تقنية الهيبريدوما

📅 آخر تحديث: ٢٦ يوليو ٢٠٢٦
✍️ نُشر في: ٢٦ يوليو ٢٠٢٦
📷 يحتوي على 3 صور
الموسوعة الحرة
تمثيل عام لطريقة الهيبريدوما المستخدمة لإنتاج الأجسام المضادة وحيدة النسيلة.

تقنية الهيبريدوما هي طريقة لإنتاج كميات كبيرة من الأجسام المضادة وحيدة النسيلة عن طريق دمج خلايا بائية منتجة للأجسام المضادة مع خلايا المايلوما (خلايا بائية سرطانية). ينتج عن ذلك خلايا هجينة، تُسمى الهيبريدوما، تُنتج الجسم المضاد من الخلية البائية الأصلية مع الحفاظ على خصائص سلالة خلايا المايلوما الأصلية، مثل الخلود (التكاثر المستمر) والخصائص المرغوبة لزراعة الخلايا . تُجمع الخلايا البائية المستخدمة عادةً من حيوانات تم تحصينها بمستضد يُراد إنتاج جسم مضاد يستهدفه.

بعد تكوين الخلايا الهجينة، يتم قتل أي خلايا غير هجينة قبل الفحص والاستنساخ الأحادي لإنشاء سلالات الخلايا الهجينة المشتقة من خلية أبوية واحدة وبالتالي إنتاج نفس الجسم المضاد ضد الهدف المطلوب.

ابتكر سيزار ميلشتاين وجورج جيه ​​إف كولر إنتاج الأجسام المضادة وحيدة النسيلة عام 1975. وقد تقاسما جائزة نوبل في الطب وعلم وظائف الأعضاء عام 1984 مع نيلز كاي جيرن ، الذي قدم إسهامات أخرى في علم المناعة. وقد صاغ ليونارد هيرزنبرغ مصطلح "الهيبريدوما" خلال فترة تفرغه العلمي في مختبر ميلشتاين في الفترة 1976-1977. [ 1 ]

طريقة

(1) تحصين فأر (2) عزل الخلايا البائية من الطحال (3) زراعة خلايا الورم النخاعي المتعدد (4) دمج خلايا الورم النخاعي المتعدد مع الخلايا البائية (5) فصل سلالات الخلايا (6) فحص سلالات الخلايا المناسبة (7) التكاثر في المختبر (أ) أو في الجسم الحي (ب) (8) معالجة الطحال المستأصل لاستخلاص الأجسام المضادة
خلايا الهيبريدوما المزروعة في مزارع الأنسجة. تُظهر الصورة مستنسخًا واحدًا من الخلايا، حيث تُنتج كل خلية كميات كبيرة من جسم مضاد أحادي النسيلة محدد، والذي تفرزه الخلايا ويمكن تنقيته بسهولة من وسط الاستزراع.

تُعرَّض حيوانات المختبر ( الثدييات ، مثل الفئران) أولًا للمستضد المراد توليد الأجسام المضادة ضده. ويتم ذلك عادةً عبر سلسلة من حقن المستضد المعني على مدار عدة أسابيع. ويتبع هذه الحقن عادةً استخدام التثقيب الكهربائي داخل الجسم الحي ، مما يُعزز الاستجابة المناعية بشكل ملحوظ. بعد عزل الخلايا الطحالية من طحال الثدييات ، تُدمج الخلايا البائية مع خلايا الورم النخاعي الخالدة. ويمكن دمج الخلايا البائية مع خلايا الورم النخاعي باستخدام الدمج الكهربائي، حيث يؤدي الدمج الكهربائي إلى اصطفاف الخلايا البائية وخلايا الورم النخاعي واندماجها بتطبيق مجال كهربائي. وبدلاً من ذلك، يمكن دمج الخلايا البائية وخلايا الورم النخاعي باستخدام بروتوكولات كيميائية، غالبًا باستخدام بولي إيثيلين جلايكول . يتم اختيار خلايا الورم النخاعي مسبقًا للتأكد من أنها لا تفرز الأجسام المضادة بنفسها وأنها تفتقر إلى جين هيبوكسانثين-جوانين فوسفوريبوزيل ترانسفيراز (HGPRT)، مما يجعلها حساسة (أو عرضة) لوسط HAT (انظر أدناه).

