تفاعل البوليميراز المتسلسل في الوقت الحقيقي

📅 آخر تحديث: ٢٥ يوليو ٢٠٢٦
✍️ نُشر في: ٢٥ يوليو ٢٠٢٦
📷 يحتوي على 8 صور
الموسوعة الحرة
مخطط الفلوريسنت الأخضر SYBR تم إنتاجه في تفاعل البوليميراز المتسلسل في الوقت الحقيقي
منحنى الانصهار الناتج في نهاية تفاعل البوليميراز المتسلسل في الوقت الحقيقي

تفاعل البوليميراز المتسلسل في الوقت الحقيقي ( PCR في الوقت الحقيقي ، أو qPCR عند استخدامه كميًا) هو تقنية معملية في علم الأحياء الجزيئي تعتمد على تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR). يراقب تضخيم جزيء DNA المستهدف أثناء تفاعل البوليميراز المتسلسل (أي في الوقت الحقيقي)، وليس في نهايته، كما هو الحال في تفاعل البوليميراز المتسلسل التقليدي. يمكن استخدام تفاعل البوليميراز المتسلسل في الوقت الحقيقي كميًا وشبه كميًا (أي أعلى/أسفل كمية معينة من جزيئات DNA).

هناك طريقتان شائعتان للكشف عن منتجات تفاعل البوليميراز المتسلسل في تفاعل البوليميراز المتسلسل في الوقت الحقيقي، وهما: (1) الصبغات الفلورية غير المحددة التي تتداخل مع أي حمض نووي مزدوج السلسلة و(2) مجسات الحمض النووي الخاصة بالتسلسل والتي تتكون من نيوكليوتيدات أوليجوموستيدات موسومة بمراسل فلوري ، والذي يسمح بالكشف فقط بعد تهجين المجس مع تسلسله التكميلي.

تقترح إرشادات الحد الأدنى من المعلومات لنشر تجارب تفاعل البوليميراز المتسلسل الكمي في الوقت الحقيقي ( MIQE ) استخدام الاختصار qPCR لتفاعل البوليميراز المتسلسل الكمي في الوقت الحقيقي واستخدام RT-qPCR لتفاعل البوليميراز المتسلسل العكسي-qPCR. [1] يشير الاختصار "RT-PCR" عادةً إلى تفاعل البوليميراز المتسلسل العكسي وليس تفاعل البوليميراز المتسلسل في الوقت الحقيقي، ولكن ليس كل المؤلفين يلتزمون بهذه الاتفاقية. [2]

خلفية

تستخدم تقنية تفاعل البوليميراز المتسلسل في الوقت الحقيقي الفلوروفورات من أجل الكشف عن مستويات التعبير الجيني .

تنظم الخلايا في جميع الكائنات الحية التعبير الجيني عن طريق دوران نُسخ الجينات ( RNA أحادي السلسلة ): يمكن قياس كمية الجين المعبر عنه في الخلية من خلال عدد نسخ نسخة RNA لهذا الجين الموجودة في العينة. من أجل الكشف عن التعبير الجيني وتحديد كميته بشكل قوي من كميات صغيرة من RNA، فإن تضخيم نسخة الجين ضروري. تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR) هو طريقة شائعة لتضخيم الحمض النووي؛ بالنسبة لتفاعل البوليميراز المتسلسل القائم على RNA، يتم نسخ عينة RNA أولاً عكسيًا إلى DNA التكميلي (cDNA) باستخدام النسخ العكسي .

من أجل تضخيم كميات صغيرة من الحمض النووي، يتم استخدام نفس المنهجية كما هو الحال في تفاعل البوليميراز المتسلسل التقليدي باستخدام قالب الحمض النووي، وزوج واحد على الأقل من البادئات المحددة ، وثلاثي فوسفات الديوكسي ريبونوكليوتيد ، ومحلول منظم مناسب وبوليميراز الحمض النووي المستقر حراريًا . تتم إضافة مادة مميزة بالفلوروفور إلى هذا الخليط في جهاز تدوير حراري يحتوي على أجهزة استشعار لقياس فلورسنت الفلوروفور بعد إثارته عند الطول الموجي المطلوب مما يسمح بقياس معدل التوليد لمنتج واحد أو أكثر محدد. يسمح هذا بقياس معدل توليد المنتج المضخم في كل دورة تفاعل بوليميراز متسلسل. يمكن تحليل البيانات الناتجة بهذه الطريقة بواسطة برنامج كمبيوتر لحساب التعبير الجيني النسبي (أو عدد نسخ mRNA ) في عدة عينات. يمكن أيضًا تطبيق تفاعل البوليميراز المتسلسل الكمي على اكتشاف وتحديد كمية الحمض النووي في العينات لتحديد وجود ووفرة تسلسل DNA معين في هذه العينات. [3] يتم إجراء هذا القياس بعد كل دورة تضخيم، ولهذا السبب تسمى هذه الطريقة بـ PCR في الوقت الحقيقي (أي PCR الفوري أو المتزامن).

تعد تقنية تفاعل البوليميراز المتسلسل الكمي ومجموعة الحمض النووي الدقيقة من الطرق الحديثة لدراسة التعبير الجيني . وقد تم استخدام طرق أقدم لقياس وفرة mRNA: العرض التفاضلي ، واختبار حماية RNase ، والبقعة الشمالية . غالبًا ما يتم استخدام البقعة الشمالية لتقدير مستوى التعبير عن الجين من خلال تصور وفرة نسخة mRNA الخاصة به في عينة. في هذه الطريقة، يتم فصل الحمض النووي الريبي المنقى عن طريق الرحلان الكهربائي للهلام الأجار ، ونقله إلى مصفوفة صلبة (مثل غشاء النايلون)، وفحصه باستخدام مسبار DNA أو RNA محدد مكمل للجين المطلوب. على الرغم من أن هذه التقنية لا تزال تستخدم لتقييم التعبير الجيني، إلا أنها تتطلب كميات كبيرة نسبيًا من الحمض النووي الريبي وتوفر فقط معلومات نوعية أو شبه كمية عن مستويات mRNA. [ 4] يمكن أن تكون أخطاء التقدير الناشئة عن الاختلافات في طريقة القياس نتيجة لسلامة الحمض النووي وكفاءة الإنزيم والعديد من العوامل الأخرى. لهذا السبب تم تطوير عدد من أنظمة التقييس (غالبًا ما تسمى طرق التطبيع ). تم تطوير بعضها لقياس التعبير الجيني الإجمالي، ولكن الأكثر شيوعًا يهدف إلى قياس الجين المحدد الذي تتم دراسته فيما يتعلق بجين آخر يسمى الجين المُعايِر، والذي يتم اختياره لمستوى تعبيره الثابت تقريبًا. غالبًا ما يتم اختيار هذه الجينات من الجينات المنزلية لأن وظائفها المتعلقة بالبقاء الخلوي الأساسي تعني عادةً التعبير الجيني التكويني . [5] [6] يتيح هذا للباحثين الإبلاغ عن نسبة للتعبير عن الجينات ذات الاهتمام مقسومة على التعبير عن المُعايِر المُختار، وبالتالي السماح بمقارنة الأولى دون معرفة مستوى تعبيرها المطلق بالفعل.

