نوكلياز إصبع الزنك

📅 آخر تحديث: ٣١ يوليو ٢٠٢٦
✍️ نُشر في: ٣١ يوليو ٢٠٢٦
📷 يحتوي على 2 صور
الموسوعة الحرة
الرسم التخطيطي لـ ZFNs

إنزيمات النيوكلياز ذات الأصابع الزنكية ( ZFNs ) هي إنزيمات تقييد اصطناعية تُنتَج عن طريق دمج نطاق ربط الحمض النووي ذي الأصابع الزنكية مع نطاق قطع الحمض النووي . يمكن هندسة نطاقات الأصابع الزنكية لاستهداف تسلسلات محددة مرغوبة من الحمض النووي ، مما يُمكّن إنزيمات النيوكلياز ذات الأصابع الزنكية من استهداف تسلسلات فريدة ضمن الجينومات المعقدة . بالاستفادة من آليات إصلاح الحمض النووي الذاتية، يمكن استخدام هذه الكواشف لتعديل جينومات الكائنات الحية العليا بدقة. إلى جانب تقنيتي CRISPR/Cas9 و TALEN ، تُعدّ إنزيمات النيوكلياز ذات الأصابع الزنكية أداة بارزة في مجال تحرير الجينوم .

تم إنشاؤه في البداية بواسطة الباحث سرينيفاسان تشاندراسيكاران .

النطاقات

نطاق ربط الحمض النووي

تحتوي نطاقات ارتباط الحمض النووي في كل من إنزيمات الزنك فينجر نوكلياز (ZFNs) عادةً على ما بين ثلاثة وستة تكرارات فردية من أصابع الزنك ، ويمكن لكل منها التعرف على ما بين 9 و18 زوجًا من القواعد النيتروجينية. إذا تعرفت نطاقات أصابع الزنك بدقة على تسلسل حمض نووي مكون من 3 أزواج من القواعد النيتروجينية، فإنها تستطيع تكوين مصفوفة ثلاثية الأصابع قادرة على التعرف على موقع مستهدف مكون من 9 أزواج من القواعد النيتروجينية. يمكن لبعض الإجراءات الأخرى استخدام وحدات أحادية أو ثنائية الأصابع لتكوين مصفوفات أصابع الزنك بستة أصابع زنك فردية أو أكثر. يتمثل العيب الرئيسي في هذا الإجراء في إمكانية تداخل خصائص أصابع الزنك الفردية، واعتمادها على سياق أصابع الزنك والحمض النووي المحيط بها. وبدون طرق لمراعاة هذا "الاعتماد على السياق"، غالبًا ما يفشل إجراء التجميع المعياري. [ 1 ]

استُخدمت طرق انتقاء عديدة لإنتاج مصفوفات أصابع الزنك القادرة على استهداف التسلسلات المطلوبة. اعتمدت الجهود الأولية على تقنية عرض العاثيات لاختيار البروتينات التي ترتبط بهدف DNA محدد من بين مجموعة كبيرة من مصفوفات أصابع الزنك العشوائية جزئيًا. واستخدمت جهود أحدث أنظمة الخميرة أحادية الهجين، وأنظمة البكتيريا أحادية وثنائية الهجين، وخلايا الثدييات. وتعتمد طريقة جديدة واعدة لاختيار مصفوفات أصابع الزنك على نظام بكتيريا ثنائي الهجين، وقد أطلق عليها مبتكروها اسم "OPEN". [ 2 ] يجمع هذا النظام مجموعات مختارة مسبقًا من أصابع الزنك الفردية، حيث تم اختيار كل منها للارتباط بثلاثية محددة، ثم يستخدم جولة ثانية من الانتقاء للحصول على مصفوفات ثلاثية الأصابع قادرة على الارتباط بتسلسل 9 أزواج قاعدية مطلوب. وقد طوّر اتحاد أصابع الزنك هذا النظام كبديل للمصادر التجارية لمصفوفات أصابع الزنك المُهندسة.

(انظر: الكيميرا ذات الأصابع الزنكية لمزيد من المعلومات حول تقنيات اختيار الأصابع الزنكية)

نطاق انقسام الحمض النووي

يُظهر الشكل زوجًا من إنزيمات الزنك فينجر نوكلياز (ZFNs)، يحتوي كل منهما على ثلاثة أصابع زنك ترتبط بالحمض النووي المستهدف، حيث يُحدثان قطعًا مزدوجًا في نطاق FokI، الموضح باللون الأصفر. ويُظهر الشكل أيضًا إصلاح هذا القطع المزدوج إما عن طريق الإصلاح الموجه بالتماثل أو عن طريق ربط النهايات غير المتماثلة . [ 3 ]

يُستخدم نطاق القطع غير النوعي من إنزيم القطع الداخلي FokI من النوع IIs عادةً كنطاق قطع في إنزيمات الزنك فينجر نوكلياز (ZFNs). [ 4 ] يجب أن يتحد نطاق القطع هذا مع اثنين من إنزيمات ZFN لقطع الحمض النووي DNA [ 5 ] ، وبالتالي يلزم زوج من إنزيمات ZFN لاستهداف مواقع الحمض النووي غير المتناظرة. تدمج إنزيمات ZFN القياسية نطاق القطع مع الطرف الكربوكسيلي لكل نطاق من نطاقات الزنك فينجر. للسماح لنطاقي القطع بالتحد مع اثنين من إنزيمات ZFN وقطع الحمض النووي DNA، يجب أن يرتبط كل من إنزيمي ZFN بشريطين متقابلين من الحمض النووي DNA مع وجود مسافة معينة بين طرفيهما الكربوكسيليين. تتطلب تسلسلات الربط الأكثر شيوعًا بين نطاق الزنك فينجر ونطاق القطع أن تكون الحافة 5′ لكل موقع ارتباط مفصولة بمسافة تتراوح من 5 إلى 7 أزواج قاعدية. [ 6 ]

