فحص التفاعل الثنائي

📅 آخر تحديث: ٢٧ يوليو ٢٠٢٦
✍️ نُشر في: ٢٧ يوليو ٢٠٢٦
📷 يحتوي على 2 صور
الموسوعة الحرة

نظرة عامة على اختبار التفاعل الثنائي، الذي يتحقق من التفاعلات بين بروتينين، يُطلق عليهما هنا اسم الطعم والفريسة . أ . يُنتج جين عامل النسخ Gal4 بروتينًا ثنائي النطاق ( BD و AD ) ضروريًا لنسخ جين المُخبِر ( LacZ ). ب ، ج . يتم تحضير بروتينين اندماجيين: Gal4BD+Bait و Gal4AD+Prey . لا يكفي أي منهما عادةً لبدء عملية النسخ (لجين المُخبِر) بمفرده. د . عند إنتاج كلا البروتينين الاندماجيين وتفاعل جزء الطعم من البروتين الاندماجي الأول مع جزء الفريسة من البروتين الاندماجي الثاني، يحدث نسخ جين المُخبِر.

يُعد فحص التفاعل الثنائي (المعروف أصلاً باسم نظام التفاعل الثنائي للخميرة أو Y2H ) تقنية بيولوجية جزيئية تستخدم لاكتشاف التفاعلات بين البروتين والبروتين (PPIs) [ 1 ] والتفاعلات بين البروتين والحمض النووي [ 2 ] [ 3 ] عن طريق اختبار التفاعلات الفيزيائية (مثل الارتباط) بين بروتينين أو بروتين واحد وجزيء الحمض النووي ، على التوالي.

تعتمد فرضية هذا الاختبار على تنشيط جين (أو جينات) مُبلِّغة تقع في اتجاه المصب، وذلك عن طريق ارتباط عامل النسخ بتسلسل تنشيط يقع في اتجاه المنبع (UAS). في فحص التفاعل الثنائي، يُقسَّم عامل النسخ إلى جزأين منفصلين، يُطلق عليهما نطاق ارتباط الحمض النووي (DBD أو يُختصر غالبًا إلى BD) ونطاق التنشيط (AD). يُعدّ نطاق ارتباط الحمض النووي (BD) مسؤولًا عن الارتباط بتسلسل التنشيط (UAS)، بينما يُعدّ نطاق التنشيط (AD) مسؤولًا عن تنشيط عملية النسخ . [ 1 ] [ 2 ] وبالتالي، يُعتبر اختبار التفاعل الثنائي (Y2H) اختبارًا لتكامل أجزاء البروتين .

تاريخ

ابتكر ستانلي فيلدز وأوك-كيو سونغ هذه التقنية عام 1989، وصُممت في الأصل للكشف عن تفاعلات البروتين-بروتين باستخدام مُنشِّط النسخ Gal4 في خميرة Saccharomyces cerevisiae . وقد نشّط بروتين Gal4 نسخ جين مُشارك في استهلاك الجلاكتوز، وهو ما شكّل أساس عملية الانتقاء. [ 4 ] ومنذ ذلك الحين، تم تكييف المبدأ نفسه لوصف العديد من الطرق البديلة، بما في ذلك بعض الطرق التي تكشف عن تفاعلات البروتين-DNA أو تفاعلات DNA-DNA ، بالإضافة إلى طرق تستخدم كائنات مضيفة مختلفة مثل الإشريكية القولونية أو خلايا الثدييات بدلاً من الخميرة. [ 3 ] [ 5 ]

الفرضية الأساسية

يكمن سرّ تقنية الفحص الثنائي الهجين في أن نطاقي التنشيط والارتباط في معظم عوامل النسخ حقيقية النواة يكونان معياريين، ويمكنهما العمل بالقرب من بعضهما البعض دون ارتباط مباشر. [ 6 ] وهذا يعني أنه حتى لو انقسم عامل النسخ إلى جزأين، فإنه لا يزال بإمكانه تنشيط عملية النسخ عندما يكون الجزآن متصلين بشكل غير مباشر.

يُعدّ اختبار التفاعل الثنائي للخميرة أكثر أساليب الفحص شيوعًا. في هذا الأسلوب، يعرف الباحث موقع كل فريسة على الوسط المستخدم (أطباق الآجار). وقد تم فحص ملايين التفاعلات المحتملة في العديد من الكائنات الحية خلال العقد الماضي باستخدام أنظمة الفحص عالية الإنتاجية (غالبًا باستخدام الروبوتات)، وتم رصد آلاف التفاعلات وتصنيفها في قواعد بيانات BioGRID . [ 7 ] [ 8 ] غالبًا ما يستخدم هذا النظام سلالة خميرة مُعدّلة وراثيًا تفتقر إلى التخليق الحيوي لبعض العناصر الغذائية (عادةً الأحماض الأمينية أو الأحماض النووية ). عند زراعتها في أوساط تفتقر إلى هذه العناصر الغذائية، لا تستطيع الخميرة البقاء. يمكن تعديل سلالة الخميرة الطافرة هذه لدمج الحمض النووي الغريب على شكل بلازميدات . في فحص التفاعل الثنائي للخميرة، يتم إدخال بلازميدات الطعم والفريسة بشكل منفصل في سلالة الخميرة الطافرة في وقت واحد، أو تُستخدم استراتيجية تزاوج لإدخال كلا البلازميدين في خلية مضيفة واحدة. [ 9 ]