الجينات الطبيعية الأكثر استخدامًا هي تلك التي تشفر الجزيئات التالية: التوبيولين ، وجليسيرالدهيد-3-فوسفات ديهيدروجينيز ، والألبومين ، والسيكلوفيلين ، و RNA الريبوسومي . [4]

المبادئ الأساسية

يتم إجراء تفاعل البوليميراز المتسلسل في الوقت الحقيقي في جهاز تدوير حراري يتمتع بالقدرة على إضاءة كل عينة بشعاع من الضوء بطول موجي محدد على الأقل واكتشاف الفلورسنت المنبعث من الفلوروفور المثار . كما يتمتع جهاز التدوير الحراري بالقدرة على تسخين العينات وتبريدها بسرعة، وبالتالي الاستفادة من الخصائص الفيزيائية والكيميائية للأحماض النووية وبوليميراز الحمض النووي .

تتكون عملية تفاعل البوليميراز المتسلسل بشكل عام من سلسلة من التغيرات في درجات الحرارة تتكرر من 25 إلى 50 مرة. تتكون هذه الدورات عادةً من ثلاث مراحل: الأولى، عند حوالي 95 درجة مئوية، تسمح بفصل السلسلة المزدوجة للحمض النووي؛ والثانية، عند درجة حرارة حوالي 50 إلى 60 درجة مئوية، تسمح بربط البادئات بقالب الحمض النووي؛ [7] والثالثة، عند درجة حرارة تتراوح بين 68 و72 درجة مئوية، تسهل عملية البلمرة التي يقوم بها بوليميراز الحمض النووي. نظرًا لصغر حجم الشظايا، عادةً ما يتم حذف الخطوة الأخيرة في هذا النوع من تفاعل البوليميراز المتسلسل حيث يكون الإنزيم قادرًا على تكرار أمبليكون الحمض النووي أثناء التغيير بين مرحلة المحاذاة ومرحلة التحلل. بالإضافة إلى ذلك، في تفاعل البوليميراز المتسلسل بأربع خطوات، يتم قياس الفلورسنت أثناء مراحل درجة الحرارة القصيرة التي تستمر لبضع ثوانٍ فقط في كل دورة، بدرجة حرارة، على سبيل المثال، 80 درجة مئوية، من أجل تقليل الإشارة الناتجة عن وجود ثنائيات البادئ عند استخدام صبغة غير محددة. [8] تعتمد درجات الحرارة والتوقيتات المستخدمة لكل دورة على مجموعة واسعة من المعلمات، مثل: الإنزيم المستخدم في تصنيع الحمض النووي، وتركيز الأيونات ثنائية التكافؤ وثلاثي فوسفات الديوكسي ريبونوكليوتيد (dNTPs) في التفاعل ودرجة حرارة ارتباط البادئات. [9]

التصنيف الكيميائي

يمكن تصنيف تقنية تفاعل البوليميراز المتسلسل في الوقت الحقيقي حسب الكيمياء المستخدمة للكشف عن منتج تفاعل البوليميراز المتسلسل، أو الفلوروكرومات المحددة أو غير المحددة.

الكشف غير النوعي: تفاعل البوليميراز المتسلسل في الوقت الحقيقي باستخدام صبغات ربط الحمض النووي ذات السلسلتين كمراسلين

ترتبط الصبغة الرابطة للحمض النووي بجميع الحمض النووي ثنائي السلسلة (ds) في تفاعل البوليميراز المتسلسل، مما يزيد من العائد الكمي للفلورسنت للصبغة. وبالتالي فإن الزيادة في ناتج الحمض النووي أثناء تفاعل البوليميراز المتسلسل تؤدي إلى زيادة في شدة الفلورسنت المقاسة في كل دورة. ومع ذلك، فإن صبغات dsDNA مثل SYBR Green سترتبط بجميع منتجات تفاعل البوليميراز المتسلسل لـ dsDNA، بما في ذلك منتجات تفاعل البوليميراز المتسلسل غير المحددة (مثل ثنائي البادئ ). يمكن أن يتداخل هذا مع أو يمنع المراقبة الدقيقة لتسلسل الهدف المقصود.

في تفاعل البوليميراز المتسلسل في الوقت الحقيقي باستخدام صبغات dsDNA، يتم تحضير التفاعل كالمعتاد، مع إضافة صبغة dsDNA الفلورية. ثم يتم تشغيل التفاعل في جهاز تفاعل البوليميراز المتسلسل في الوقت الحقيقي ، وبعد كل دورة، يتم قياس شدة الفلورسنت باستخدام جهاز الكشف؛ تتألق الصبغة فقط عند ارتباطها بـ dsDNA (أي منتج تفاعل البوليميراز المتسلسل). تتميز هذه الطريقة بأنها تحتاج فقط إلى زوج من البادئات لإجراء التضخيم، مما يقلل التكاليف؛ يمكن مراقبة تسلسلات مستهدفة متعددة في أنبوب باستخدام أنواع مختلفة من الصبغات.

الكشف المحدد: طريقة مسبار المراسل الفلوري

(1) في المجسات السليمة، يتم إخماد فلورسنت المراسل. (2) يتم تهجين المجسات وشريط الحمض النووي التكميلي ولا يزال فلورسنت المراسل مطفأ. (3) أثناء تفاعل البوليميراز المتسلسل، يتم تحلل المجس بواسطة بوليميراز Taq ويتم إطلاق المراسل الفلوري.

تكتشف مجسات المراسل الفلورية فقط الحمض النووي الذي يحتوي على التسلسل المكمل للمسبار؛ وبالتالي، فإن استخدام مسبار المراسل يزيد بشكل كبير من الخصوصية، ويمكّن من إجراء التقنية حتى في وجود dsDNA آخر. باستخدام علامات بألوان مختلفة، يمكن استخدام المجسات الفلورية في اختبارات متعددة لمراقبة العديد من تسلسلات الهدف في نفس الأنبوب. تمنع خصوصية مجسات المراسل الفلورية أيضًا تداخل القياسات الناتجة عن ثنائيات البادئ ، وهي منتجات ثانوية محتملة غير مرغوب فيها في تفاعل البوليميراز المتسلسل. ومع ذلك، لا تمنع مجسات المراسل الفلورية التأثير المثبط لثنائيات البادئ، مما قد يؤدي إلى تثبيط تراكم المنتجات المرغوبة في التفاعل.