استُخدمت تقنيات هندسة بروتينية متنوعة لتحسين كلٍّ من نشاط وخصوصية نطاق النيوكلياز المستخدم في إنزيمات الزنك فينجر نوكلياز (ZFNs). وقد استُخدم التطور الموجه لإنتاج متحوّر من إنزيم FokI ذي نشاط قطع مُحسَّن، أطلق عليه الباحثون اسم "Sharkey". [ 7 ] كما استُخدم التصميم القائم على البنية لتحسين خصوصية القطع لإنزيم FokI عن طريق تعديل سطح التفاعل بين الوحدتين، بحيث تكون الأنواع غير المتجانسة المُستهدفة فقط هي النشطة. [ 8 ] [ 9 ] [ 10 ] [ 11 ]

التطبيقات

تُعد نوكليازات أصابع الزنك مفيدة في التلاعب بجينومات العديد من النباتات والحيوانات بما في ذلك نبات الرشاد ، [ 12 ] [ 13 ] التبغ ، [ 14 ] [ 15 ] فول الصويا ، [ 16 ] الذرة ، [ 17 ] ذبابة الفاكهة ، [ 18 ] الدودة الأسطوانية ، [ 19 ] دودة بلاتينيريس دوميريلي ، [ 20 ] قنفذ البحر ، [ 21 ] دودة القز ، [ 22 ] سمكة الزيبرا ، [ 23 ] الضفادع ، [ 24 ] الفئران ، [ 25 ] الجرذان ، [ 26 ] الأرانب ، [ 27 ] الخنازير ، [ 28 ] الماشية ، [ 29 ] وأنواع مختلفة من خلايا الثدييات. [ 30 ] استُخدمت نوكليازات أصابع الزنك أيضًا في نموذج فأري للهيموفيليا [ 31 ] ، وأظهرت تجربة سريرية أن خلايا CD4+ التائية البشرية التي تم تعطيل جين CCR5 فيها بواسطة نوكليازات أصابع الزنك آمنة كعلاج محتمل لفيروس نقص المناعة البشرية/الإيدز . [ 32 ] تُستخدم نوكليازات أصابع الزنك أيضًا لإنشاء جيل جديد من نماذج الأمراض الوراثية يُسمى نماذج الأمراض البشرية المتماثلة جينيًا .

تعطيل الأليل

يمكن استخدام إنزيمات الزنك فينجر نوكلياز (ZFNs) لتعطيل الطفرات السائدة لدى الأفراد غير المتماثلين الزيجوت عن طريق إحداث كسور في سلسلتي الحمض النووي (DSBs) في الأليل الطافر (انظر إعادة التركيب الجيني ) . في غياب قالب متماثل، يتم إصلاح هذه الكسور بواسطة آلية الربط غير المتماثل للنهايات (NHEJ). تُصلح آلية NHEJ كسور سلسلتي الحمض النووي عن طريق ربط النهايتين معًا، وعادةً لا تُحدث طفرات، شريطة أن يكون القطع نظيفًا وبسيطًا. مع ذلك، في بعض الحالات، يكون الإصلاح غير كامل، مما يؤدي إلى حذف أو إدخال أزواج من القواعد، مُحدثًا انزياحًا في إطار القراءة ، ويمنع إنتاج البروتين الضار. [ 33 ] كما يمكن استخدام أزواج متعددة من إنزيمات ZFNs لإزالة أجزاء كبيرة كاملة من التسلسل الجينومي. [ 34 ] لمراقبة عملية التحرير، يُجرى تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR) للمنطقة المستهدفة لتضخيم كلا الأليلين، وإذا احتوى أحدهما على إدخال أو حذف أو طفرة، فإنه ينتج عنه فقاعة أحادية السلسلة غير متجانسة يمكن لفحوصات الانقسام اكتشافها بسهولة. كما استُخدمت إنزيمات الزنك فينجر نوكلياز (ZFNs) لتعديل الأليلات المسببة للأمراض في اضطرابات تكرار الثلاثيات. تُعدّ تكرارات CAG/CTG المتوسعة الأساس الجيني لأكثر من اثني عشر اضطرابًا عصبيًا وراثيًا، بما في ذلك داء هنتنغتون ، وضمور العضلات التوتري ، والعديد من أنواع الرنح المخيخي النخاعي . وقد ثبت في الخلايا البشرية أن إنزيمات الزنك فينجر نوكلياز (ZFNs) قادرة على توجيه كسور السلسلة المزدوجة (DSBs) إلى تكرارات CAG وتقليص التكرار من أطوال مرضية طويلة إلى أطوال قصيرة أقل سمية. [ 35 ]

نجح فريق من الباحثين مؤخرًا في تطبيق تقنية ZFN لتعديل جين صبغة gol وجين ntl وراثيًا في أجنة سمك الزيبرا. وقد صُممت أنماط محددة من أصابع الزنك للتعرف على تسلسلات DNA مميزة. حُقن mRNA المشفر لـ ZFN في أجنة أحادية الخلية، وحملت نسبة عالية من الحيوانات الطفرات والأنماط الظاهرية المطلوبة. أظهرت أبحاثهم أن ZFN قادرة على إنشاء أليلات طافرة وراثية بشكل دقيق وفعال في مواقع محددة في الخلايا الجنسية، وأن هذه الأليلات يمكن توريثها في الأجيال اللاحقة.

أجرت مجموعات بحثية أخرى أبحاثًا مماثلة باستخدام تقنية ZFNs لإحداث طفرات محددة في أجنة سمك الزيبرا. يشفر جين kdr في سمك الزيبرا مستقبل عامل نمو بطانة الأوعية الدموية-2. وقد حثّت مجموعة من الباحثين في الولايات المتحدة على إحداث طفرات في هذا الموقع المستهدف باستخدام تقنية ZFN. وأشاروا إلى أن هذه التقنية تتيح توليد سلسلة أليلية مستهدفة من الطفرات بسهولة؛ فهي لا تعتمد على وجود خطوط خلايا جذعية جنينية خاصة بالنوع ، ويمكن تطبيقها على الفقاريات الأخرى، لا سيما تلك التي يسهل الحصول على أجنةها؛ وأخيرًا، من الممكن أيضًا تحقيق إدخالات جينية مستهدفة في سمك الزيبرا، وبالتالي من الممكن إنشاء نماذج لأمراض بشرية كانت غير متاحة سابقًا.