النهج الثاني عالي الإنتاجية هو نهج فحص المكتبة. في هذا النهج، تُزاوج الخلايا الحاملة للطُعم والفريسة بترتيب عشوائي. بعد التزاوج واختيار الخلايا الباقية على وسط انتقائي، يقوم الباحث بتسلسل البلازميدات المعزولة لمعرفة أي فريسة (تسلسل الحمض النووي) تتفاعل مع الطُعم المستخدم. يتميز هذا النهج بانخفاض معدل التكرارية، ويميل إلى إنتاج كميات أكبر من النتائج الإيجابية الكاذبة مقارنةً بنهج المصفوفة. [ 9 ]

تُصمَّم البلازميدات لإنتاج بروتين مُدمج فيه نطاق ربط الحمض النووي (BD) مع بروتين آخر، بينما يُصمَّم بلازميد آخر لإنتاج بروتين مُدمج فيه نطاق التنشيط (AD) مع بروتين آخر. يُشار إلى البروتين المُدمج مع نطاق ربط الحمض النووي (BD) باسم بروتين الطعم، وهو عادةً بروتين معروف يستخدمه الباحث لتحديد شركاء ربط جدد. أما البروتين المُدمج مع نطاق التنشيط (AD) فيُشار إليه باسم بروتين الفريسة، وقد يكون بروتينًا واحدًا معروفًا أو مجموعة من البروتينات المعروفة أو غير المعروفة. في هذا السياق، قد تتكون المجموعة من تسلسلات ترميز البروتين التي تُمثل جميع البروتينات المُعبَّر عنها في كائن حي أو نسيج معين، أو قد تُنشأ عن طريق تركيب تسلسلات عشوائية من الحمض النووي. [ 3 ] وبغض النظر عن المصدر، تُدمج هذه التسلسلات لاحقًا في تسلسل ترميز البروتين للبلازميد، الذي يُنقل بعد ذلك إلى الخلايا المختارة لطريقة الفحص. [ 3 ] تفترض هذه التقنية، عند استخدام مكتبة، أن كل خلية يتم نقلها بما لا يزيد عن بلازميد واحد، وبالتالي فإن كل خلية في النهاية لا تعبر عن أكثر من عضو واحد من مكتبة البروتين.

إذا تفاعلت بروتينات الطعم والفريسة (أي ارتبطت)، فإن نطاقي التنشيط (AD) والربط (BD) لعامل النسخ يرتبطان بشكل غير مباشر، مما يجعل نطاق التنشيط قريبًا من موقع بدء النسخ، وبالتالي يمكن أن يحدث نسخ جين (جينات) المُخبِر. أما إذا لم يتفاعل البروتينان، فلن يحدث نسخ لجين المُخبِر. وبهذه الطريقة، يرتبط التفاعل الناجح بين البروتينين المندمجين بتغير في النمط الظاهري للخلية. [ 1 ]

يتم تناول التحدي المتمثل في فصل الخلايا التي تعبر عن البروتينات التي تتفاعل مع بروتينات الاندماج المقابلة لها عن تلك التي لا تفعل ذلك في القسم التالي.

نطاقات ثابتة

في أي دراسة، يتم تغيير بعض نطاقات البروتين، وهي النطاقات قيد الدراسة، وفقًا لأهداف الدراسة، بينما تبقى نطاقات أخرى، وهي النطاقات غير قيد الدراسة، ثابتة. على سبيل المثال، في دراسة التفاعل الثنائي لاختيار نطاقات ربط الحمض النووي، يتم تغيير نطاق ربط الحمض النووي (BD)، بينما يجب الحفاظ على ثبات البروتينين المتفاعلين، وهما الطعم والفريسة، لضمان ارتباط قوي بين نطاق ربط الحمض النووي (BD) ونطاق ربط الحمض النووي (AD). يوجد عدد من النطاقات التي يمكن اختيار نطاق ربط الحمض النووي (BD) والطعم والفريسة ونطاق ربط الحمض النووي (AD) منها، إذا ما أُريد لهذه النطاقات أن تبقى ثابتة. في دراسات تفاعل البروتين-بروتين، يمكن اختيار نطاق ربط الحمض النووي (BD) من بين العديد من نطاقات ربط الحمض النووي القوية، مثل Zif268 . [ 2 ] ومن الخيارات الشائعة لنطاقي الطعم والفريسة، البقايا من 263 إلى 352 من بروتين Gal11P في الخميرة مع طفرة N342V [ 2 ] والبقايا من 58 إلى 97 من بروتين Gal4 في الخميرة [ 2 ]، على التوالي. يمكن استخدام هذه المجالات في تقنيات الانتقاء القائمة على الخميرة والبكتيريا على حد سواء، ومن المعروف أنها ترتبط ببعضها البعض بقوة. [ 1 ] [ 2 ]

يجب أن يكون الإنزيم المُختار قادرًا على تنشيط نسخ الجين المُبلِّغ، باستخدام آلية النسخ الخلوية الخاصة. لذا، قد لا تكون أنواع الإنزيمات المتاحة للاستخدام في التقنيات القائمة على الخميرة مناسبة للاستخدام في نظائرها البكتيرية. وقد استُخدم الإنزيم VP16 المُشتق من فيروس الهربس البسيط، وإنزيم Gal4 المُشتق من الخميرة بنجاح في الخميرة [ 1 ]، بينما استُخدم جزء من الوحدة الفرعية ألفا من بوليميراز الحمض النووي الريبي في الإشريكية القولونية في الطرق القائمة على الإشريكية القولونية [ 2 ] [ 3 ] .