تُحضن الخلايا المندمجة في وسط HAT ( وسط هيبوكسانثين - أمينوبترين - ثيميدين ) لمدة تتراوح بين 10 و14 يومًا تقريبًا. يعمل الأمينوبترين على تثبيط مسار تخليق النيوكليوتيدات، وبالتالي تموت خلايا المايلوما غير المندمجة، لعدم قدرتها على إنتاج النيوكليوتيدات عبر مساري التخليق الحيوي أو الإنقاذي لافتقارها إلى إنزيم HGPRT. يُعدّ التخلص من خلايا المايلوما غير المندمجة ضروريًا لقدرتها على التكاثر بشكل أسرع من الخلايا الأخرى، وخاصة الخلايا الهجينة ضعيفة التكوين. تموت الخلايا البائية غير المندمجة لقصر عمرها، وبذلك تبقى فقط خلايا المايلوما الهجينة مع الخلايا البائية، نظرًا لفعالية جين HGPRT المُستمد من الخلايا البائية. تُنتج هذه الخلايا الأجسام المضادة (وهي خاصية للخلايا البائية) وتتميز بالخلود (وهي خاصية لخلايا المايلوما). يُخفف الوسط المُحضن في أطباق متعددة الآبار بحيث يحتوي كل بئر على خلية واحدة فقط. بما أن الأجسام المضادة في البئر يتم إنتاجها بواسطة نفس الخلية البائية، فإنها ستكون موجهة نحو نفس الإبيتوب، وبالتالي فهي أجسام مضادة أحادية النسيلة.

تتمثل المرحلة التالية في عملية فحص أولية سريعة، تُحدد وتختار فقط الخلايا الهجينة التي تُنتج أجسامًا مضادة ذات خصوصية مناسبة. تُسمى تقنية الفحص الأولى المستخدمة اختبار ELISA . يتم بعد ذلك حضانة المادة الطافية لمزرعة الخلايا الهجينة، والمُقترن المُوسوم بالإنزيم الثانوي، والركيزة المُلونة، ويشير ظهور ناتج ملون إلى وجود خلية هجينة إيجابية. كبديل، يمكن استخدام تقنيات أخرى مثل الكيمياء المناعية الخلوية، [ 2 ] والتلطيخ الغربي ، وقياس الطيف الكتلي بالترسيب المناعي. على عكس اختبارات التلطيخ الغربي، يُسهل قياس الطيف الكتلي بالترسيب المناعي فحص وتصنيف المستنسخات التي ترتبط بالأشكال الأصلية (غير المُشوهة) لبروتينات المستضد. [ 3 ] وقد استُخدم فحص قياس التدفق الخلوي للفحص الأولي لعدد كبير (~1000) من مستنسخات الخلايا الهجينة التي تتعرف على الشكل الأصلي للمستضد على سطح الخلية. [ 4 ] في الفحص القائم على قياس التدفق الخلوي، يُستخدم مزيج من الخلايا السالبة للمستضد والخلايا الموجبة للمستضد كمستضد يتم اختباره لكل عينة من السائل الطافي للخلايا الهجينة. [ 4 ]

يمكن استنساخ الخلية البائية المنتجة للأجسام المضادة المطلوبة لإنتاج العديد من الخلايا الوليدة المتطابقة. وتُعدّ الأوساط التكميلية التي تحتوي على إنترلوكين-6 (مثل بريكلون ) ضرورية لهذه الخطوة. بمجرد تكوين مستعمرة الخلايا الهجينة، فإنها ستستمر في النمو في وسط زراعة مثل RPMI-1640 (مع المضادات الحيوية ومصل الجنين البقري) وتنتج الأجسام المضادة. [ 2 ]