تحرير الأليلات

تُستخدم إنزيمات الزنك فينجر نوكلياز (ZFNs) أيضًا لإعادة كتابة تسلسل الأليل عن طريق استدعاء آلية إعادة التركيب المتماثل (HR) لإصلاح كسر الحمض النووي المزدوج (DSB) باستخدام قطعة الحمض النووي المُقدمة كقالب. تبحث آلية إعادة التركيب المتماثل عن التماثل بين الكروموسوم التالف والقطعة خارج الكروموسوم، وتنسخ تسلسل القطعة بين طرفي الكروموسوم المكسورين، بغض النظر عما إذا كانت القطعة تحتوي على التسلسل الأصلي أم لا. إذا كان الفرد متماثل الزيجوت للأليل المستهدف، فإن كفاءة التقنية تنخفض لأن النسخة غير التالفة من الأليل قد تُستخدم كقالب للإصلاح بدلًا من القطعة المُقدمة.

العلاج الجيني

يعتمد نجاح العلاج الجيني على إدخال الجينات العلاجية بكفاءة في موقع كروموسومي مستهدف مناسب ضمن الجينوم البشري ، دون التسبب في تلف الخلايا أو طفرات سرطانية أو استجابة مناعية . يُعدّ بناء نواقل البلازميد بسيطًا ومباشرًا. توفر إنزيمات الزنك فينجر نوكلياز (ZFNs) المصممة خصيصًا، والتي تجمع بين نطاق الانقسام غير المحدد (N) لإنزيم Fok I الداخلي وبروتينات الزنك فينجر (ZFPs)، طريقة عامة لإحداث كسر مزدوج السلسلة (DSB) في موقع محدد من الجينوم، وتحفيز إعادة التركيب المتماثل الموضعي بمقادير كبيرة. هذا يجعل تصحيح الجينات المستهدف أو تحرير الجينوم خيارًا عمليًا في الخلايا البشرية. نظرًا لإمكانية استخدام البلازميدات المشفرة لإنزيمات الزنك فينجر نوكلياز (ZFNs) للتعبير المؤقت عنها لاستهداف كسر مزدوج السلسلة (DSB) في موقع جيني محدد في الخلايا البشرية، فإنها توفر طريقة ممتازة لتوصيل الجينات العلاجية بشكل مستهدف إلى موقع كروموسومي محدد مسبقًا. يتمتع النهج القائم على البلازميد المشفر لإنزيمات الزنك فينجر نوكلياز (ZFN) بإمكانية تجاوز جميع المشكلات المرتبطة بالتوصيل الفيروسي للجينات العلاجية. [ 36 ] من المرجح أن تتضمن التطبيقات العلاجية الأولى لإنزيمات الزنك فينجر نوكلياز العلاج خارج الجسم الحي باستخدام الخلايا الجذعية للمريض نفسه. بعد تعديل جينوم الخلية الجذعية، يمكن تكثير الخلايا في مزارع خلوية وإعادة زرعها في جسم المريض لإنتاج خلايا متمايزة ذات وظائف مصححة. تشمل الأهداف الأولية على الأرجح أسباب الأمراض أحادية الجين، مثل جين IL2Rγ وجين β-غلوبين لتصحيح الجينات، وجين CCR5 لإحداث الطفرات وتعطيله. [ 33 ]

المشاكل المحتملة

انقسام غير مقصود

إذا لم تكن نطاقات أصابع الزنك متخصصة بما يكفي لموقعها المستهدف، أو إذا لم تستهدف موقعًا فريدًا ضمن الجينوم محل الاهتمام، فقد يحدث انقسام خارج الهدف. قد يؤدي هذا الانقسام إلى إنتاج عدد كافٍ من كسور الحمض النووي المزدوجة لإرباك آليات الإصلاح، وبالتالي، حدوث إعادة ترتيب كروموسومي و/أو موت خلوي. كما قد تُعزز أحداث الانقسام خارج الهدف التكامل العشوائي للحمض النووي المانح. [ 33 ] وقد تم إثبات طريقتين منفصلتين لتقليل الانقسام خارج الهدف لإنزيمات الزنك ذات الأصابع الثلاثة التي تستهدف موقعين متجاورين بطول 9 أزواج قاعدية. [ 37 ] تستخدم مجموعات أخرى إنزيمات الزنك ذات الأصابع الأربعة أو الخمسة أو الستة التي تستهدف مواقع أطول، ومن المفترض أنها أقل شيوعًا، ومن الناحية النظرية، يمكن أن تُنتج هذه الإنزيمات نشاطًا أقل خارج الهدف. أظهرت مقارنة بين زوج من إنزيمات الزنك فنجر نوكلياز ثلاثية الأصابع وزوج من إنزيمات الزنك فنجر نوكلياز رباعية الأصابع حدوث انقسام خارج الهدف في الخلايا البشرية في 31 موقعًا لإنزيمات الزنك فنجر نوكلياز ثلاثية الأصابع، وفي 9 مواقع لإنزيمات الزنك فنجر نوكلياز رباعية الأصابع. [ 38 ] وكشف تسلسل الجينوم الكامل لديدان C. elegans المعدلة بزوج من إنزيمات الزنك فنجر نوكلياز خماسية الأصابع عن التعديل المقصود فقط، بالإضافة إلى حذف في موقع "غير مرتبط بموقع إنزيم الزنك فنجر نوكلياز"، مما يشير إلى أن هذا الزوج من إنزيمات الزنك فنجر نوكلياز قادر على استهداف موقع فريد في جينوم ديدان C. elegans . [ 19 ]

القدرة على إحداث استجابة مناعية

كما هو الحال مع العديد من البروتينات الغريبة التي تُدخل إلى جسم الإنسان، ثمة خطر حدوث استجابة مناعية ضد العامل العلاجي والخلايا التي ينشط فيها. ونظرًا لأن البروتين يجب أن يُعبَّر عنه بشكل عابر فقط، فإن الفترة الزمنية التي قد تتطور خلالها الاستجابة قصيرة. [ 33 ]