في حين أن المجالات المنشطة بقوة قد تسمح بحساسية أكبر تجاه التفاعلات الأضعف، على العكس من ذلك، قد يوفر مجال التنشيط الأضعف صرامة أكبر.

بناء بلازميدات التعبير

يتطلب إجراء تحليل التفاعل الثنائي أو إحدى التقنيات المشتقة منه دمج عدد من التسلسلات الجينية المُهندسة في الخلية المضيفة. وتختلف الاعتبارات والأساليب المستخدمة في بناء هذه التسلسلات وإيصالها تبعًا لاحتياجات التحليل والكائن الحي المُختار كخلفية تجريبية.

توجد فئتان رئيسيتان من المكتبات الهجينة: المكتبات العشوائية والمكتبات القائمة على الحمض النووي المكمل (cDNA). تتكون مكتبة الحمض النووي المكمل من الحمض النووي المكمل الناتج عن النسخ العكسي للحمض النووي الريبوزي الرسول (mRNA) المستخلص من خلايا محددة. يمكن ربط هذه المكتبة ببنية جينية بحيث ترتبط بمنطقة الارتباط (BD) أو منطقة الارتباط (AD) المستخدمة في التحليل. [ 1 ] أما المكتبة العشوائية فتستخدم أجزاءً من الحمض النووي ذات تسلسل عشوائي بدلاً من أجزاء الحمض النووي المكمل. توجد عدة طرق لإنتاج هذه التسلسلات العشوائية، بما في ذلك الطفرات الموجهة باستخدام الكاسيت . [ 2 ] وبغض النظر عن مصدر مكتبة الحمض النووي، يتم ربطها في المكان المناسب في البلازميد/الباجميد ذي الصلة باستخدام إنزيمات القطع المناسبة . [ 2 ]

اعتبارات خاصة ببكتيريا الإشريكية القولونية

بوضع البروتينات الهجينة تحت سيطرة محفزات اللاكتوز القابلة للتحفيز بواسطة IPTG ، يتم التعبير عنها فقط في أوساط مُدعّمة بـ IPTG. علاوة على ذلك، من خلال تضمين جينات مقاومة مختلفة للمضادات الحيوية في كل بنية جينية، يُمكن منع نمو الخلايا غير المُحوّلة بسهولة عن طريق زراعتها في أوساط تحتوي على المضادات الحيوية المناسبة. يُعد هذا الأمر بالغ الأهمية لأساليب الانتقاء المضاد التي تتطلب غياب التفاعل لبقاء الخلية. [ 2 ]

يمكن إدخال جين المراسل في جينوم الإشريكية القولونية عن طريق إدخاله أولاً في إبيسوم ، وهو نوع من البلازميدات لديه القدرة على الاندماج في جينوم الخلية البكتيرية [ 2 ] بعدد نسخ يبلغ حوالي نسخة واحدة لكل خلية. [ 10 ]

يمكن إدخال البلازميدات الفيروسية الهجينة المُعبِّرة إلى خلايا الإشريكية القولونية XL-1 الزرقاء باستخدام تقنية التحويل الكهربائي، والتي بعد تضخيمها وإصابتها ببلازميد VCS-M13 المساعد ، ستُنتج مخزونًا من مكتبة البلازميدات الفيروسية. تحتوي كل من هذه البلازميدات الفيروسية على جزيء واحد أحادي السلسلة من مكتبة البلازميدات الفيروسية. [ 2 ]

استعادة معلومات البروتين

بعد إجراء عملية الاختيار، يجب تحديد البنية الأولية للبروتينات التي تُظهر الخصائص المناسبة. ويتم ذلك عن طريق استرجاع تسلسلات ترميز البروتين (كما تم إدخالها أصلاً) من الخلايا التي تُظهر النمط الظاهري المناسب.

الإشريكية القولونية

يمكن "استعادة" الفاجيميد المستخدم لتحويل خلايا الإشريكية القولونية من الخلايا المختارة عن طريق إصابتها بفاجي مساعد من نوع VCS-M13. تحتوي جزيئات الفاجي الناتجة على فاجيميدات أحادية السلسلة، وتُستخدم لإصابة خلايا XL-1 الزرقاء. [ 2 ] تُجمع الفاجيميدات ثنائية السلسلة لاحقًا من خلايا XL-1 الزرقاء هذه، مما يعكس العملية المستخدمة لإنتاج مكتبة الفاجيات الأصلية. أخيرًا، تُحدد تسلسلات الحمض النووي من خلال تسلسل ثنائي الديوكسي . [ 2 ]

التحكم في الحساسية

يمكن استخدام مثبط Tet-R المشتق من الإشريكية القولونية بالتزامن مع جين مراسل تقليدي، ويمكن التحكم به بواسطة التتراسيكلين أو الدوكسيسيكلين (مثبطات Tet-R). وبالتالي، يتم التحكم في التعبير عن Tet-R بواسطة نظام التفاعل الثنائي القياسي، ولكن Tet-R بدوره يتحكم (يثبط) في التعبير عن جين مراسل مذكور سابقًا مثل HIS3 ، من خلال محفز Tet-R الخاص به. ويمكن بعد ذلك استخدام التتراسيكلين أو مشتقاته لتنظيم حساسية النظام الذي يستخدم Tet-R. [ 1 ]