تُستخدم صفائح متعددة الآبار في البداية لزراعة الخلايا الهجينة، وبعد الانتقاء، تُستبدل بقوارير زراعة أنسجة أكبر. يحافظ هذا على سلامة الخلايا الهجينة ويوفر كمية كافية من الخلايا للتجميد والسائل الطافي لإجراء دراسات لاحقة. يمكن أن ينتج السائل الطافي من المزرعة من 1 إلى 60  ميكروغرام/مل من الأجسام المضادة وحيدة النسيلة، والتي تُحفظ عند درجة حرارة -20  درجة مئوية أو أقل حتى الحاجة إليها. [ 2 ]

باستخدام المادة الطافية للمزرعة أو مستحضر الغلوبولين المناعي المنقى، يمكن إجراء المزيد من التحليلات على الخلايا الهجينة المنتجة للأجسام المضادة وحيدة النسيلة المحتملة من حيث التفاعل والنوعية والتفاعل المتبادل. [ 2 ]

التطبيقات

تتعدد استخدامات الأجسام المضادة وحيدة النسيلة، وتشمل الوقاية من الأمراض وتشخيصها وعلاجها. فعلى سبيل المثال، تستطيع هذه الأجسام التمييز بين مجموعات فرعية من الخلايا البائية والتائية ، مما يُساعد في تحديد أنواع مختلفة من سرطان الدم . إضافةً إلى ذلك، استُخدمت أجسام مضادة وحيدة النسيلة مُحددة لتحديد علامات سطح الخلية على خلايا الدم البيضاء وأنواع أخرى من الخلايا. وقد أدى ذلك إلى ظهور سلسلة علامات التمايز الخلوي، والتي تُعرف عادةً بعلامات CD، وتُحدد مئات المكونات المختلفة لسطح الخلية، حيث يرتبط كل مكون بجسم مضاد وحيد النسيلة مُحدد. وتُعد هذه الأجسام المضادة بالغة الأهمية في فرز الخلايا المُنشط بالفلورة ، وهو عملية عزل مُحددة لأنواع مُعينة من الخلايا.

في علم الأنسجة التشخيصي

بمساعدة الأجسام المضادة وحيدة النسيلة، يمكن تصنيف الأنسجة والأعضاء بناءً على تعبيرها عن مؤشرات محددة، تعكس نشأة الأنسجة أو الخلايا. يُعد كل من مستضد البروستات النوعي ، والفوسفاتاز القلوي المشيمي ، وموجهة الغدد التناسلية المشيمية البشرية ، وبروتين ألفا-فيتوبروتين ، وغيرها، من المستضدات المرتبطة بالأعضاء، ويساعد إنتاج الأجسام المضادة وحيدة النسيلة ضد هذه المستضدات في تحديد طبيعة الورم الأولي. [ 2 ]

تُعدّ الأجسام المضادة وحيدة النسيلة مفيدةً بشكلٍ خاص في التمييز بين الآفات المتشابهة شكليًا، مثل ورم الظهارة المتوسطة الجنبي والبريتوني ، والسرطان الغدي ، وفي تحديد منشأ العضو أو النسيج للنقائل غير المتمايزة . وتساعد أجسام مضادة وحيدة النسيلة مختارة في الكشف عن النقائل الخفية ( السرطان ذو المنشأ الأولي غير المعروف ) من خلال التحليل المناعي الخلوي لنخاع العظم، وعينات الأنسجة الأخرى، بالإضافة إلى العقد اللمفاوية والأنسجة الأخرى، وقد تتمتع بحساسية أعلى من التلوين النسيجي المرضي التقليدي . [ 2 ]

أجرت إحدى الدراسات [ 5 ] فحصًا مناعيًا نسيجيًا حساسًا على عينات نخاع العظم لعشرين مريضًا مصابًا بسرطان البروستاتا الموضعي. استُخدمت في هذا الفحص ثلاثة أجسام مضادة وحيدة النسيلة (T16، C26، وAE-1) قادرة على التعرف على مستضدات الغشاء والهيكل الخلوي التي تُعبر عنها الخلايا الظهارية للكشف عن الخلايا السرطانية. أظهرت عينات نخاع العظم لـ 22% من مرضى سرطان البروستاتا الموضعي (المرحلة B، 0/5؛ المرحلة C، 2/4)، و36% من مرضى سرطان البروستاتا النقيلي (المرحلة D1، 0/7؛ المرحلة D2، 4/4) وجود خلايا إيجابية للمستضد في نخاع العظم. وخلصت الدراسة إلى أن التلوين المناعي النسيجي لعينات نخاع العظم مفيد جدًا في الكشف عن النقائل الخفية في نخاع العظم لدى مرضى سرطان البروستاتا الموضعي ظاهريًا.