قام ليو وآخرون باستهداف إنزيمات ZFNickases لموقع جين بيتا-كازين الداخلي (CSN2)، مما يحفز إضافة جين الليزوستافين وجين الليزوزيم البشري عن طريق الإصلاح الموجه بالتماثل، وينتج عنه أبقار تفرز الليزوستافين. [ 39 ] [ 40 ]

الآفاق

تُتيح القدرة على التلاعب الدقيق بجينومات النباتات والحيوانات تطبيقاتٍ عديدة في البحوث الأساسية والزراعة والعلاجات البشرية. لطالما شكّل استخدام إنزيمات الزنك فينجر نوكلياز (ZFNs) لتعديل الجينات الداخلية مهمةً صعبة، ويعود ذلك أساسًا إلى صعوبة توليد نطاقات الزنك فينجر التي تستهدف التسلسل المطلوب بدقة كافية. إلا أن الطرق المُحسّنة لهندسة نطاقات الزنك فينجر، وتوفر إنزيمات الزنك فينجر نوكلياز (ZFNs) من مورد تجاري، قد جعلت هذه التقنية في متناول عدد متزايد من الباحثين. كما تعمل عدة مجموعات بحثية على تطوير أنواع أخرى من النيوكليازات المُهندسة، بما في ذلك النيوكليازات الداخلية الموجهة المُهندسة [ 41 ] [ 42 ] والنيوكليازات القائمة على مُؤثرات TAL المُهندسة [ 43 ] [ 44 ] . وتُعد نيوكليازات مُؤثرات TAL (TALENs) مثيرة للاهتمام بشكل خاص، نظرًا لسهولة هندسة مُؤثرات TAL [ 45 ] [ 46 ] ، وإمكانية استخدام TALENs لاستهداف المواقع الجينية الداخلية في الخلايا البشرية. [ 47 ] ولكن حتى الآن لم يُبلغ أحد عن عزل سلالات خلوية مستنسخة أو كائنات معدلة وراثيًا باستخدام هذه الكواشف. وقد تم اختبار نوع واحد من إنزيمات الزنك فينجر نوكلياز، يُعرف باسم SB-728-T، لتطبيقه المحتمل في علاج فيروس نقص المناعة البشرية. [ 48 ]

خدوش أصابع الزنك

تُصنع إنزيمات قطع الحمض النووي ذات الأصابع الزنكية (ZFNickases) عن طريق تعطيل النشاط التحفيزي لأحد مونومرات ZFN في ثنائي ZFN اللازم لقطع سلسلتي الحمض النووي. [ 49 ] تُظهر إنزيمات ZFNickases نشاط قطع خاصًا بسلسلة الحمض النووي في المختبر ، وبالتالي تُتيح حدوث كسور أحادية السلسلة عالية التخصص في الحمض النووي. [ 49 ] تخضع هذه الكسور أحادية السلسلة لنفس الآليات الخلوية التي تستغلها إنزيمات ZFNs، ولكنها تُظهر انخفاضًا ملحوظًا في معدل إصلاحات NHEJ المُسببة للطفرات في موقع القطع المستهدف. يُؤدي هذا الانخفاض إلى تحيز لتعديلات الجينات بوساطة إعادة التركيب المتماثل (HR). يُمكن لإنزيمات ZFNickases تحفيز إعادة التركيب المتماثل المُستهدف في الخلايا البشرية والحيوانية المُستزرعة، وإن كان ذلك بمستويات أقل من إنزيمات ZFNs المُقابلة التي اشتُقت منها، نظرًا لإمكانية إصلاح القطع دون تغيير جيني. [ 39 ] [ 50 ] يتمثل أحد القيود الرئيسية لتعديلات الجينات بوساطة إنزيمات ZFNs في التنافس بين مسارات إصلاح NHEJ وHR. بغض النظر عن وجود بنية مانحة للحمض النووي، يمكن تنشيط آليتي الإصلاح بعد حدوث كسور في الحمض النووي المزدوجة (DSBs) بفعل إنزيمات الزنك فينجر نوكلياز (ZFNs). لذا، تُعدّ إنزيمات ZFNickases أول محاولة فعّالة لهندسة طريقة تُفضّل إصلاح الحمض النووي عن طريق إعادة التركيب المتماثل (HR) بدلاً من إصلاح الحمض النووي عن طريق الربط غير المتماثل (NHEJ) المعرض للأخطاء. ومن خلال تقليل عمليات إصلاح NHEJ، تستطيع إنزيمات ZFNickases الحدّ من نطاق التعديلات غير المرغوب فيها خارج الهدف. كما أن سهولة اشتقاق إنزيمات ZFNickases من إنزيمات ZFNs تُوفّر منصةً ممتازةً لإجراء المزيد من الدراسات حول تحسينها، وربما زيادة مستويات إعادة التركيب المتماثل المُستهدفة مع الحفاظ على انخفاض معدل تكرار NHEJ.

