية في التشخيص السريري، مما يسهل مراقبة المرض وإدارته بشكل أفضل. في اكتشاف الأدوية، تساعد القدرة على تتبع التغيرات الدقيقة في النشاط الأنزيمي في تطوير الأدوية الأكثر فعالية من خلال توفير رؤى مفصلة حول آليات تثبيط الإنزيم.

الأصول والجدل

زعمت تشي آن تشنغ من جامعة تايوان الوطنية (NTU) أن فريقها طور هذه التكنولوجيا المبتكرة. [35] [36] ومع ذلك، فإن هذا الادعاء يتنازع عليه وجود منشورات سابقة لفريق ديفيد آر والت في جامعة هارفارد، الذين نشروا أعمالهم على eSimoa في عام 2020. [37] [38] تشير هذه الوثائق السابقة التي قدمها فريق والت إلى مساهمة سابقة في تطوير التكنولوجيا.

انظر أيضا

الملاحظات والمراجع

  1. ^ Engvall, E (1972-11-22). "اختبار الممتز المناعي المرتبط بالإنزيم، إليزا". مجلة المناعة . 109 (1): 129–135. doi : 10.4049/jimmunol.109.1.129 . ISSN  0022-1767. PMID  4113792.
  2. ^ abc Msagati, TA (2017). Food Forensics and Toxicology. John Wiley & Sons. p. PT229. ISBN 9781119101383.
  3. ^ ab Crowther, JR (1995). "الفصل 2: ​​المبادئ الأساسية لاختبار ELISA". اختبار ELISA: النظرية والتطبيق . طرق في علم الأحياء الجزيئي. المجلد 42. Humana Press. ص 35-62. doi :10.1385/0-89603-279-5:1. ISBN 0896032795. PMID  7655571.
  4. ^ Sonntag, O. (1993). "الفصل 1: مقدمة في الكيمياء الجافة". في van der Vliet, PC (محرر). الكيمياء الجافة: التحليل باستخدام الكواشف المرتبطة بالناقل . تقنيات المختبر في الكيمياء الحيوية وعلم الأحياء الجزيئي. المجلد 25. ص 1-6. ISBN 9780080887364.
  5. ^ Hsieh, Y.-HP; Rao, Q. (2017). Nielsen, SS (ed.). Food Analysis. Springer. ص 491-98. ISBN 9783319457765.
  6. ^ Schasfoort, RBM (2017). Handbook of Surface Plasmon Resonance (الطبعة الثانية). الجمعية الملكية للكيمياء. ص 296. ISBN 9781782627302.
  7. ^ Elgert, KD (2009). علم المناعة: فهم الجهاز المناعي. John Wiley & Sons. ص 149-150. ISBN 9780470081570.
  8. ^ Yalow, Rosalyn S.; Berson, Solomon A. (1960). "التحليل المناعي للأنسولين البلازمي الداخلي لدى الإنسان". مجلة التحقيقات السريرية . 39 (7): 1157–75. doi :10.1172/JCI104130. PMC 441860. PMID  13846364 . 
  9. ^ Lequin, RM (2005). "Enzyme Immunoassay (EIA)/Enzyme-Linked Immunosorbent Assay (ELISA)". الكيمياء السريرية . 51 (12): 2415–8. doi : 10.1373/clinchem.2005.051532 . PMID  16179424.
  10. ^ Wide, Leif; Porath, Jerker (1966). "التحليل المناعي الإشعاعي للبروتينات باستخدام الأجسام المضادة المقترنة بـ Sephadex". Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - General Subjects . 130 (1): 257–60. doi :10.1016/0304-4165(66)90032-8.
  11. ^ Engvall, Eva; Perlmann, Peter (1971). "Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) quantitative assay of immunoglobulin G". Immunochemistry . 8 (9): 871–4. doi :10.1016/0019-2791(71)90454-X. PMID  5135623.
  12. ^ فان ويمن ، بك. شورز، أهوم (1971). “المقايسة المناعية باستخدام المستضد – اقترانات الإنزيم”. رسائل فيبس . 15 (3): 232-236. دوى : 10.1016/0014-5793(71)80319-8 . بميد  11945853. S2CID  37147723.
  13. ^ Leng, SX; McElhaney, JE; Walston, JD; Xie, D.; Fedarko, NS; Kuchel, GA (2008). "ELISA and Multiplex Technologies for Cytokine Measurement in Inflammation and Aging Research". مجلات الشيخوخة السلسلة أ: العلوم البيولوجية والعلوم الطبية . 63 (8): 879–84. doi :10.1093/gerona/63.8.879. PMC 2562869. PMID  18772478 . 