على الرغم من أن استخدام الأجسام المضادة وحيدة النسيلة المرتبطة بالأورام في الكيمياء المناعية الخلوية قد حسّن من القدرة على الكشف عن خلايا سرطان الثدي الخفية في نخاع العظم والدم المحيطي، إلا أن تطوير هذه الطريقة ضروري قبل استخدامها بشكل روتيني. [ 6 ] ومن أبرز عيوب الكيمياء المناعية الخلوية استخدام الأجسام المضادة وحيدة النسيلة المرتبطة بالأورام فقط، وليس تلك الخاصة بالورم، مما قد يؤدي إلى حدوث تفاعل متقاطع مع الخلايا الطبيعية. [ 7 ]

لتقييم فعالية بروتوكولات استئصال الخلايا السرطانية قبل حقن الخلايا الجذعية الذاتية، ولتحديد مرحلة سرطان الثدي بدقة، من الضروري الكشف حتى عن كميات ضئيلة من خلايا سرطان الثدي. تُعدّ الطرق المناعية النسيجية الكيميائية مثالية لهذا الغرض لبساطتها وحساسيتها ودقتها العالية. أجرى فرانكلين وزملاؤه [ 8 ] فحصًا مناعيًا خلويًا كيميائيًا عالي الحساسية باستخدام مزيج من أربعة أجسام مضادة وحيدة النسيلة (260F9، 520C9، 317G5، وBrE-3) ضد البروتينات السكرية الموجودة على سطح خلايا الورم، وذلك لتحديد خلايا سرطان الثدي في نخاع العظم والدم المحيطي. وخلصوا من النتائج إلى أن التلوين المناعي الخلوي لنخاع العظم والدم المحيطي طريقة حساسة وبسيطة للكشف عن خلايا سرطان الثدي وتحديد كميتها.

يُعدّ الانتشار المبكر للخلايا الخبيثة أحد الأسباب الرئيسية لانتكاس الأورام الصلبة. ويمكن استخدام الأجسام المضادة وحيدة النسيلة (mAbs) النوعية للسيتوكيراتينات لتحديد خلايا الورم الظهارية الفردية المنتشرة في نخاع العظم.

أشارت إحدى الدراسات [ 9 ] إلى تطوير إجراء مناعي خلوي لتحديد كل من مكون السيتوكيراتين رقم 18 (CK18) ومستضد البروستات النوعي (PSA) في آنٍ واحد. من شأن هذا الإجراء أن يُسهم في توصيف خلايا الورم الظهاري المنتشرة لدى مرضى سرطان البروستات. وقد أظهرت عينات التحكم الاثنتي عشرة المأخوذة من مرضى تضخم البروستات الحميد نتائج سلبية، مما يدعم خصوصية CK18 في الكشف عن خلايا الورم الظهاري في نخاع العظم.

في معظم حالات الأمراض الخبيثة المصحوبة بانصباب، يمكن التعرف على الخلايا السرطانية بسهولة. مع ذلك، في بعض الحالات، يصعب رؤية الخلايا الخبيثة أو يكون وجودها موضع شك كبير بحيث لا يمكن اعتباره نتيجة إيجابية. استخدام تقنيات الكيمياء المناعية الخلوية يزيد من دقة التشخيص في هذه الحالات.