انظر أيضاً

مراجع

  1. ↑ راميريز سي إل، فولي جيه إي، رايت دي إيه، وآخرون  (مايو 2008). "معدلات فشل غير متوقعة للتجميع المعياري لأصابع الزنك المصممة هندسيًا" . نات . ميثودز . 5 (5): 374-375 . doi : 10.1038/nmeth0508-374 . PMC 7880305. PMID 18446154 .  
  2. ↑ مايدر إم إل، وآخرون (سبتمبر 2008). "هندسة سريعة "مفتوحة المصدر" لنوكليازات أصابع الزنك المُخصصة لتعديل الجينات بكفاءة عالية" . الخلية الجزيئية . 31 (2): 294-301 . doi : 10.1016/j.molcel.2008.06.016 . PMC 2535758. PMID 18657511 .   
  3. ↑ كارول د (2011). " الهندسة الجينية باستخدام نوكليازات أصابع الزنك" . علم الوراثة . 188 (4): 773-782 . doi : 10.1534/genetics.111.131433 . PMC 3176093. PMID 21828278 .  
  4. ↑ كيم واي جي، تشا جيه، تشاندراسيكاران إس (1996). "إنزيمات التقييد الهجينة: اندماجات أصابع الزنك مع نطاق انقسام فوك 1" . وقائع الأكاديمية الوطنية للعلوم في الولايات المتحدة الأمريكية . 93 ( 3): 1156-1160 . رمز Bibcode : 1996PNAS...93.1156K . doi : 10.1073/pnas.93.3.1156 . PMC 40048. PMID 8577732 .  
  5. ↑ Bitinaite J, Wah, DA, Aggarwal AK, Schildkraut I (1998). "يُعدّ ازدواج FokI ضروريًا لقطع الحمض النووي" . وقائع الأكاديمية الوطنية للعلوم في الولايات المتحدة الأمريكية . 95 (18): 10570-10575 . Bibcode : 1998PNAS...9510570B . doi : 10.1073/pnas.95.18.10570 . PMC 27935. PMID 9724744 .  
  6. ↑ كاثومين تي، جونغ جيه كيه (يوليو 2008). "النوكليازات ذات الأصابع الزنكية: ظهور الجيل التالي" . العلاج الجزيئي 16 ( 7): 1200-1207 . doi : 10.1038/mt.2008.114 . PMID 18545224 . 
  7. ↑ غو جيه، غاج تي، بارباس سي إف (2010). "التطور الموجه لنطاق انقسام FokI المحسن وعالي الكفاءة لنوكليازات أصابع الزنك" . مجلة البيولوجيا الجزيئية . 400 (1): 96-107 . doi : 10.1016/j.jmb.2010.04.060 . PMC 2885538. PMID 20447404 .  
  8. ↑ Szczepek M, Brondani V, Büchel J, Serrano L, Segal DJ, Cathomen T (2007). "إعادة تصميم واجهة التضاعف بناءً على البنية يقلل من سمية نوكليازات أصابع الزنك" . Nature Biotechnology . 25 (7): 786–793 . doi : 10.1038/nbt1317 . PMID 17603476. S2CID 22079561 .  
  9. ↑ ميلر جيه سي، هولمز إم سي، وانغ جيه، غوشين دي واي، لي واي إل، روبنيفسكي آي، بوسيجور سي إم، وايت إيه جيه، وانغ إن إس، كيم كيه إيه، غريغوري بي دي، بابو سي أو، ريبار إي جيه (2007). "بنية محسّنة لنوكلياز أصابع الزنك لتحرير الجينوم بدقة عالية". مجلة نيتشر للتكنولوجيا الحيوية . 25 (7): 778-785 . doi : 10.1038/nbt1319 . PMID 17603475. S2CID 205273515 .  
  10. ↑ دويون واي، فو تي دي، مندل إم سي، غرينبيرغ إس جي، وانغ جيه، شيا دي إف، ميلر جيه سي، أورنوف إف دي، غريغوري بي دي، هولمز إم سي (2010). "تعزيز نشاط نوكلياز أصابع الزنك من خلال تحسين البنى غير المتجانسة الإلزامية". نيتشر ميثودز . 8 (1): 74-79 . doi : 10.1038/nmeth.1539 . PMID 21131970. S2CID 14334237 .  
  11. ↑ رامالينغام إس، كاندفيلو ك، راجيندران ر، تشاندراسيكاران إس (2011). "ابتكار نوكليازات مصممة بأصابع الزنك ذات سمية خلوية ضئيلة" . مجلة البيولوجيا الجزيئية . 405 (3): 630-641 . doi : 10.1016/j.jmb.2010.10.043 . PMC 3017627. PMID 21094162 .  
  12. ↑ تشانغ ف، مايدر إم إل، أونغر-والاس إي، هوشاو جيه بي، ريون دي، كريستيان إم، لي إكس، بييريك سي جيه، دوبس دي، بيترسون تي، جونغ جيه كيه، فويتاس دي إف (2010). "الطفرات الموجهة عالية التردد في نبات رشاد أذن الفأر باستخدام نوكليازات أصابع الزنك" . وقائع الأكاديمية الوطنية للعلوم . 107 (26): 12028-12033 . Bibcode : 2010PNAS..10712028Z . doi : 10.1073/pnas.0914991107 . PMC 2900673. PMID 20508152 .  
  13. ↑ أوساكابي ك، أوساكابي ي، توكي س (2010). "الطفرات الموجهة للموقع في نبات الأرابيدوبسيس باستخدام نوكليازات أصابع الزنك المصممة خصيصًا" . وقائع الأكاديمية الوطنية للعلوم . 107 (26): 12034-12039 . Bibcode : 2010PNAS..10712034O . doi : 10.1073/pnas.1000234107 . PMC 2900650. PMID 20508151 .  
  14. ↑ كاي سي كيو، دويون واي، أينلي دبليو إم، ميلر جيه سي، ديكيلفر آر سي، موهل إي إيه، روك جيه إم، لي واي إل، غاريسون آر، شولنبرغ إل، بلو آر، ووردن إيه، بيكر إل، فرجي إف، تشانغ إل، هولمز إم سي، ريبار إي جيه، كولينغوود تي إن، روبين-ويلسون بي، غريغوري بي دي، أورنوف إف دي، بيتولينو جيه إف (2008). "دمج الجينات المستهدفة في الخلايا النباتية باستخدام نوكليازات أصابع الزنك المصممة". بيولوجيا النبات الجزيئية . 69 (6): 699-709 . doi : 10.1007/s11103-008-9449-7 . ISSN 0167-4412 . PMID 19112554. S2CID 6826269 .   