تعتمد الطريقة على مسبار قائم على الحمض النووي مع مراسل فلوري في أحد طرفيه ومطفئ للفلورسنت في الطرف المقابل للمسبار. إن القرب الشديد للمراسل من المطفأ يمنع اكتشاف فلورسنته؛ يؤدي تفكك المسبار بسبب نشاط إكسونوكلياز 5' إلى 3' لبوليميراز Taq إلى كسر التقارب بين المراسل والمطفأ وبالتالي يسمح بانبعاث فلوري غير مطفأ، والذي يمكن اكتشافه بعد الإثارة بالليزر. وبالتالي فإن الزيادة في المنتج المستهدف بواسطة مسبار المراسل في كل دورة تفاعل بوليميراز متسلسل تسبب زيادة متناسبة في الفلورسنت بسبب تفكك المسبار وإطلاق المراسل.

  1. يتم تحضير تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR) كالمعتاد (انظر تفاعل البوليميراز المتسلسل )، ويتم إضافة مسبار المراسل.
  2. عندما يبدأ التفاعل، أثناء مرحلة التلدين في تفاعل البوليميراز المتسلسل، يتصل كل من المسبار والبادئات بهدف الحمض النووي.
  3. يتم البدء في بلمرة خيط DNA جديد من البادئات، وبمجرد وصول البوليميراز إلى المسبار، يقوم إكسونوكلياز 5'-3' الخاص به بتحلل المسبار، مما يؤدي إلى فصل المراسل الفلوري عن المُطفأ جسديًا، مما يؤدي إلى زيادة في الفلورة.
  4. يتم الكشف عن الفلورسنت وقياسه في جهاز تفاعل البوليميراز المتسلسل في الوقت الحقيقي، ويتم استخدام الزيادة الهندسية المقابلة للزيادة الأسيّة للمنتج لتحديد دورة القياس (C q ) في كل تفاعل.

تحليل درجة حرارة الاندماج

منحنيات اندماج مميزة لعدد من منتجات تفاعل البوليميراز المتسلسل (تظهر ألوانًا مميزة). يمكن رؤية تفاعلات التضخيم لمنتج معين (وردي، أزرق) ومنتج آخر بنتيجة سلبية (أخضر، برتقالي). يُظهر ذروة الاندماج المشار إليها بسهم الذروة الناتجة عن ثنائيات البادئ، والتي تختلف عن منتج التضخيم المتوقع. [10]

يسمح تفاعل البوليميراز المتسلسل في الوقت الحقيقي بتحديد شظايا الحمض النووي المحددة والمضخمة باستخدام تحليل درجة انصهارها (وتسمى أيضًا قيمة T m ، من درجة حرارة الانصهار ). الطريقة المستخدمة عادةً هي تفاعل البوليميراز المتسلسل مع صبغات ربط الحمض النووي ذات السلسلة المزدوجة كمراسلين والصبغة المستخدمة عادةً هي SYBR Green. درجة انصهار الحمض النووي خاصة بالشظية المضخمة. يتم الحصول على نتائج هذه التقنية من خلال مقارنة منحنيات تفكك عينات الحمض النووي التي تم تحليلها. [11]

على عكس تقنية تفاعل البوليميراز المتسلسل التقليدية، تتجنب هذه الطريقة الاستخدام السابق لتقنيات الرحلان الكهربائي لإظهار نتائج جميع العينات. وذلك لأنه على الرغم من كونها تقنية حركية، فإن تقنية تفاعل البوليميراز المتسلسل الكمي يتم تقييمها عادةً عند نقطة نهاية مميزة. وبالتالي، توفر هذه التقنية عادةً نتائج أسرع و/أو تستخدم عددًا أقل من المتفاعلات مقارنة بتقنية الرحلان الكهربائي. وإذا كانت هناك حاجة إلى الرحلان الكهربائي اللاحق، فمن الضروري فقط اختبار العينات التي أظهر تفاعل البوليميراز المتسلسل في الوقت الفعلي أنها مشكوك فيها و/أو التصديق على النتائج للعينات التي أثبتت إيجابية اختبارها لمحدد معين.

النمذجة

على عكس تفاعل البوليميراز المتسلسل في نقطة النهاية (تفاعل البوليميراز المتسلسل التقليدي)، يسمح تفاعل البوليميراز المتسلسل في الوقت الفعلي بمراقبة المنتج المطلوب في أي نقطة في عملية التضخيم عن طريق قياس الفلوريسنت (في الإطار الزمني الفعلي، يتم قياس مستواه على عتبة معينة). تعتمد إحدى الطرق المستخدمة بشكل شائع لقياس كمية الحمض النووي عن طريق تفاعل البوليميراز المتسلسل في الوقت الفعلي على رسم الفلوريسنت مقابل عدد الدورات على مقياس لوغاريتمي . يتم ضبط عتبة الكشف عن الفلوريسنت القائم على الحمض النووي على 3-5 أضعاف الانحراف المعياري لضوضاء الإشارة فوق الخلفية. يُطلق على عدد الدورات التي يتجاوز فيها الفلوريسنت العتبة دورة العتبة (C t ) أو، وفقًا لإرشادات MIQE، دورة القياس (C q ) . [1]

خلال مرحلة التضخيم الأسي، تتضاعف كمية قالب الحمض النووي المستهدف (أمبليكون) في كل دورة. على سبيل المثال، تحتوي عينة الحمض النووي التي تسبق قيمة Cq الخاصة بعينة أخرى بثلاث دورات على 2 3 = 8 أضعاف القالب. ومع ذلك، غالبًا ما تكون كفاءة التضخيم متغيرة بين البادئات والقوالب. لذلك، يتم تقييم كفاءة تركيبة البادئ والقالب في تجربة معايرة مع تخفيفات متسلسلة لقالب الحمض النووي لإنشاء منحنى قياسي للتغير في (Cq ) مع كل تخفيف. ثم يتم استخدام منحدر الانحدار الخطي لتحديد كفاءة التضخيم، والتي تبلغ 100٪ إذا أدى تخفيف 1: 2 إلى فرق (Cq ) بمقدار 1. تضع طريقة عتبة الدورة عدة افتراضات لآلية التفاعل وتعتمد على البيانات من مناطق الإشارة إلى الضوضاء المنخفضة لملف تعريف التضخيم والتي يمكن أن تسبب تباينًا كبيرًا أثناء تحليل البيانات. [12]