قام غوش، ماسون، وسبريجز [ 10 ] بتحليل 53 عينة من السائل الجنبي أو البريتوني لـ 41 مريضًا مصابًا بأمراض خبيثة. لم يكشف الفحص الخلوي التقليدي عن أي خلايا ورمية. استُخدمت ثلاثة أجسام مضادة وحيدة النسيلة (مضاد CEA، وCa 1، وHMFG-2) للبحث عن الخلايا الخبيثة. أُجري التلوين المناعي الخلوي على مسحات غير ملونة، تم تخزينها عند درجة حرارة -20  درجة مئوية لمدة تصل إلى 18 شهرًا. كشفت 12 حالة من أصل 41 حالة خضعت للتلوين المناعي الخلوي عن وجود خلايا خبيثة. مثّلت هذه النتيجة زيادة في دقة التشخيص بنسبة 20% تقريبًا. خلصت الدراسة إلى أنه في المرضى المشتبه بإصابتهم بأمراض خبيثة، ينبغي استخدام التلوين المناعي الخلوي بشكل روتيني في فحص العينات السلبية في الفحص الخلوي، وله آثار مهمة فيما يتعلق بإدارة حالة المريض.

يُستخدم التلوين المناعي الخلوي أيضاً للكشف عن مستضدين في نفس المسحة. ويمكن أن يشير التلوين المزدوج باستخدام الأجسام المضادة للسلسلة الخفيفة وعلامات الخلايا التائية والبائية إلى الأصل الورمي للورم الليمفاوي. [ 11 ]

أشارت إحدى الدراسات إلى عزل سلالة من خلايا الهيبريدوما (النسيلة 1E10)، التي تنتج جسمًا مضادًا أحادي النسيلة (IgM، النمط الفرعي k). يُظهر هذا الجسم المضاد أحادي النسيلة تلوينًا مناعيًا خلويًا نوعيًا للنويات. [ 12 ]

يمكن تصنيف الأنسجة والأورام بناءً على تعبيرها عن مؤشرات معينة، وذلك بمساعدة الأجسام المضادة وحيدة النسيلة. تُساعد هذه الأجسام المضادة في تمييز الآفات المتشابهة شكليًا، وفي تحديد العضو أو النسيج الذي نشأت منه النقائل غير المتمايزة. يُساعد التحليل المناعي الخلوي لنخاع العظم، وعينات الأنسجة، والعقد اللمفاوية، وغيرها، باستخدام أجسام مضادة وحيدة النسيلة مُختارة، في الكشف عن النقائل الخفية. تزيد الأجسام المضادة وحيدة النسيلة من حساسية الكشف حتى عن كميات ضئيلة من الخلايا الغازية أو النقيلية. كما يُمكن للأجسام المضادة وحيدة النسيلة المُخصصة للسيتوكيراتينات الكشف عن خلايا الورم الظهاري الفردية المنتشرة في نخاع العظم.