يمكن أيضًا التحكم في الحساسية عن طريق تغيير اعتماد الخلايا على جيناتها المُبلِّغة. على سبيل المثال، يمكن التأثير على ذلك بتغيير تركيز الهيستيدين في وسط النمو للخلايا المعتمدة على جين his3، وتغيير تركيز الستربتومايسين للخلايا المعتمدة على جين aadA . [ 2 ] [ 3 ] كما يمكن التحكم في اعتماد الخلايا على جينات الاختيار عن طريق استخدام مُثبِّط لهذا الجين بتركيز مناسب. على سبيل المثال، يُعدّ 3-أمينو-1،2،4-تريازول (3-AT) مُثبِّطًا تنافسيًا لمنتج جين HIS3 ، ويمكن استخدامه لمعايرة الحد الأدنى من مستوى التعبير عن جين HIS3 اللازم للنمو في أوساط تفتقر إلى الهيستيدين. [ 2 ]

يمكن أيضًا تعديل الحساسية عن طريق تغيير عدد تسلسلات المشغل في الحمض النووي المُبلغ.

البروتينات غير الاندماجية

قد يُعبَّر عن بروتين ثالث غير مُدمج بالتزامن مع بروتينين مُدمجين. وبحسب الدراسة، قد يُعدِّل البروتين الثالث أحد البروتينين المُدمجين أو يُوسِّط تفاعلهما أو يُعيقه. [ 1 ]

قد يكون التعبير المشترك للبروتين الثالث ضروريًا لتعديل أو تنشيط أحد البروتينين المدمجين أو كليهما. على سبيل المثال، لا تمتلك الخميرة S. cerevisiae كيناز تيروسين داخليًا . إذا تضمنت الدراسة بروتينًا يتطلب فسفرة التيروسين ، فيجب توفير الكيناز على شكل جين كيناز تيروسين. [ 1 ]

قد يتوسط البروتين غير المندمج التفاعل عن طريق الارتباط بكلا البروتينين المندمجين في وقت واحد، كما هو الحال في عملية ازدواج المستقبلات المعتمدة على الربيطة. [ 1 ]

بالنسبة لبروتين له شريك متفاعل، يمكن تقييم تشابهه الوظيفي مع بروتينات أخرى بتوفير البروتين الثالث في صورة غير اندماجية، والذي قد يتنافس أو لا يتنافس مع البروتين الاندماجي على شريكه الرابط. سيؤدي ارتباط البروتين الثالث بالبروتين الاندماجي الآخر إلى تعطيل تكوين مركب تنشيط التعبير عن الجين المراسل، وبالتالي تقليل التعبير عنه، مما يؤدي إلى التغيير المميز في النمط الظاهري. [ 1 ]

نظام الخميرة ثنائي الهجين لليوبيكويتين المنقسم

من عيوب تقنية التفاعل الثنائي التقليدية في الخميرة أنها تقتصر على البروتينات الذائبة، مما يجعل من المستحيل استخدامها لدراسة التفاعلات بين البروتينات الغشائية المتكاملة غير الذائبة . يوفر نظام اليوبيكويتين المنقسم طريقةً للتغلب على هذا القيد. [ 11 ] في هذا النظام، يُدمج بروتينان غشائيان متكاملان للدراسة مع جزأين مختلفين من اليوبيكويتين : جزء طرفي كربوكسيلي ("Cub"، من البقايا 35 إلى 76) وجزء طرفي أميني ("Nub"، من البقايا 1 إلى 34). يُطلق على هذين البروتينين المدمجين اسمي الطعم والفريسة، على التوالي. إضافةً إلى اندماجه مع بروتين غشائي متكامل، يُدمج جزء Cub أيضًا مع عامل نسخ (TF) يمكن فصله بواسطة بروتيازات متخصصة باليوبيكويتين . عند تفاعل الطعم والفريسة، تتجمع أجزاء Nub وCub، مُعيدَةً تكوين اليوبيكويتين المُجزأ. يتم التعرف على جزيء اليوبيكويتين المُجزأ المُعاد تكوينه بواسطة بروتيازات مُخصصة لليوبيكويتين، والتي تفصل عامل النسخ، مما يسمح له بتحفيز نسخ الجينات المُبلغة . [ 12 ]

اختبار التهجين الثنائي الفلوري

قدّم زولغادر وزملاؤه نظامًا هجينًا ثنائيًا فلوريًا يستخدم بروتينين هجينين ملتحمين ببروتينات فلورية مختلفة، بالإضافة إلى LacI، وهو مثبط اللاكتوز . يبدو تركيب البروتينات المدمجة كالتالي: FP2-LacI-bait وFP1-prey، حيث يتفاعل بروتينا الطعم والفريسة، ويجذبان البروتينات الفلورية (FP1 = GFP ، FP2 = mCherry ) إلى موقع ارتباط بروتين LacI في جينوم الخلية المضيفة. [ 13 ] يمكن أيضًا استخدام هذا النظام لفحص مثبطات تفاعلات البروتين-بروتين. [ 14 ]