لتحديد كمية التعبير الجيني، يتم طرح (C q ) لـ RNA أو DNA من الجين المطلوب من (C q ) لـ RNA/DNA من جين التدبير المنزلي في نفس العينة لتطبيع التباين في كمية ونوعية RNA بين العينات المختلفة. يُطلق على إجراء التطبيع هذا عادةً طريقة ΔC t [13] ويسمح بمقارنة التعبير عن جين مطلوب بين عينات مختلفة. ومع ذلك، لمثل هذه المقارنة، يجب أن يكون التعبير عن الجين المرجعي المُعايِر متشابهًا جدًا عبر جميع العينات. لذلك فإن اختيار جين مرجعي يستوفي هذا المعيار له أهمية كبيرة، وغالبًا ما يكون صعبًا، لأن عددًا قليلاً جدًا من الجينات تُظهر مستويات متساوية من التعبير عبر مجموعة من الظروف أو الأنسجة المختلفة. [14] [15] على الرغم من دمج تحليل عتبة الدورة مع العديد من أنظمة البرامج التجارية، إلا أن هناك طرقًا أكثر دقة وموثوقية لتحليل بيانات ملف تعريف التضخيم والتي يجب مراعاتها في الحالات التي تكون فيها إمكانية الاستنساخ محل قلق. [12]

وقد تم اقتراح طرق تحديد الكميات القائمة على الآلية qPCR، والتي تتميز بعدم الحاجة إلى منحنى قياسي لتحديد الكميات. وقد ثبت أن طرقًا مثل MAK2 [16] تتمتع بأداء كمي مساوٍ أو أفضل من طرق المنحنى القياسي. تستخدم هذه الطرق القائمة على الآلية المعرفة حول عملية تضخيم البوليميراز لتوليد تقديرات لتركيز العينة الأصلية. يتضمن امتداد هذا النهج نموذجًا دقيقًا لملف تعريف تفاعل البوليميراز المتسلسل بالكامل، مما يسمح باستخدام بيانات عالية الإشارة إلى الضوضاء والقدرة على التحقق من جودة البيانات قبل التحليل. [12]

وفقًا لبحث Ruijter et al. [17]، يفترض MAK2 كفاءة تضخيم ثابتة أثناء تفاعل البوليميراز المتسلسل. ومع ذلك، كشف التحليل النظري لتفاعل البوليميراز المتسلسل، الذي اشتق منه MAK2، أن كفاءة التضخيم ليست ثابتة طوال تفاعل البوليميراز المتسلسل. في حين يوفر تحديد كمية MAK2 تقديرات موثوقة لتركيز الحمض النووي المستهدف في عينة في ظل ظروف qPCR العادية، فإن MAK2 لا يحدد تركيز الهدف بشكل موثوق لتجارب qPCR باستخدام أجهزة قياس تنافسية.

التطبيقات

هناك العديد من التطبيقات لتفاعل البوليميراز المتسلسل الكمي في المختبرات . ويستخدم عادة في التشخيص والأبحاث الأساسية . وتشمل استخدامات هذه التقنية في الصناعة تحديد كمية الحمولة الميكروبية في الأطعمة أو على المواد النباتية، والكشف عن الكائنات المعدلة وراثيًا وتحديد كمية مسببات الأمراض الفيروسية البشرية وتحديد النمط الجيني لها.

قياس كمية التعبير الجيني

إن تحديد كمية التعبير الجيني باستخدام طرق الكشف التقليدية عن الحمض النووي غير موثوق به. إن الكشف عن mRNA على لطخة نورثرن أو منتجات تفاعل البوليميراز المتسلسل على هلام أو لطخة ساوثرن لا يسمح بالتحديد الدقيق. [18] على سبيل المثال، على مدار 20 إلى 40 دورة من تفاعل البوليميراز المتسلسل النموذجي، تصل كمية منتج الحمض النووي إلى هضبة لا ترتبط بشكل مباشر بكمية الحمض النووي المستهدف في تفاعل البوليميراز المتسلسل الأولي. [19]

يمكن استخدام تفاعل البوليميراز المتسلسل في الوقت الحقيقي لقياس الأحماض النووية بطريقتين شائعتين: القياس النسبي والقياس المطلق. [20] يعطي القياس المطلق العدد الدقيق لجزيئات الحمض النووي المستهدفة بالمقارنة مع معايير الحمض النووي باستخدام منحنى المعايرة . لذلك من الضروري أن يكون لتفاعل البوليميراز المتسلسل للعينة والمعيار نفس كفاءة التضخيم . [21] يعتمد القياس النسبي على الجينات المرجعية الداخلية لتحديد الاختلافات في التعبير عن الجين المستهدف. يتم التعبير عن القياس على أنه التغيير في مستويات التعبير عن mRNA المفسر على أنه DNA مكمل (cDNA، يتم إنشاؤه عن طريق النسخ العكسي لـ mRNA). يكون القياس النسبي أسهل في التنفيذ لأنه لا يتطلب منحنى معايرة حيث تتم مقارنة كمية الجين المدروس بكمية جين مرجعي تحكم.

نظرًا لأن الوحدات المستخدمة للتعبير عن نتائج التقدير النسبي ليست مهمة، فيمكن مقارنة النتائج عبر عدد من RTqPCR المختلفة. والسبب في استخدام جين واحد أو أكثر من الجينات المنزلية هو تصحيح التباين غير المحدد، مثل الاختلافات في كمية ونوعية الحمض النووي الريبي المستخدم، والذي يمكن أن يؤثر على كفاءة النسخ العكسي وبالتالي على عملية PCR بأكملها. ومع ذلك، فإن الجانب الأكثر أهمية في العملية هو أن الجين المرجعي يجب أن يكون مستقرًا. [22]

تم إجراء اختيار هذه الجينات المرجعية تقليديًا في علم الأحياء الجزيئي باستخدام دراسات نوعية أو شبه كمية مثل الفحص البصري لهلام الحمض النووي الريبي أو قياس كثافة البقعة الشمالية أو تفاعل البوليميراز المتسلسل شبه الكمي (محاكاة تفاعل البوليميراز المتسلسل). الآن، في عصر الجينوم ، من الممكن إجراء تقدير أكثر تفصيلاً للعديد من الكائنات الحية باستخدام تقنيات النسخ . [23] ومع ذلك، فقد أظهرت الأبحاث أن تضخيم غالبية الجينات المرجعية المستخدمة في تحديد كمية التعبير عن mRNA يختلف وفقًا للظروف التجريبية. [24] [25] [26] لذلك من الضروري إجراء دراسة منهجية أولية سليمة إحصائيًا من أجل اختيار الجين المرجعي الأكثر ملاءمة.