مراجع

  1. ↑ ميلستين، سي (1999). "ثورة الهيبريدوما: نتاج البحث الأساسي". مقالات بيولوجية . 21 (11): 966-73 . doi : 10.1002/(SICI)1521-1878(199911)21:11 < 966::AID-BIES9 > 3.0.CO ; 2-Z . PMID 10517870 . 
  2. 1 2 3 4 5 6 نيلسون، بي إن؛ رينولدز، جي إم؛ والدرون، إي إي؛ وارد، إي؛ جيانوبولوس، كيه؛ موراي، بي جي (2000). "تبسيط ...: الأجسام المضادة وحيدة النسيلة" . علم الأمراض الجزيئي . 53 (3): 111-117 . doi : 10.1136/mp.53.3.111 . PMC 1186915. PMID 10897328 .  
  3. ↑ كورباكيس، د؛ برينك، د؛ شيزا، س؛ سوسايبيللاي، أ؛ جارفي، ك؛ درابوفيتش، أ.ب؛ ديامانديس، إ (2015). "يسهل فحص مراقبة التفاعل الانتقائي بالتقاط المناعي تطوير اختبار ELISA لقياس TEX101 الأصلي في السوائل البيولوجية" . علم البروتينات الجزيئي والخلوي . 14 (6): 1517-1526 . doi : 10.1074/mcp.M114.047571 . PMC 4458717. PMID 25813379 .  
  4. 1 2 فونغ، ين؛ غاو، وي؛ مان، يان-غاو؛ ناغاتا، ساتوشي؛ هو، ميتشل (سبتمبر 2012). "أجسام مضادة وحيدة النسيلة عالية الألفة لمستضد الورم جليبيكان-3 على سطح الخلية، تم إنتاجها من خلال الجمع بين التحصين بالببتيد وفحص التدفق الخلوي" . mAbs . 4 ( 5): 592-599 . doi : 10.4161/mabs.20933 . ISSN 1942-0870 . PMC 3499300. PMID 22820551 .   
  5. ↑ بريتون، بي آر؛ ميلاميد، إم آر؛ فير، دبليو آر؛ كوت، آر جيه (1994). "الكشف عن النقائل المجهرية الخفية في نخاع عظم مرضى سرطان البروستاتا". البروستاتا . 25 ( 2): 108-114 . doi : 10.1002/pros.2990250208 . PMID 7518596. S2CID 32801503 .  
  6. ↑ كفالهايم، ج (1996). "الكشف عن الخلايا السرطانية الخفية في نخاع العظم والدم لدى مريضات سرطان الثدي - الطرق والأهمية السريرية" . مجلة أكت أونكول . 35 : 13-18 . doi : 10.3109/02841869609098516 . PMID 9073044 . 
  7. ↑ كفالهايم، ج. (1998). "تشخيص الحد الأدنى من المرض المتبقي في نخاع العظم والدم لدى مرضى السرطان - الأساليب والآثار السريرية" . مجلة أونكولوجيكا . 37 (5): 455-462 . doi : 10.1080/028418698430403 . PMID 9831374 . 
  8. ↑ فرانكلين، واشنطن؛ شبول، إي جيه؛ آرتشر، بي؛ جونستون، سي إس؛ غارزا-ويليامز، إس؛ حامي، إل؛ بيتر، إم إيه؛ باست، آر سي؛ جونز، آر بي (1996). "الكشف المناعي الخلوي عن خلايا سرطان الثدي في نخاع العظم والدم المحيطي للمرضى الذين يخضعون للعلاج الكيميائي بجرعات عالية مع دعم الخلايا الجذعية الذاتية". أبحاث وعلاج سرطان الثدي . 41 (1): 1-13 . doi : 10.1007/BF01807031 . PMID 8932871. S2CID 37415751 .  
  9. ↑ ريزنبرغ، ر؛ أوبرنيدر، ر؛ كريغماير، م؛ إيب، م؛ بيتزر، يو؛ هوفستيتر، أ؛ براون، س؛ ريثمولر، ج؛ بانتيل، ك (1993). "التلوين المناعي المزدوج للخلايا الكيراتينية ومستضد البروستات النوعي في خلايا ورم البروستات الفردية". علم الأنسجة . 99 (1): 61-66 . doi : 10.1007/BF00268022 . PMID 7682210. S2CID 8007388 .  
  10. ↑ غوش، أ.ك.؛ ماسون، د.ي.؛ سبريجز، أ.إ. (1983). "التلوين المناعي الخلوي باستخدام الأجسام المضادة وحيدة النسيلة في الانصبابات المصلية "السلبية" خلوياً من مرضى مصابين بأمراض خبيثة" . مجلة علم الأمراض السريرية . 36 (10): 1150-1153 . doi : 10.1136/jcp.36.10.1150 . PMC 498493. PMID 6194182 .  
  11. ↑ غوش، أ.ك.؛ سبريجز، أ.إ.؛ تايلور-باباديميتريو، ج .؛ ماسون، د.ي. (1983). "التلوين المناعي الخلوي للخلايا في الانصبابات الجنبيّة والبريتونيّة باستخدام مجموعة من الأجسام المضادة وحيدة النسيلة" . مجلة علم الأمراض السريري . 36 (10): 1154-1164 . doi : 10.1136/jcp.36.10.1154 . PMC 498494. PMID 6194183 .  
  12. ↑ فيسيرز، سي جيه؛ فلوهيل، سي سي؛ دي جونغ، إيه إيه؛ دينجينز، دبليو إن؛ بوسمان، إف تي (1996). "جسم مضاد أحادي النسيلة جديد للتلوين المناعي الخلوي النوعي للنويات". أكتا هيستوكيميكا . 98 (2): 113-21 . doi : 10.1016/S0065-1281(96)80028-6 . PMID 8739296 .