أنظمة التفاعل الثنائي الإنزيمي: KISS

بينما استخدم نظام Y2H الأصلي عامل نسخ مُعاد تكوينه، تُنشئ أنظمة أخرى أنشطة إنزيمية للكشف عن تفاعلات البروتين-بروتين. على سبيل المثال، يُعد مستشعر ركيزة الكيناز ("KISS") نهجًا ثنائيًا هجينًا في الثدييات، وقد صُمم لرسم خرائط تفاعلات البروتين-بروتين داخل الخلايا. في هذا النهج، يُدمج بروتين طُعم مع جزء يحتوي على كيناز من TYK2 ، بينما يُربط بروتين فريسة بجزء من مستقبل السيتوكين gp130 . عند تفاعل الطُعم والفريسة، يُفسفر TYK2 مواقع ارتباط STAT3 على بروتين الفريسة الهجين، مما يؤدي في النهاية إلى تنشيط جين مُبلغ . [ 15 ]

الفحص الثنائي الهجين عن طريق التسلسل

طُوِّرت عدة استراتيجيات لتحديد النتائج الإيجابية في اختبار التفاعل الثنائي للجينات عن طريق تسلسل الحمض النووي ، عادةً بعد الانتقاء باستخدام جين مُخبِر . وقد وُصِفَ أحد أشكال هذا النهج مؤخرًا باسم Liquid Y2H-Seq . [ 16 ] بعد أن أثبت ستانلي فيلدز وزملاؤه إمكانية استخدام فحوصات تنشيط النسخ للكشف عن تفاعلات البروتين-بروتين وفحص المكتبات بحثًا عن شركاء ارتباط جدد، ترسخت الفائدة العملية لهذه الطريقة سريعًا. في عام 1993، أجرى فويتك وآخرون أول فحص ناجح للتفاعل الثنائي للجينات لتحديد تفاعل جديد، واكتشفوا أن بروتين Ras GTPase يرتبط فعليًا ببروتين RAF kinase، وهو بروتين معروف سابقًا بوظيفته الجينية في مسار إشارات Ras. [ 17 ] وشهدت جامعة جونز هوبكنز إنجازًا هامًا آخر ، حيث حدد أنطون يوريف عائلتين بروتينيتين جديدتين تتفاعلان مع النطاق الطرفي الكربوكسيلي (CTD) لإنزيم بوليميراز الحمض النووي الريبي II. تميزت هذه العائلات بنطاقات تفاعلية متماثلة للغاية مع نطاقات CTD (CIDs)، مما قدم دليلاً بنيوياً على الأهمية الوظيفية لهذه التفاعلات. ولأن هذه البروتينات أظهرت أيضاً تشابهاً مع عوامل التضفير المعروفة، فقد أشار هذا الاكتشاف إلى أن نطاق CTD يعمل على الربط المادي بين نسخ الجينات ومعالجة mRNA في حقيقيات النوى. وفي وقت لاحق، وسّع يوريف المنهجية باقتراح تقنية لتحديد التفاعلات الوظيفية من خلال اختيار شركاء ارتباط خاصين بكل نظير، وقد تم توضيح ذلك باستخدام النظائر الثلاثة لكيناز RAF. [ 18 ]

المتغيرات الهجينة أحادية وثلاثية وثنائية

هجين واحد

صُممت النسخة الهجينة الأحادية من هذه التقنية لدراسة تفاعلات البروتين مع الحمض النووي ، وتستخدم بروتينًا اندماجيًا واحدًا يرتبط فيه نطاق التنشيط (AD) مباشرةً بنطاق الارتباط. يمكن تكوين نطاق الارتباط من مكتبة، وبالتالي يمكن اختيار البروتينات التي ترتبط بتسلسل مستهدف مرغوب (يُدرج في منطقة المحفز لجين مُبلغ). في نظام الاختيار الإيجابي، يتم اختيار نطاق الارتباط الذي يرتبط بنجاح بتسلسل التنشيط (UAS) ويسمح بالنسخ. [ 1 ]

تجدر الإشارة إلى أن اختيار نطاقات ربط الحمض النووي لا يتم بالضرورة باستخدام نظام هجين أحادي، بل يمكن إجراؤه أيضاً باستخدام نظام هجين ثنائي حيث يتم تغيير نطاق الربط مع الحفاظ على ثبات بروتينات الطعم والفريسة. [ 2 ] [ 3 ]

يمكن استخدام تقنية الفحص أحادي الهجين لدراسة خصائص تنشيط النسخ للبروتينات. وقد تم ذلك في فحص واسع النطاق لبروتينات الخميرة المدمجة مع نطاق ربط الحمض النووي ، حيث قام البروتين المدمج بتنشيط نسخ جين مُخبِر . وكشف هذا الفحص عن 451 مُنشِّطًا للنسخ في الخميرة، من بينها 132 مُنشِّطًا قويًا. [ 19 ]

ثلاثي الهجين

نظرة عامة على اختبار التفاعل الثلاثي.