تم تطوير عدد من الخوارزميات الإحصائية التي يمكنها اكتشاف الجين أو الجينات الأكثر ملاءمة للاستخدام في ظل ظروف معينة. يمكن لخوارزميات مثل geNORM أو BestKeeper مقارنة الأزواج أو المتوسطات الهندسية لمصفوفة من الجينات والأنسجة المرجعية المختلفة . [ 4] [6]

الاستخدامات التشخيصية

يتم تطبيق تفاعل البوليميراز المتسلسل النوعي التشخيصي للكشف السريع عن الأحماض النووية التي تُستخدم لتشخيص الأمراض المعدية ، على سبيل المثال ، [27] [28] والسرطان والتشوهات الجينية. أدى إدخال اختبارات تفاعل البوليميراز المتسلسل النوعي إلى مختبر علم الأحياء الدقيقة السريرية إلى تحسين تشخيص الأمراض المعدية بشكل كبير، [29] ويتم نشره كأداة للكشف عن الأمراض الناشئة حديثًا، مثل سلالات جديدة من الإنفلونزا وفيروس كورونا ، [30] في الاختبارات التشخيصية . [31] [32]

الاستخدامات الميكروبيولوجية

يستخدم علماء الأحياء الدقيقة أيضًا تقنية تفاعل البوليميراز المتسلسل الكمي في مجالات سلامة الأغذية وتلف الأغذية والتخمير وتقييم المخاطر الميكروبية لجودة المياه (مياه الشرب والترفيه) وحماية الصحة العامة. [33]

يمكن أيضًا استخدام qPCR لتضخيم العلامات التصنيفية أو الوظيفية للجينات في الحمض النووي المأخوذ من عينات بيئية. [34] يتم تمثيل العلامات بواسطة شظايا جينية من الحمض النووي أو الحمض النووي التكميلي. [34] من خلال تضخيم عنصر وراثي معين، يمكن للمرء تحديد كمية العنصر في العينة قبل التضخيم. [34] يمكن أن يساعد استخدام العلامات التصنيفية (الجينات الريبوسومية) وqPCR في تحديد كمية الكائنات الحية الدقيقة في العينة، ويمكنه تحديد العائلات أو الأجناس أو الأنواع المختلفة بناءً على خصوصية العلامة. [34] يمكن أن يُظهر استخدام العلامات الوظيفية (الجينات المشفرة للبروتين) التعبير الجيني داخل المجتمع، مما قد يكشف عن معلومات حول البيئة. [34]

الكشف عن مسببات الأمراض النباتية

تسعى الصناعة الزراعية باستمرار إلى إنتاج نباتات أو شتلات خالية من مسببات الأمراض من أجل منع الخسائر الاقتصادية وحماية الصحة. تم تطوير أنظمة تسمح باكتشاف كميات صغيرة من الحمض النووي لفطريات Phytophthora ramorum ، وهي فطريات بيضية تقتل أشجار البلوط وأنواع أخرى، مختلطة بالحمض النووي للنبات المضيف. يعتمد التمييز بين الحمض النووي للممرض والنبات على تضخيم تسلسلات ITS، وهي فواصل تقع في منطقة ترميز جين الحمض النووي الريبي الريبوسومي ، والتي تميز كل تصنيف. [35] كما تم تطوير إصدارات ميدانية من هذه التقنية لتحديد نفس الممرض. [36]

الكشف عن الكائنات المعدلة وراثيا

يمكن استخدام qPCR باستخدام النسخ العكسي (RT-qPCR) للكشف عن الكائنات المعدلة وراثيًا نظرًا لحساسيته ونطاقه الديناميكي في اكتشاف الحمض النووي. عادة ما تكون البدائل مثل تحليل الحمض النووي أو البروتين أقل حساسية. يتم استخدام بادئات محددة تعمل على تضخيم ليس الجين المنقول ولكن المحفز أو المنهي أو حتى التسلسلات الوسيطة المستخدمة أثناء عملية هندسة الناقل. نظرًا لأن عملية إنشاء نبات معدل وراثيًا تؤدي عادةً إلى إدخال أكثر من نسخة من الجين المنقول، يتم أيضًا تقييم كميته بشكل شائع. غالبًا ما يتم ذلك من خلال التقدير النسبي باستخدام جين تحكم من الأنواع المعالجة والذي يوجد فقط كنسخة واحدة. [37] [38]

القياس السريري والتصنيف الجيني

يمكن أن توجد الفيروسات في البشر بسبب العدوى المباشرة أو العدوى المصاحبة مما يجعل التشخيص صعبًا باستخدام التقنيات الكلاسيكية ويمكن أن يؤدي إلى تشخيص وعلاج غير صحيحين. يسمح استخدام qPCR بكل من تحديد الكمية والنمط الجيني (توصيف السلالة، باستخدام منحنيات الذوبان) لفيروس مثل فيروس التهاب الكبد B. [39] درجة العدوى، التي يتم تحديدها على أنها نسخ الجينوم الفيروسي لكل وحدة من أنسجة المريض، ذات صلة في كثير من الحالات؛ على سبيل المثال، فإن احتمالية إعادة تنشيط فيروس الهربس البسيط من النوع 1 مرتبطة بعدد الخلايا العصبية المصابة في العقد . [40] يتم إجراء هذا التحديد إما بالنسخ العكسي أو بدونه، كما يحدث إذا أصبح الفيروس متكاملاً في الجينوم البشري في أي نقطة في دورته، كما يحدث في حالة فيروس الورم الحليمي البشري، حيث ترتبط بعض متغيراته بظهور سرطان عنق الرحم . [41] كما أدى تفاعل البوليميراز المتسلسل في الوقت الحقيقي إلى تحديد كمية الفيروس المضخم للخلايا البشرية (CMV) والذي يُرى في المرضى الذين يعانون من ضعف المناعة بعد زراعة الأعضاء الصلبة أو نخاع العظم. [42]