  15. ↑ تاونسند، جيه. إيه.، ورايت، دي. إيه.، ووينفري، آر. جيه.، وفو، إف.، ومايدر، إم. إل.، وجونغ، جيه. كيه.، وفويتاس، دي. إف. (2009). " تعديل الجينات النباتية بتردد عالٍ باستخدام نوكليازات أصابع الزنك المُهندسة" . مجلة نيتشر . 459 (7245): 442-445 . Bibcode : 2009Natur.459..442T . doi : 10.1038/nature07845 . PMC 2743854. PMID 19404258 .  
  16. ↑ كورتين إس جيه، تشانغ إف، ساندر جيه دي، هاون دبليو جيه، ستاركير سي، بالتس إن جيه، ريون دي، دالبورغ إي جيه، غودوين إم جيه، كوفمان إيه بي، دوبس دي، جونغ جيه كيه، فويتاس دي إف، ستوبار آر إم (2011). " الطفرات الموجهة للجينات المكررة في فول الصويا باستخدام نوكليازات أصابع الزنك" . علم وظائف النبات . 156 (2): 466-473 . doi : 10.1104/pp.111.172981 . PMC 3177250. PMID 21464476 .  
  17. ↑ شوكلا، ف. ك.، دويون، ي.، ميلر، ج. س.، وآخرون . (مايو 2009). "تعديل دقيق للجينوم في محصول الذرة (Zea mays) باستخدام نوكليازات أصابع الزنك". مجلة نيتشر . 459 (7245): 437-441 . Bibcode : 2009Natur.459..437S . doi : 10.1038/nature07992 . PMID: 19404259. S2CID : 4323298 .   
  18. ↑ بيبكوفا م، بيومر ك، تراوتمان ج، كارول د (2003). " تحسين استهداف الجينات باستخدام نوكليازات أصابع الزنك المصممة". مجلة ساينس . 300 (5620): 764. doi : 10.1126/science.1079512 . PMID 12730594. S2CID 42087531 .  
  19. وود إيه جيه ، لو تي دبليو، زيتلر بي، بيكل سي إس، رالستون إي جيه، لي إيه إتش، أمورا آر، ميلر جيه سي، ليونغ إي، مينغ إكس، تشانغ إل، ريبار إي جيه، غريغوري بي دي، أورنوف إف دي، ماير بي جيه (2011). " التعديل الجيني المستهدف عبر الأنواع باستخدام ZFNs وTALENs" . مجلة ساينس . 333 (6040): 307. Bibcode : 2011Sci...333..307W . doi : 10.1126/science.1207773 . PMC 3489282. PMID 21700836 .  
  20. ^ غوهمان إم، جيا إتش، راندل إن، فيراسزتو سي، بيزاريس كالديرون لوس أنجلوس، ميشيلز إن كيه، يوكوياما إس، جيكلي جي (أغسطس 2015). "الضبط الطيفي للانجذاب الضوئي بواسطة Go-Opsin في عيون Platynereis Rhabdomeric" . علم الأحياء الحالي . 25 (17): 2265–2271 . بيب كود : 2015CBio...25.2265G . دوى : 10.1016/j.cub.2015.07.017 . بميد 26255845 . 
  21. ↑ أوتشياي هـ، فوجيتا ك، سوزوكي ك.إ، نيشيكاوا م، شيباتا ت، ساكاموتو ن، ياماموتو ت (2010). "الطفرات الموجهة في جنين قنفذ البحر باستخدام نوكليازات أصابع الزنك" . جينات إلى خلايا . 15 (8): 875-885 . doi : 10.1111/j.1365-2443.2010.01425.x . PMID 20604805 . 
  22. ↑ تاكاسو واي، كوباياشي آي، بيومر كيه، أوشينو كيه، سيزوتسو إتش، ساجوان إس، كارول دي، تامورا تي، زوروفيتش إم (2010). "الطفرات الموجهة في دودة القز Bombyx mori باستخدام حقن mRNA لنوكلياز إصبع الزنك". الكيمياء الحيوية والبيولوجيا الجزيئية للحشرات . 40 (10): 759-765 . Bibcode : 2010IBMB...40..759T . doi : 10.1016/j.ibmb.2010.07.012 . hdl : 11104/0188585 . PMID 20692340 . 
  23. ↑ إيكر إس سي (2008). " تقنيات تعطيل الجينات في سمك الزيبرا باستخدام أصابع الزنك" . سمك الزيبرا . 5 (2): 1121-1123 . doi : 10.1089/zeb.2008.9988 . PMC 2849655. PMID 18554175 .  
  24. ↑ يونغ جيه جيه، شيرون جيه إم، دويون واي، أنكودينوفا آي، فرجي إف إم، لي إيه إتش، نجو سي، غوشين دي واي، باشون دي إي، ميلر جيه سي، تشانغ إل، ريبار إي جيه، غريغوري بي دي، أورنوف إف دي، هارلاند آر إم، زيتلر بي (2011). "تعطيل الجينات المستهدف بكفاءة في الخلايا الجسدية والخلايا الجنسية لضفدع زينوبوس تروبيكاليس باستخدام نوكليازات أصابع الزنك المُهندسة" . وقائع الأكاديمية الوطنية للعلوم . 108 (17): 7052-7057 . Bibcode : 2011PNAS..108.7052Y . doi : 10.1073/pnas.1102030108 . PMC 3084115. PMID 21471457 .  
  25. ↑ Goldberg AD، Banaszynski LA، Noh KM، Lewis PW، Elsaesser SJ، Stadler S، Dewell S، Law M، Guo X، Li X، Wen D، Chapgier A، Dekelver RC، Miller JC، Lee YL، Boydston EA، Holmes MC، Gregory PD، Greally JM، Rafii S، Yang C، Scambler PJ، Garrick D، جيبونز آر جيه، هيجز دي آر، كريستيا آي إم، أورنوف إف دي، تشنغ دي، أليس سي دي (2010). "العوامل المميزة تتحكم في توطين متغير هيستون H3.3 في مناطق جينومية محددة" . خلية . 140 (5): 678-691 . دوى : 10.1016/j.cell.2010.01.003 . بمك 2885838 . PMID 20211137 .  