تمّت دراسة تفاعلات الحمض النووي الريبي مع البروتينات باستخدام تقنية التهجين الثلاثي، وهي نسخة معدّلة من تقنية التهجين الثنائي. في هذه الحالة، يعمل جزيء الحمض النووي الريبي الهجين على ربط نطاقي اندماج البروتينين معًا، واللذين لا يُفترض بهما التفاعل مع بعضهما البعض، بل مع جزيء الحمض النووي الريبي الوسيط (عبر نطاقاتهما الرابطة للحمض النووي الريبي). [ 1 ] ويمكن أيضًا الإشارة إلى التقنيات التي تتضمن بروتينات غير اندماجية تؤدي وظيفة مماثلة، كما هو موضح في قسم "البروتينات غير الاندماجية" أعلاه، باسم طرق التهجين الثلاثي.

هجين واحد-اثنان

يُعرف الاستخدام المتزامن لطريقتي التفاعل الأحادي والثنائي (أي التفاعل المتزامن بين البروتين والبروتين والبروتين والحمض النووي) باسم نهج التفاعل الأحادي الثنائي، ومن المتوقع أن يزيد من دقة الفحص. [ 1 ]

الكائن المضيف

على الرغم من أنه من الناحية النظرية، يمكن استخدام أي خلية حية كخلفية لتحليل التفاعل الثنائي، إلا أن هناك اعتبارات عملية تحدد اختيار الخلية المناسبة. يجب أن يكون خط الخلية المختار رخيصًا نسبيًا وسهل الاستزراع، وأن يتمتع بقوة كافية لتحمل تطبيق أساليب البحث والكواشف. [ 1 ] ويُعد هذا الأخير بالغ الأهمية لإجراء دراسات عالية الإنتاجية . لذلك، تُعتبر خميرة Saccharomyces cerevisiae الكائن المضيف الرئيسي لدراسات التفاعل الثنائي. مع ذلك، فهي ليست دائمًا النظام الأمثل لدراسة البروتينات المتفاعلة من كائنات حية أخرى. [ 20 ] غالبًا ما تفتقر خلايا الخميرة إلى نفس التعديلات اللاحقة للترجمة، أو تستخدم كودونات مختلفة، أو تفتقر إلى بعض البروتينات المهمة للتعبير الصحيح عن البروتينات. ولمعالجة هذه المشكلات، تم تطوير العديد من أنظمة التفاعل الثنائي الحديثة. اعتمادًا على النظام المستخدم، تُستخدم أطباق الآجار أو وسط نمو محدد لزراعة الخلايا والسماح بانتقاء التفاعل. الطريقة الأكثر شيوعًا هي طريقة زراعة الآجار، حيث تُزرع الخلايا على وسط انتقائي لمعرفة ما إذا كان التفاعل يحدث. الخلايا التي لا تحتوي على بروتينات تفاعلية لا ينبغي أن تبقى على قيد الحياة في هذا الوسط الانتقائي. [ 7 ] [ 21 ]

الخميرة ( S. cerevisiae )

استُخدمت خميرة Saccharomyces cerevisiae ككائن نموذجي في بداية تقنية التفاعل الثنائي. وتُعرف هذه التقنية باسم نظام Y2H. تتميز الخميرة بعدة خصائص تجعلها كائنًا قويًا لاستضافة هذا التفاعل، بما في ذلك قدرتها على تكوين بنى بروتينية ثلاثية، ودرجة حموضة داخلية متعادلة، وقدرتها العالية على تكوين روابط ثنائية الكبريتيد، ووجود الجلوتاثيون في حالته المختزلة، بالإضافة إلى عوامل أخرى في السيتوبلازم للحفاظ على بيئة داخلية ملائمة. [ 1 ] يمكن التلاعب بنموذج الخميرة من خلال تقنيات غير جزيئية، كما أن تسلسل جينومها الكامل معروف. [ 1 ] تتميز أنظمة الخميرة بتحملها لظروف استزراع متنوعة ومواد كيميائية قاسية لا يمكن استخدامها في استزراع أنسجة الثدييات. [ 1 ]

تم استحداث عدد من سلالات الخميرة خصيصًا لفحص التفاعل بين البروتينات باستخدام نظام Y2H، مثل Y187 [ 22 ] و AH109 [ 23 ]، وكلاهما من إنتاج شركة Clontech . كما استُخدمت سلالات الخميرة R2HMet وBK100 [ 24 ] .

المبيضات البيضاء

تُعدّ المبيضة البيضاء (C. albicans) خميرة ذات خاصية مميزة: فهي تُترجم كودون CUG إلى سيرين بدلاً من ليوسين. وبسبب هذا الاختلاف في استخدام الكودون، يصعب استخدام نظام الخميرة S. cerevisiae كنموذج لتفاعلات البروتين-بروتين (Y2H) لدراسة هذه التفاعلات باستخدام جينات المبيضة البيضاء . ولتوفير بيئة أقرب إلى بيئتها الطبيعية،تم تطوير نظام التفاعل الثنائي للمبيضة البيضاء (C2H). يُمكّن هذا النظام من دراسة تفاعلات البروتين-بروتين في المبيضة البيضاء نفسها. [ 25 ] [ 26 ] وقد أُضيف مؤخرًا نظام عالي الإنتاجية. [ 27 ] [ 28 ] [ 29 ]