مراجع

  1. ^ ab Bustin SA, Benes V, Garson JA, Hellemans J, Huggett J, Kubista M, Mueller R, Nolan T, Pfaffl MW, Shipley GL, Vandesompele J, Wittwer CT (2009). "إرشادات MIQE: الحد الأدنى من المعلومات لنشر تجارب تفاعل البوليميراز المتسلسل الكمي في الوقت الفعلي". الكيمياء السريرية . 55 (4): 611-622. doi : 10.1373/clinchem.2008.112797 . PMID  19246619.
  2. ^ لوجان، جولي؛ إدواردز، كريستين وسوندرز، نيك، محرران (2009). تفاعل البوليميراز المتسلسل في الوقت الحقيقي: التكنولوجيا والتطبيقات الحالية . دار كايستر للنشر الأكاديمي. رقم ISBN 978-1-904455-39-4.
  3. ^ Watson, JD; Baker, TA; Bell, SP; Gann, A; Levine, M; Losick, R (2004). Molecular Biology of the Gene (الطبعة الخامسة). سان فرانسيسكو: Benjamin Cummings. ISBN 978-0-321-22368-5.
  4. ^ abc Pfaffl, MW; Tichopad, A; Prgomet, C; Neuvians, TP (مارس 2004). "تحديد الجينات المنزلية المستقرة والجينات المستهدفة المنظمة بشكل تفاضلي وسلامة العينة: أداة BestKeeper--Excel القائمة على استخدام الارتباطات الزوجية". رسائل التكنولوجيا الحيوية . 26 (6): 509–15. doi :10.1023/b:bile.0000019559.84305.47. PMID  15127793. S2CID  977404.
  5. ^ Pfaffl, MW; Horgan, GW; Dempfle, L (2002). "أداة برمجية للتعبير النسبي (REST©) للمقارنة بين المجموعات والتحليل الإحصائي لنتائج التعبير النسبي في تفاعل البوليميراز المتسلسل في الوقت الفعلي". Nucleic Acids Res . 30 (9): e36. doi :10.1093/nar/30.9.e36. PMC 113859. PMID  11972351 . 
  6. ^ ab Vandesompele, J; De Preter, K; Pattyn, F; Poppe, B; Van Roy, N; De Paepe, A; Speleman, F (2002). "التطبيع الدقيق لبيانات تفاعل البوليميراز المتسلسل الكمي في الوقت الفعلي من خلال المتوسط ​​الهندسي لجينات التحكم الداخلية المتعددة". علم الأحياء الجينومي . 3 (7): 1-12. doi : 10.1186/gb-2002-3-7-research0034 . PMC 126239. PMID  12184808 . 
  7. ^ Rychlik W, Spencer WJ, Rhoads RE (1990). "تحسين درجة حرارة التلدين لتضخيم الحمض النووي في المختبر". Nucleic Acids Res . 18 (21): 6409–6412. doi :10.1093/nar/18.21.6409. PMC 332522. PMID  2243783 . 
  8. ^ Pfaffl, Michael (2000). "تطوير وإثبات فعالية تفاعل البوليميراز المتسلسل العكسي الكمي القياسي خارجيًا لعامل النمو الشبيه بالأنسولين-1 باستخدام تقنية LightCycler SYBR Green I" (PDF) . Biochemica (3) – عبر gene-quantification.org.
  9. ^ سامبروك، جوزيف؛ راسل، ديفيد دبليو. (2001). الاستنساخ الجزيئي: دليل مختبري (الطبعة الثالثة). كولد سبرينج هاربور، نيويورك: مطبعة مختبر كولد سبرينج هاربور. رقم ISBN 978-0-87969-576-7.
  10. ^ Ponchel F؛ Toomes C؛ Bransfield K؛ Leong FT؛ Douglas SH؛ Field SL؛ Bell SM؛ Combaret V؛ Puisieux A؛ Mighell AJ (2003). "تفاعل البوليميراز المتسلسل في الوقت الحقيقي القائم على فلورسنت SYBR-Green I: بديل لتحليل TaqMan للقياس الكمي النسبي لإعادة ترتيب الجينات وتضخيم الجينات وحذف الجينات الدقيقة". BMC Biotechnol . 3 : 18. doi : 10.1186/1472-6750-3-18 . PMC 270040. PMID  14552656 . 
  11. ^ Ririe KM؛ Rasmussen RP؛ Wittwer CT (1997). "التمايز بين المنتجات عن طريق تحليل منحنيات ذوبان الحمض النووي أثناء تفاعل البوليميراز المتسلسل" (PDF) . الكيمياء الحيوية التحليلية . 245 (2): 154-160. doi :10.1006/abio.1996.9916. PMID  9056205.
  12. ^ abc Carr, AC; Moore, SD (2012). Lucia, Alejandro (ed.). "Robust Quantification of Polymerase Chain Reactions Using Global Fitting". PLOS ONE . ​​7 (5): e37640. Bibcode :2012PLoSO...737640C. doi : 10.1371/journal.pone.0037640 . PMC 3365123 . PMID  22701526. 
  13. ^ Schefe JH, Lehmann KE, Buschmann IR, Unger T, Funke-Kaiser H (2006). "تحليل بيانات تفاعل البوليميراز المتسلسل الكمي في الوقت الحقيقي: المفاهيم الحالية وصيغة "اختلاف التعبير الجيني في التصوير المقطعي المحوسب" الجديدة". J Mol Med . 84 (11): 901–910. doi :10.1007/s00109-006-0097-6. ​​PMID  16972087. S2CID  10427299.
  14. ^ Nailis H, Coenye T, Van Nieuwerburgh F, Deforce D, Nelis HJ (2006). "تطوير وتقييم استراتيجيات التطبيع المختلفة لدراسات التعبير الجيني في الأغشية الحيوية لفطريات المبيضات البيضاء بواسطة تفاعل البوليميراز المتسلسل في الوقت الحقيقي". BMC Mol. Biol . 7 (1): 25. doi : 10.1186/1471-2199-7-25 . PMC 1557526. PMID  16889665 . 
  15. ^ Nolan T, Hands RE, Bustin SA (2006). "Quantification of mRNA using real-time RT-PCR". Nat. Protoc . 1 (3): 1559–1582. doi :10.1038/nprot.2006.236. PMID  17406449. S2CID  10108148.
  16. ^ Boggy G, Woolf PJ (2010). Ravasi T (محرر). "نموذج ميكانيكي لتفاعل البوليميراز المتسلسل من أجل تحديد كمية البيانات الكمية لتفاعل البوليميراز المتسلسل". PLOS ONE . 5 (8): e12355. Bibcode : 2010PLoSO ...512355B. doi : 10.1371/journal.pone.0012355 . PMC 2930010. PMID  20814578. 
  17. ^ Ruijter JM, Pfaffl MW, Zhao S, Spiess AN, Boggy G, Blom J, Rutledge RG, Sisti D, Lievens A, De Preter K, Derveaux S, Hellemans J, Vandesompele J (2012). "تقييم طرق تحليل منحنى qPCR لاكتشاف المؤشرات الحيوية بشكل موثوق: التحيز والدقة والآثار المترتبة على ذلك". طرق . 59 (1): 32–46. doi :10.1016/j.ymeth.2012.08.011. PMID  22975077.
  18. ^ بروس جيليرتر. "PEMF لعلاج اضطرابات القرنية". lemuriatechnologies.com . مؤرشف من الأصل في 2014-06-09.
  19. ^ Overbergh, L.; Giulietti, A.; Valckx, D.; Decklonne, R.; Bouillon, R.; Mathieu, C. (2003). "استخدام تفاعل البوليميراز المتسلسل العكسي في الوقت الحقيقي لتحديد كمية التعبير عن جين السيتوكين". مجلة التقنيات الجزيئية الحيوية . 14 (1): 33–43. PMC 2279895. PMID  12901609 . 
  20. ^ S. Dhanasekaran; T. Mark Doherty; John Kenneth; TB Trials Study Group (March 2010). "مقارنة المعايير المختلفة للقياس الكمي المطلق القائم على تفاعل البوليميراز المتسلسل في الوقت الفعلي". مجلة الأساليب المناعية . 354 (1-2): 34-39. doi :10.1016/j.jim.2010.01.004. PMID  20109462.