  26. ↑ جورتس إيه إم، كوست جي جي، فرايفرت واي، زيتلر بي، ميلر جي سي، تشوي في إم، جينكينز إس إس، وود إيه، كوي إكس، مينغ إكس، فنسنت إيه، لام إس، ميشالكيفيتش إم، شيلينغ آر، فوكلر جيه، كالواي إس، ويلر إتش، مينوريه إس، أنيغون آي، ديفيس جي دي، تشانغ إل، ريبار إي جيه، غريغوري بي دي، أورنوف إف دي، جاكوب إتش جيه، بيلو آر (2009). "فئران معدلة وراثيًا عن طريق الحقن المجهري للأجنة بنوكليازات أصابع الزنك" . مجلة ساينس . 325 (5939): 433. Bibcode : 2009Sci...325..433G . doi : 10.1126/science.1172447 . PMC 2831805 . PMID 19628861 .  
  27. ↑ فليسيكوفسكا تي، ثوري آي إس، أوفنر إس، روس إف، ليفكي في، زيتلر بي، روتمان أو، فنسنت إيه، زانغ إل، جينكينز إس، نيرسباخ إتش، كايند إيه جيه، غريغوري بي دي، شنيكي إيه إي، بلاتزر جيه (2011). ميلستون دي إس (محرر). "تعطيل جينات الغلوبولين المناعي بكفاءة واستبدالها الموجه في الأرانب باستخدام نوكليازات أصابع الزنك" . PLOS ONE . 6 (6) e21045. Bibcode : 2011PLoSO...621045F . doi : 10.1371 / journal.pone.0021045 . PMC 3113902. PMID 21695153 .  
  28. ↑ هاوشيلد ج، بيترسن ب، سانتياغو ي، كويسر أ.ل، كارنواث ج.و، لوكاس-هان أ، تشانغ ل، مينغ إكس، غريغوري ب.د، شوينزر ر، كوست ج.ج، نيمان هـ (2011). "توليد فعال لطفرة حذف ثنائية الأليل في الخنازير باستخدام نوكليازات أصابع الزنك" . وقائع الأكاديمية الوطنية للعلوم . 108 (29): 12013-12017 . Bibcode : 2011PNAS..10812013H . doi : 10.1073/pnas.1106422108 . PMC 3141985. PMID 21730124 .  
  29. ↑ يو إس، لو جيه، سونغ زد، دينغ إف، داي واي، لي إن (2011). "تعديل عالي الكفاءة لجين بيتا لاكتوغلوبولين (BLG) عبر نوكليازات أصابع الزنك في الماشية" . أبحاث الخلية . 21 (11): 1638-1640 . doi : 10.1038/cr.2011.153 . PMC 3364726. PMID 21912434 .  
  30. ↑ كارول د (2008). "النوكليازات ذات الأصابع الزنكية كعوامل للعلاج الجيني" . العلاج الجيني . 15 (22): 1463-1468 . doi : 10.1038/gt.2008.145 . PMC 2747807. PMID 18784746 .  
  31. ↑ لي هـ، هوريغوت ف، دويون ي، لي ت، وونغ س ي، بهاجوات أ س، مالاني ن، أنغويلا إكس إم، شارما ر، إيفانشيو ل، مورفي س ل، فين ج د، خازي ف ر، تشو س، باشون د إي، ريبار إي ج، بوشمان ف د، غريغوري ب د، هولمز م س، هاي ك أ (2011). " تعديل الجينوم في الجسم الحي يعيد التوازن الدموي في نموذج فأر مصاب بالهيموفيليا" . نيتشر . 475 (7355): 217-221 . doi : 10.1038/nature10177 . PMC 3152293. PMID 21706032 .  
  32. ↑ تيباس ب، شتاين د، تانغ و.ف، فرانك إ، وانغ س، لي ج، سبرات س.ك، سوروسكي ر.ت، جيدلين م، نيكول ج، هولمز م.س، غريغوري ب.د، أندو د.ج، كالوس م، كولمان ر.ج، بيندر-شول ج، بليسا ج، هوانغ و.ت، ليفين ب، جون س.هـ (6 مارس 2014). "تعديل جين CCR5 في خلايا CD4 التائية الذاتية لدى الأشخاص المصابين بفيروس نقص المناعة البشرية" . مجلة نيو إنجلاند الطبية . 370 (10): 901-910 . doi : 10.1056/NEJMoa1300662 . PMC 4084652. PMID 24597865 .  
  33. 1 2 3 4 دوراي إس، ماني إم، كاندفيلو كيه، وو جيه، بورتيوس إم إتش، تشاندراسيكاران إس (2005). " نوكليازات أصابع الزنك: مقصات جزيئية مصممة خصيصًا لهندسة جينوم الخلايا النباتية والثديية" . أبحاث الأحماض النووية . 33 (18): 5978-5990 . doi : 10.1093/nar/gki912 . PMC 1270952. PMID 16251401 .  
  34. ↑ لي إتش جيه، كيم إي، كيم جيه إس (ديسمبر 2009). " حذف الكروموسومات المستهدف في الخلايا البشرية باستخدام نوكليازات أصابع الزنك" . أبحاث الجينوم . 20 (1): 81-89 . doi : 10.1101/gr.099747.109 . PMC 2798833. PMID 19952142 .  
  35. ↑ ميتلمان د، موي س، مورتون ج، سيكوديس ك، لين ي، كارول د، ويلسون جيه إتش (16 يونيو 2009). "تعزيز عدم استقرار التكرارات في الخلايا البشرية من خلال فواصل الحمض النووي المزدوجة الموجهة بواسطة أصابع الزنك ضمن تسلسلات تكرار CAG" . وقائع الأكاديمية الوطنية للعلوم في الولايات المتحدة الأمريكية . 106 (24): 9607-9612 . Bibcode : 2009PNAS..106.9607M . doi : 10.1073 / pnas.0902420106 . PMC 2701052. PMID 19482946 .  
  36. ↑ كاندفيلو ك، تشاندراسيكاران س (2008). "البلازميدات للعلاج الجيني". البلازميدات: البحوث الحالية والاتجاهات المستقبلية . نورفولك: مطبعة كايستر الأكاديمية. ISBN 978-1-904455-35-6.
  37. ↑ غوبتا أ، مينغ إكس، تشو إل جيه، لوسون إن دي، وولف إس إيه (سبتمبر 2010). "مساهمات بروتينات أصابع الزنك المعتمدة وغير المعتمدة على بروتينات أصابع الزنك في النشاط غير المستهدف لإنزيمات نوكلياز أصابع الزنك في الجسم الحي" . مجلة أبحاث الأحماض النووية . 39 (1): 381-392 . doi : 10.1093 / nar/gkq787 . PMC 3017618. PMID 20843781 .  