الإشريكية القولونية

تُجرى طرق التهجين الثنائي البكتيري (B2H أو BTH) عادةً في بكتيريا الإشريكية القولونية ، ولها بعض المزايا مقارنةً بالأنظمة القائمة على الخميرة. فعلى سبيل المثال، تُتيح كفاءة التحويل العالية ومعدل النمو الأسرع للإشريكية القولونية استخدام مكتبات جينية أكبر (تتجاوز 10⁸ ) . [ 2 ] كما يُعدّ عدم اشتراط تضمين إشارة التموضع النووي في تسلسل البروتين، والقدرة على دراسة البروتينات السامة للخميرة، من العوامل الرئيسية التي يجب مراعاتها عند اختيار الكائن الحي المستخدم في التجارب. [ 2 ]

قد يتداخل نشاط مثيلة بعض بروتينات ميثيل ترانسفيراز الحمض النووي في بكتيريا الإشريكية القولونية مع اختيار بعض البروتينات الرابطة للحمض النووي. إذا كان هذا متوقعًا، فقد يكون استخدام سلالة من الإشريكية القولونية تفتقر إلى ميثيل ترانسفيراز معين حلاً واضحًا. [ 2 ] قد لا يكون نموذج التفاعل بين البروتينات مثاليًا عند دراسة تفاعلات البروتين-بروتين في حقيقيات النوى (مثل البروتينات البشرية)، حيث قد لا تتخذ البروتينات شكلها المعتاد في الخلايا حقيقية النوى أو قد تفتقر إلى عمليات معالجة أخرى.

خلايا الثدييات

في السنوات الأخيرة، تم تصميم نظام هجين ثنائي في الخلايا الثديية (M2H) لدراسة تفاعلات البروتين-بروتين في بيئة خلوية تحاكي بيئة البروتين الطبيعية بدقة. [ 30 ] تُستخدم خلايا ثديية مُعدّلة وراثيًا بشكل مؤقت في هذا النظام لاكتشاف تفاعلات البروتين-بروتين. [ 31 ] [ 32 ] يمنح استخدام خط خلوي ثديي لدراسة تفاعلات البروتين-بروتين ميزة العمل في سياق أقرب إلى البيئة الطبيعية. [ 5 ] التعديلات اللاحقة للترجمة، مثل الفسفرة والأَسْيَلَة والغليكوزيل، متشابهة. كما أن التموضع داخل الخلوي للبروتينات أكثر دقة مقارنةً باستخدام نظام هجين ثنائي في الخميرة. [ 33 ] [ 34 ] من الممكن أيضًا، باستخدام نظام الهجين الثنائي في الخلايا الثديية، دراسة مدخلات الإشارة. [ 35 ] ميزة أخرى مهمة هي إمكانية الحصول على النتائج في غضون 48 ساعة من التعديل الوراثي. [ 5 ]

نبات الأرابيدوبسيس ثاليانا

في عام ٢٠٠٥، طُوِّر نظام هجين ثنائي في النباتات. وباستخدام بروتوبلاستات نبات الرشاد (Arabidopsis thaliana) ، يُمكن دراسة تفاعلات البروتين-بروتين في النباتات. وبهذه الطريقة، يُمكن دراسة هذه التفاعلات في سياقها الطبيعي. في هذا النظام، يخضع نطاقا GAL4 AD وBD لسيطرة مُحفِّز 35S القوي. ويُقاس التفاعل باستخدام مُخبِر GUS. ولتمكين الفحص عالي الإنتاجية، جُعلت النواقل متوافقة مع Gateway . يُعرف هذا النظام بنظام البروتوبلاست الهجين الثنائي (P2H). [ ٣٦ ]

أبليسيا كاليفورنيكا

يُعدّ الأرنب البحري (A. californica) كائنًا نموذجيًا في علم الأحياء العصبية لدراسة الآليات الجزيئية للذاكرة طويلة الأمد، من بين أمور أخرى. ولدراسة التفاعلات المهمة في علم الأعصاب، في بيئة أقرب إلى بيئتها الطبيعية، تم تطوير نظام هجين ثنائي في خلايا عصبية من نوع A. يُستخدم في هذا النظام كل من A GAL4 AD وBD. [ 37 ] [ 38 ]

دودة القز (Bombyx mori)

تم تطوير نظام التفاعل الثنائي للحشرات (I2H) في سلالة خلايا دودة القز المستخلصة من يرقة أو دودة القز المستأنسة، Bombyx mori (خلايا BmN4). يستخدم هذا النظام نطاق ربط GAL4 ونطاق التنشيط الخاص بـ NF-κB P65 في الفئران. وكلاهما يخضع لسيطرة محفز OpIE2. [ 39 ]

التطبيقات

تحديد التسلسلات الحاسمة للتفاعل

من خلال تغيير أحماض أمينية محددة عن طريق تحوير أزواج قواعد الحمض النووي المقابلة في البلازميدات المستخدمة، يمكن تحديد أهمية بقايا الأحماض الأمينية هذه في الحفاظ على التفاعل. [ 1 ]

بعد استخدام طريقة تعتمد على الخلايا البكتيرية لاختيار البروتينات المرتبطة بالحمض النووي، من الضروري التحقق من خصوصية هذه المجالات، حيث أن هناك حدًا لمدى قدرة جينوم الخلية البكتيرية على العمل كمستودع للمجالات ذات الألفة لتسلسلات أخرى (أو في الواقع، الألفة العامة للحمض النووي). [ 2 ]