  14. ^ أدلر، مايكل؛ شولتز، سفين؛ سبنجلر، مارك (2009). "تحديد كمية السيتوكين في تطوير الأدوية: مقارنة بين منصات التحليل المناعي الحساسة". Chimera Biotech. مؤرشف من الأصل في 2015-12-22 . تم الاسترجاع في 2015-08-20 .
  15. ^ دي لا ريكا، روبرتو؛ ستيفنز، مولي م. (2012). "اختبار الإليزا البلازموني للكشف عن العلامات الحيوية للأمراض بالعين المجردة باستخدام أجهزة حساسة للغاية". تكنولوجيا النانو الطبيعية . 7 (12): 821-4. رمز Bibcode :2012NatNa...7..821D. doi :10.1038/nnano.2012.186. hdl : 10044/1/21938 . PMID  23103935.
  16. ^ R., Crowther, J. (1995). "Basic Immunology". ELISA : theory and practice . Methods in Molecular Biology. المجلد 42. توتووا، نيوجيرسي: Humana Press. ص 1-218. doi :10.1385/0-89603-279-5:1. ISBN 978-0896032798. OCLC  32130600. PMID  7655571.{{cite book}}:CS1 maint: أسماء متعددة: قائمة المؤلفين ( الرابط )
  17. ^ ROBERT., HNASKO (2016). ELISA (إعادة طباعة الغلاف الورقي للطبعة الأولى). [لم يتم تحديد مكان النشر]: HUMANA. ISBN 978-1493953851. OCLC  960834982.
  18. ^ "ما هو اختبار ELISA؟". R&D Systems . تم الاسترجاع في 31 يناير 2020 .
  19. ^ سبنس، زاكاري (2018-10-18). "الكيمياء الحيوية الطبعة الثامنة - جيريمي م. بيرج": 83. {{cite journal}}: تتطلب المجلة الاستشهاد بها |journal=( مساعدة ) [ رابط معطل دائم ]
  20. ^ Schmidt, SD; Mazzella, MJ; Nixon, RA; Mathews, PM (2012). "قياس بيتا أميلويد بواسطة اختبار الممتز المناعي المرتبط بالإنزيم". بروتينات الأميلويد . طرق في علم الأحياء الجزيئي. المجلد 849. ص 507-27. doi :10.1007/978-1-61779-551-0_34. ISBN 978-1-61779-550-3. PMID  22528112.
  21. ^ Kragstrup, Tue W; Vorup-Jensen, Thomas; Deleuran, Bent; Hvid, Malene (2013). "مجموعة بسيطة من خطوات التحقق تحدد وتزيل النتائج الخاطئة في اختبار الممتز المناعي المرتبط بالإنزيم الساندويتش الناتج عن الأجسام المضادة IgG المضادة للحيوانات في بلازما مرضى التهاب المفاصل". SpringerPlus . 2 (1): 263. doi : 10.1186/2193-1801-2-263 . PMC 3695686. PMID  23875127 . 
  22. ^ US 7767404، Charbonnet، Derrick، "جهاز وطريقة لتحليل الممتز المناعي أحادي الخطوة للمحللات الفردية والمتعددة"، صدر في 3 أغسطس 2010 
  23. ^ US 8735142، Charbonnet، Derrick & Evans، Norman Scott، "أنظمة وطرق لتحليلات الممتز المناعي للمحللات الفردية والمتعددة"، صدرت في 27 مايو 2014 
  24. ^ محمودي جوماري، محمد؛ سرايغورد أفشاري، نيدا؛ فارسيمادان، مرزية؛ رستامي، نيدا؛ أغاميري، شاهين؛ فرج اللهي، محمد م. (ديسمبر 2020). "فرص وتحديات تقنيات تنقية البروتين بمساعدة الوسم: التطبيقات في صناعة الأدوية". التطورات التكنولوجية الحيوية . 45 : 107653. doi :10.1016/j.biotechadv.2020.107653. ISSN  0734-9750. PMID  33157154. S2CID  226276355.
  25. ^ abcd "ركائز الإنزيم لاختبار ELISA". Thermo Fisher Scientific - الولايات المتحدة . تم الاسترجاع في 2018-06-06 .
  26. ^ موسوعة ميدلاين بلس : اختبارات ELISA/Western blot لفيروس نقص المناعة البشرية
  27. ^ "شراكة المواد المسببة للحساسية الغذائية" (بيان صحفي). إدارة الغذاء والدواء. يناير 2001. تم الاسترجاع في 20 أغسطس 2015 .
  28. ^ Sblattero, D.; Berti, I.; Trevisiol, C.; Marzari, R.; Tommasini, A.; Bradbury, A.; Fasano, A.; Ventura, A.; Not, T. (2000). "اختبار الإليزا المناعي المناعي البشري باستخدام إنزيم الترانسجلوتاميناز النسيجي المؤتلف: اختبار تشخيصي مبتكر لمرض الاضطرابات الهضمية". المجلة الأمريكية لأمراض الجهاز الهضمي . 95 (5): 1253–7. doi :10.1111/j.1572-0241.2000.02018.x. PMID  10811336. S2CID  11018740.