  21. ^ بار، تساتشي؛ كوبيستا، ميكائيل؛ تيشوباد، أليس (2011-10-19). "التحقق من صحة تشابه الحركية في تفاعل البوليميراز المتسلسل الكمي". أبحاث الأحماض النووية . 40 (4): 1395-1406. doi :10.1093/nar/gkr778. ISSN  0305-1048. PMC 3287174. PMID 22013160  . 
  22. ^ برونر، أيه إم؛ ياكوفليف، آي أي؛ شتراوس، إس إتش (2004). "التحقق من صحة الضوابط الداخلية للدراسات الكمية للتعبير الجيني للنباتات". مجلة بي إم سي للبيولوجيا النباتية . 4 : 14. doi : 10.1186/1471-2229-4-14 . PMC 515301. PMID  15317655 . 
  23. ^ McGettigan, Paul A (2013). "Transcriptomics in the RNA-seq era". Current Opinion in Chemical Biology . 17 (1): 4–11. doi :10.1016/j.cbpa.2012.12.008. PMID  23290152.
  24. ^ ثيلين، أوه؛ زورزي، دبليو؛ لاكاي، ب؛ دي بورمان، ب؛ كومانز، ب؛ هيني، ج؛ جريسار، تي؛ إيغوت، أ؛ هاينن، إي (1999). “جينات التدبير المنزلي كمعايير داخلية: الاستخدام والحدود”. ي بيوتكنول . 75 (2-3): 197-200. دوى :10.1016/s0168-1656(99)00163-7. اتش دي ال : 2268/3661 . بميد  10617337.
  25. ^ Radonic, A; Thulke, S; Mackay, IM; Landt, O; Siegert, W; Nitsche, A (2004). "إرشادات لاختيار الجينات المرجعية لتقنية تفاعل البوليميراز المتسلسل الكمي في الوقت الحقيقي". Biochem Biophys Res Commun . 313 (4): 856–862. doi :10.1016/j.bbrc.2003.11.177. PMID  14706621. مؤرشف من الأصل في 2013-08-02.
  26. ^ Dheda, K; Huggett, JF; Bustin, SA; Johnson, MA; Rook, G; Zumla, A (2004). "التحقق من صحة الجينات المنزلية لتطبيع تعبير الحمض النووي الريبي في تفاعل البوليميراز المتسلسل في الوقت الحقيقي". BioTechniques . 37 (1): 112–119. doi : 10.2144/04371RR03 . PMID  15283208.
  27. ^ جاويرث، نيكول (27 مارس 2020). "كيف يتم اكتشاف فيروس كوفيد-19 باستخدام تفاعل البوليميراز المتسلسل العكسي في الوقت الفعلي؟". الوكالة الدولية للطاقة الذرية . تم الاسترجاع في 16 فبراير 2023 .
  28. ^ Xiu, Leshan; Binder, Raquel A.; Alarja, Natalie A.; Kochek, Kara; Coleman, Kristen K.; Than, Son T.; Bailey, Emily S.; Bui, Vuong N.; Toh, Teck-Hock; Erdman, Dean D.; Gray, Gregory C. (يوليو 2020). "اختبار تفاعل البوليميراز المتسلسل العكسي للكشف عن فيروسات كورونا من أربعة أجناس". مجلة علم الفيروسات السريرية . 128 : 104391. doi :10.1016/j.jcv.2020.104391. PMC 7192118. PMID  32403008 . 
  29. ^ Espy, MJ (يناير 2006). "تفاعل البوليميراز المتسلسل في الوقت الحقيقي في علم الأحياء الدقيقة السريرية: تطبيقات للاختبارات المعملية الروتينية". مراجعات علم الأحياء الدقيقة السريرية . 19 (3): 165-256. doi :10.1128/CMR.19.1.165-256.2006. PMC 1360278. PMID  16418529 . 
  30. ^ Dhamad, AE; Abdal Rhida, MA (2020). "COVID-19: molecular and serological detection methods". PeerJ . 8 : e10180. doi : 10.7717/peerj.10180 . PMC 7547594 . PMID  33083156. 
  31. ^ "اختبارات تفاعل البوليميراز المتسلسل العكسي المعتمدة من إدارة الغذاء والدواء الأمريكية واختبارات جزيئية أخرى لفيروسات الأنفلونزا" (PDF) . cdc.gov .
  32. ^ "rRT-PCR، طريقة لتأكيد حالة فيروس كورونا في ووهان – الذكاء الاصطناعي للكيمياء". 24 يناير 2020. تم الاسترجاع في 2020-01-26 .
  33. ^ Filion, M, ed. (2012). Quantitative Real-time PCR in Applied Microbiology . Caister Academic Press . ISBN 978-1-908230-01-0.
  34. ^ abcde Bouchez, Blieux, Dequiedt, Domaizon, Dufresne, Ferreira, Godon, Hellal, Joulian, Quaiser, Martin-Laurent, Mauffret, Monier, Peyret, Schmitt-Koplin, Sibourg, D'oiron, Bispo, Deportes, Grand, Cuny, Maron, Ranjard (سبتمبر 2016). "طرق علم الأحياء الدقيقة الجزيئية للتشخيص البيئي". رسائل الكيمياء البيئية . 14 (4): 423-441. doi :10.1007/s10311-016-0581-3. S2CID  88827291. تم الاسترجاع في 11 مايو 2020 .{{cite journal}}:CS1 maint: أسماء متعددة: قائمة المؤلفين ( الرابط )
  35. ^ Baldwin, BG (1992). "الفائدة التطورية للفواصل الداخلية المنقولة للحمض النووي الريبوسومي النووي في النباتات: مثال من علم التركيب". علم الوراثة الجزيئي والتطور . 1 (1): 3-16. doi :10.1016/1055-7903(92)90030-K. PMID  1342921.
  36. ^ توملينسون، جيه إيه؛ باركر، آي؛ بونهام، إن. (2007). "طرق أسرع وأبسط وأكثر تحديدًا لتحسين الكشف الجزيئي عن فيتوفثورا راموروم في الحقل". علم الأحياء الدقيقة التطبيقي والبيئي . 73 (12): 4040-4047. رمز Bibcode : 2007ApEnM..73.4040T. doi : 10.1128/AEM.00161-07. PMC 1932743. PMID  17449689. 
  37. ^ هولست-جينسن، أرن؛ رونينج، سيسيل ب؛ لوفسيث، ​​أستريد؛ بيردال، كنوت ج. (2003). "تقنية تفاعل البوليميراز المتسلسل لفحص وتحديد كمية الكائنات المعدلة وراثيًا (GMOs)". الكيمياء التحليلية والحيوية . 375 (8): 985-993. doi :10.1007/s00216-003-1767-7. PMID  12733008. S2CID  43681211.
  38. ^ Brodmann PD؛ Ilg EC؛ Berthoud H؛ Herrmann A. (2002). "… -طرق تفاعل البوليميراز المتسلسل الكمي الزمني لأربعة أصناف من الذرة المعدلة وراثيًا …". مجلة AOAC الدولية . 85 (3): 646-653. doi : 10.1093/jaoac/85.3.646 . PMID  12083257.
  39. ^ Yeh SH Tsai CY Kao JH Liu CJ Kuo TJ Lin MW Huang WL Lu SF Jih J. Chen DS آخرون (2004). "التحديد الكمي والنمط الجيني لفيروس التهاب الكبد B في تفاعل واحد عن طريق تفاعل البوليميراز المتسلسل في الوقت الحقيقي والذوبان ...". مجلة أمراض الكبد . 41 (4): 659-666. doi :10.1016/j.jhep.2004.06.031. PMID  15464248.
  40. ^ Sawtell NM (1998). "احتمالية إعادة تنشيط فيروس الهربس البسيط من النوع 1 في الجسم الحي تزداد مع عدد الخلايا العصبية المصابة بشكل كامن في العقد العصبية". مجلة علم الفيروسات . 72 (8): 6888-6892. doi :10.1128/JVI.72.8.6888-6892.1998. PMC 109900. PMID  9658140 . 
  41. ^ بيتر م. روستي سي. كوتورييه ج. رادفانيي ف. تيشيما هـ. ساستر-جاراو إكس. (2006). "تنشيط MYC المرتبط بتكامل الحمض النووي لفيروس الورم الحليمي البشري في موضع MYC في الأورام التناسلية". أونكوجين . 25 (44): 5985-5993. doi : 10.1038/sj.onc.1209625 . PMID  16682952.
  42. ^ Mackay, Ian M.; Arden, Katherine E.; Nitsche, Andreas (2002-03-15). "تفاعل البوليميراز المتسلسل في الوقت الحقيقي في علم الفيروسات". Nucleic Acids Research . 30 (6): 1292–1305. doi : 10.1093/nar/30.6.1292 . ISSN  0305-1048. PMC 101343. PMID 11884626  . 