  38. ↑ باتاناياك، ف.، راميريز، س. ل.، جونغ، ج. ك.، ليو، د. ر. (2011). "الكشف عن خصائص الانقسام غير المستهدفة لنوكليازات أصابع الزنك عن طريق الانتقاء المختبري" . مجلة نيتشر ميثودز . 8 (9): 765-770 . doi : 10.1038/nmeth.1670 . PMC 3164905. PMID 21822273 .  
  39. 1 2 ليو إكس، وانغ واي إس، غو دبليو جيه، تشانغ بي إتش، ليو جيه، غو زد كيه، كوان إف إس، تشانغ واي (2013). "إدخال جين الليزوستافين في موضع بيتا-كازين في الأبقار المستنسخة بواسطة إنزيم نيكاز ذي أصابع الزنك" . نيتشر كوميونيكيشنز . 4 2565. Bibcode : 2013NatCo...4.2565L . doi : 10.1038/ncomms3565 . PMC 3826644. PMID 24121612 .  
  40. ↑ ليو إكس، وانغ واي، تيان واي، يو واي، غاو إم، هو جي، سو إف، بان إس، لو واي، غو زد، كوان إف، تشانغ واي (2014). "توليد مقاومة التهاب الضرع في الأبقار عن طريق استهداف جين الليزوزيم البشري لموقع الكازين باستخدام نوكليازات أصابع الزنك" . وقائع الجمعية الملكية ب: العلوم البيولوجية . 281 (1780) 20133368. doi : 10.1098/rspb.2013.3368 . PMC 4027401. PMID 24552841 .  
  41. ↑ غريزو إس، سميث جيه، دابوسي إف، وآخرون (سبتمبر 2009). "استهداف فعال لجين SCID بواسطة إنزيم نووي داخلي أحادي السلسلة مُهندس" . مجلة أبحاث الأحماض النووية . 37 (16): 5405-5419 . doi : 10.1093/nar/gkp548 . PMC 2760784. PMID 19584299 .   
  42. ↑ غاو هـ، سميث ج، يانغ م، جونز س، ديوكانوفيتش ف، نيكلسون م ج، ويست أ، بيدني د، فالكو س س، جانتز د، ليزنيك ل أ (2010). "الطفرات الوراثية المستهدفة في الذرة باستخدام إنزيم نووي داخلي مصمم". مجلة النبات . 61 (1): 176-187 . doi : 10.1111/j.1365-313X.2009.04041.x . PMID 19811621 . 
  43. ↑ كريستيان م، سيرماك ت، دويل إي إل، وآخرون . (يوليو 2010). "استهداف فواصل الحمض النووي المزدوجة باستخدام نوكليازات TAL المؤثرة" . علم الوراثة . 186 (2): 757-761 . doi : 10.1534/genetics.110.120717 . PMC 2942870. PMID 20660643 .   
  44. ↑ لي تي، هوانغ إس، جيانغ دبليو زد، وآخرون (أغسطس 2010). "نوكليازات TAL (TALNs): بروتينات هجينة تتكون من مؤثرات TAL ونطاق قطع الحمض النووي FokI" . مجلة أبحاث الأحماض النووية . 39 (1): 359-372 . doi : 10.1093/nar/gkq704 . PMC 3017587. PMID 20699274 .   
  45. ↑ موسكو إم جيه، بوغدانوف إيه جيه (ديسمبر 2009). "شفرة بسيطة تحكم التعرف على الحمض النووي بواسطة مُؤثرات TAL". مجلة ساينس . 326 (5959): 1501. Bibcode : 2009Sci...326.1501M . doi : 10.1126/science.1178817 . PMID 19933106. S2CID 6648530 .  
  46. ↑ Boch J, Scholze H, Schornack S, Hahn S, Kay S, Lahaye T, Nickstadt A, Bonas U (ديسمبر 2009). "فك شفرة خصوصية ارتباط الحمض النووي لمؤثرات TAL من النوع الثالث". مجلة ساينس . 326 (5959): 1509-1512 . Bibcode : 2009Sci...326.1509B . doi : 10.1126/science.1178811 . PMID 19933107. S2CID 206522347 .  
  47. ↑ ميلر جيه سي، تان إس، تشياو جي، بارلو كيه إيه، وانغ جيه، شيا دي إف، مينغ إكس، باشون دي إي، ليونغ إي، هينكلي إس جيه، دولاي جي بي، هوا كيه إل، أنكودينوفا آي، كوست جي جيه، أورنوف إف دي، تشانغ إتش إس، هولمز إم سي، تشانغ إل، غريغوري بي دي، ريبار إي جيه (2010). "بنية نوكلياز TALE لتحرير الجينوم بكفاءة". مجلة Nature Biotechnology . 29 (2): 143-148 . doi : 10.1038/nbt.1755 . PMID 21179091. S2CID 53549397 .  
  48. ↑ ويد ن (28 ديسمبر 2009). "أصابع الزنك قد تكون مفتاحًا لإحياء العلاج الجيني" . صحيفة نيويورك تايمز . تم الاطلاع عليه بتاريخ 31 مايو 2016 .
  49. 1 2 راميريز سي إل، سيرتو إم تي، موسولينو سي، غودوين إم جيه، كراديك تي جيه، مكافري إيه بي، كاثومين تي، شارينبيرغ إيه إم، جونغ جيه كيه (2012). "إن إنزيمات النيكاز ذات الأصابع الزنكية المُهندسة تحفز إصلاحًا موجهًا بالتماثل مع تأثيرات طفرية مُخفَّضة" . مجلة أبحاث الأحماض النووية . 40 (7): 5560-5568 . doi : 10.1093/nar/gks179 . PMC 3384306. PMID 22373919 .  
  50. ↑ وانغ جيه، فريدمان جي، دويون واي، وانغ إن إس، لي سي جيه، ميلر جيه سي، هوا كيه إل، يان جيه إي، بابيارز بي دي، غريغوري بي دي، هولمز إم سي (2012). "إضافة جينية مستهدفة إلى موقع محدد مسبقًا في الجينوم البشري باستخدام إنزيم قطع قائم على ZFN" . أبحاث الجينوم . 22 (4): 1316-1326 . doi : 10.1101/gr.122879.111 . PMC 3396372. PMID 22434427 .  

للمزيد من القراءة