  29. ^ بورسيلي، برونيتا؛ فيريتي، فابيو؛ فينديجني، كارلا؛ تيرزولي، لوسيا (2014). "تقييم اختبار لفحص وتشخيص مرض الاضطرابات الهضمية". مجلة التحليل المختبري السريري . 30 (1): 65-70. doi :10.1002/jcla.21816. PMC 6807240. PMID  25385391 . 
  30. ^ ديل ري ، رودريجو بيمنتا. ليوني، ليوناردو مايا؛ سيليدون، باولا أليخاندرا فيوراني؛ زانشين، نيلسون إيفو تونين؛ ريس، ميترماير جالفاو دوس؛ جوميز، يارا دي ميراندا؛ شيجمان، أليخاندرو غابرييل؛ لونجي، سيلفيا أندريا؛ سانتوس، فريد لوتشيانو نيفيس (2019/04/18). “الكشف عن الأجسام المضادة لمرض المثقبيات الكروزية بواسطة المستضدات الخيمرية في الأفراد المصابين بمرض شاغاس المزمن من بلدان أمريكا الجنوبية المستوطنة”. بلوس واحد . 14 (4): e0215623. بيب كود :2019PLoSO..1415623D. دوى : 10.1371/journal.pone.0215623 . ردمك  1932-6203. PMC 6472793 . PMID  30998741. 
  31. ^ Griffin, JFT; Spittle, E.; Rodgers, CR; Liggett, S.; Cooper, M.; Bakker, D.; Bannantine, JP (2005). "Immunoglobulin G1 Enzyme-Linked Immunosorbent Assay for Diagnosis of Johne's Disease in Red Deer (Cervus elaphus)". علم المناعة السريرية واللقاحات . 12 (12): 1401–9. doi :10.1128/CDLI.12.12.1401-1409.2005. PMC 1317074. PMID  16339063 . 
  32. ^ داماد، الإمارات العربية المتحدة؛ عبد الرضا, ماجستير (2020). “كوفيد-19: طرق الكشف الجزيئي والمصلي”. بيرج . 8 : e10180. دوى : 10.7717/peerj.10180 . بمك 7547594 . بميد  33083156. 
  33. ^ الاتجاهات الحالية والناشئة في تقنيات الكشف عن مسببات الأمراض النباتية Frontiers in Plant Science
  34. ^ وانج، شو؛ أوجاتا، آلانا ف؛ والت، ديفيد ر. (2 سبتمبر 2020). "الكشف فائق الحساسية للنشاط الأنزيمي باستخدام مصفوفات الجزيئات الفردية". مجلة الجمعية الكيميائية الأمريكية . 142 (35): 15098-15106. doi :10.1021/jacs.0c06599. PMC 7472518. PMID 32797755  . 
  35. ^ Cheng, CA (28 نوفمبر 2023). "eSimoa – إطار عمل لفك تشفير البروتين عالي الدقة والفائق الحساسية مكانيًا للحويصلات خارج الخلية للورم | Exosome RNA". Exosome RNA .
  36. ^ تشنغ، تشي آن (13 يونيو 2024). "أصوات في الصيدلة الجزيئية: تعرف على البروفيسور تشي آن تشنغ، الذي يبتكر أدوات التشخيص، ويكتشف المؤشرات الحيوية، ويطور اختبارات جديدة، ويخلق مواد جديدة". الصيدلة الجزيئية . doi : 10.1021/acs.molpharmaceut.4c00623 . PMID  38869420.
  37. ^ وانج، شو؛ أوجاتا، آلانا ف؛ والت، ديفيد ر. (2 سبتمبر 2020). "الكشف فائق الحساسية للنشاط الأنزيمي باستخدام مصفوفات الجزيئات الفردية". مجلة الجمعية الكيميائية الأمريكية . 142 (35): 15098-15106. doi :10.1021/jacs.0c06599. PMC 7472518. PMID 32797755  . 
  38. ^ "الكشف عن الجزيئات الحيوية الأخرى – مختبر والت".
  • اختبار ELISA في المكتبة الوطنية الأمريكية للطب - العناوين الطبية (MeSH)
  • "مقدمة عن نشاط ELISA" - عرض تقديمي للمبتدئين حول ELISA المستخدم في الكشف عن فيروس نقص المناعة البشرية، بما في ذلك الرسوم المتحركة في جامعة أريزونا
  • "مبدأ اختبار ELISA" - نظرة عامة على مبدأ اختبار ELISA وأدوات الكشف عن التحليلات في Assay Genie
تم الاسترجاع من "https://en.wikipedia.org/w/index.php?title=ELISA&oldid=1230691928"
Original text
Rate this translation
Your feedback will be used to help improve Google Translate