فهرس

  • إليز؛ هود، ألان (2002). "تفاعل البوليميراز المتسلسل في الوقت الحاضر: المبادئ والتطبيقات" (PDF) . مراجعات في علم الأحياء والتكنولوجيا الحيوية . 2 (2): 2-11. مؤرشف من الأصل (PDF) في 2009-06-12.
  • Bustin, SA (2000). "التقدير المطلق لـ mRNA باستخدام اختبارات تفاعل البوليميراز المتسلسل العكسي في الوقت الحقيقي". J Mol Endocrinol . 25 (2): 169–193. doi : 10.1677/jme.0.0250169 . PMID  11013345.
  • هيجوتشي، ر.؛ دولينجر، ج.؛ والش، ب.س؛ جريفيث، ر. (1992). "التضخيم والكشف المتزامن لتسلسلات الحمض النووي المحددة". التكنولوجيا الحيوية . 10 (4): 413-417. doi :10.1038/nbt0492-413. PMID  1368485. S2CID  1684150.
  • Holland, PM; Abramson, RD; Watson, R.; Gelfand, DH (1991). "اكتشاف منتج تفاعل البوليميراز المتسلسل المحدد من خلال الاستفادة من نشاط إكسونوكلياز 50 ≥30 لبوليميراز الحمض النووي Thermus aquaticus". Proc. Natl. Acad. Sci. USA . 88 (16): 7276–7280. Bibcode :1991PNAS...88.7276H. doi : 10.1073 /pnas.88.16.7276 . JSTOR  2357665. PMC  52277. PMID  1871133.
  • كوبيستا، م؛ أندرادي، جيه إم؛ بينجستون، م؛ فوروتان، أ؛ جوناك، جيه؛ ليند، كيه؛ سينديلكا، ر؛ سيوبك، ر؛ سيوجرين، ب؛ سترومبوم، ل؛ ستالبيرج، أ؛ زوريك، ن (2006). "تفاعل البوليميراز المتسلسل في الوقت الحقيقي". الجوانب الطبية . 27 (2-3): 95-125. doi :10.1016/j.mam.2005.12.007. PMID  16460794.
  • هيجوتشي، ر.؛ فوكلر، س.؛ دولينجر، ج.؛ واتسون، ر. (1993). "تفاعل البوليميراز المتسلسل الحركي: مراقبة تفاعلات تضخيم الحمض النووي في الوقت الحقيقي". التكنولوجيا الحيوية . 11 (9): 1026-1030. doi :10.1038/nbt0993-1026. PMID  7764001. S2CID  5714001.
  • فيليون، م. (2012). تفاعل البوليميراز المتسلسل الكمي في الوقت الحقيقي في علم الأحياء الدقيقة التطبيقي. دار كايستر للنشر الأكاديمي. رقم ISBN 978-1-908230-01-0.
  • Wawrik, B; Paul, JH; Tabita, FR (2002). "تحديد كمية mRNA لـ rbcL (ribulose-1,5-bisphosphate carboxylase/oxygenase) في الدياتومات والطحالب". Appl. Environ. Microbiol . 68 (8): 3771–3779. Bibcode :2002ApEnM..68.3771W. doi : 10.1128/aem.68.8.3771-3779.2002. PMC  123995. PMID  12147471.
  • لوجان جيه؛ إدواردز كيه؛ سوندرز إن، محررون (2009). تفاعل البوليميراز المتسلسل في الوقت الحقيقي: التكنولوجيا والتطبيقات الحالية . دار كايستر للنشر الأكاديمي. رقم ISBN 978-1-904455-39-4.
تم الاسترجاع من "https://en.wikipedia.org/w/index.php?title=تفاعل_سلسلة_البوليميراز_في_الوقت_الحقيقي&oldid=1234060549"
Original text
Rate this translation
Your feedback will be used to help improve Google Translate