اكتشاف الأدوية والسموم

تُشكّل تفاعلات الإشارات بين البروتينات أهدافًا علاجية مناسبة نظرًا لخصوصيتها وانتشارها الواسع. يعتمد نهج اكتشاف الأدوية العشوائي على بنوك مركبات تضم تراكيب كيميائية عشوائية، ويتطلب طريقة عالية الإنتاجية لاختبار هذه التراكيب في هدفها المقصود. [ 1 ] [ 21 ]

يمكن هندسة الخلية المختارة للدراسة بشكل خاص لمحاكاة الجانب الجزيئي الذي ينوي الباحث دراسته، ثم استخدامها لتحديد علاجات جديدة للإنسان أو الحيوان أو عوامل مضادة للآفات. [ 1 ] [ 21 ]

تحديد وظيفة البروتين

من خلال تحديد الشركاء التفاعليين للبروتينات غير المعروفة، يمكن استنتاج الوظائف المحتملة لهذه البروتينات الجديدة. [ 1 ] ويمكن القيام بذلك باستخدام بروتين واحد معروف مقابل مكتبة من البروتينات غير المعروفة، أو بالعكس، عن طريق الاختيار من مكتبة من البروتينات المعروفة باستخدام بروتين واحد ذي وظيفة غير معروفة. [ 1 ]

اختيار بروتين إصبع الزنك

لاختيار بروتينات أصابع الزنك (ZFPs) لهندسة البروتينات ، استُخدمت بنجاح طرق مُعدّلة من تقنية الفحص الثنائي الهجين. [ 2 ] [ 3 ] بروتين أصابع الزنك هو بروتين رابط للحمض النووي، ويُستخدم في بناء نطاقات ربط الحمض النووي المُخصصة التي ترتبط بتسلسل الحمض النووي المطلوب. [ 40 ]

باستخدام جين اختيار يحتوي على التسلسل المستهدف المطلوب ضمن منطقة التحكم في الجينوم (UAS)، وترتيب تسلسلات الأحماض الأمينية ذات الصلة عشوائيًا لإنتاج مكتبة بروتينات الزنك (ZFP)، يمكن اختيار الخلايا التي تستضيف تفاعل DNA-ZFP بالخصائص المطلوبة. يتعرف كل بروتين ZFP عادةً على 3-4 أزواج قاعدية فقط، لذا لمنع التعرف على المواقع خارج منطقة التحكم في الجينوم، يُدمج بروتين ZFP المُرتب عشوائيًا في "هيكل" يتكون من بروتينين ZFP آخرين بتسلسل ثابت. وبالتالي، صُممت منطقة التحكم في الجينوم لتشمل التسلسل المستهدف للهيكل الثابت بالإضافة إلى التسلسل الذي تم اختيار بروتين ZFP بناءً عليه. [ 2 ] [ 3 ]

يمكن أيضًا دراسة عدد من نطاقات ربط الحمض النووي الأخرى باستخدام هذا النظام. [ 2 ]

نقاط القوة

  • تعتبر عمليات الفحص الهجينة الثنائية منخفضة التقنية؛ ويمكن إجراؤها في أي مختبر دون معدات متطورة.
  • يمكن أن توفر عمليات الفحص ثنائية الهجينة تلميحًا أوليًا مهمًا لتحديد شركاء التفاعل.
  • يتميز هذا التحليل بقابليته للتوسع، مما يتيح فحص التفاعلات بين العديد من البروتينات. علاوة على ذلك، يمكن أتمتته، وباستخدام الروبوتات، يمكن فحص العديد من البروتينات مقابل آلاف البروتينات التي يحتمل تفاعلها في وقت قصير نسبيًا. ويُستخدم نوعان من الفحوصات واسعة النطاق: أسلوب المكتبة وأسلوب المصفوفة.
  • يمكن أن تكون بيانات التفاعل الثنائي للخميرة ذات جودة مماثلة للبيانات الناتجة عن النهج البديل المتمثل في تنقية التقارب متبوعة بقياس الطيف الكتلي (AP/MS). [ 41 ] [ 9 ]

نقاط الضعف

  • يتمثل النقد الرئيسي الموجه إلى فحص التفاعلات بين البروتينات باستخدام نظام الخميرة ثنائي الهجين في احتمالية الحصول على عدد كبير من النتائج الإيجابية (والسلبية) الخاطئة. لا يُعرف المعدل الدقيق للنتائج الإيجابية الخاطئة، ولكن التقديرات السابقة أشارت إلى أنه قد يصل إلى 70%. وهذا يفسر جزئيًا التداخل الضئيل جدًا في النتائج عند استخدام فحص ثنائي الهجين (عالي الإنتاجية)، خاصةً عند استخدام أنظمة تجريبية مختلفة. [ 9 ] [ 32 ]

يرجع سبب ارتفاع معدل الخطأ هذا إلى خصائص الشاشة:

  • بعض أنواع الاختبارات تزيد من التعبير عن البروتينات المدمجة مما قد يتسبب في تركيزات بروتينية غير طبيعية تؤدي إلى نتائج إيجابية غير محددة (خاطئة).
  • البروتينات الهجينة هي بروتينات اندماجية؛ أي أن الأجزاء المندمجة قد تمنع تفاعلات معينة، خاصة إذا حدث تفاعل عند الطرف الأميني لبروتين الاختبار (حيث يرتبط عادةً مجال ربط الحمض النووي أو مجال التنشيط).
  • قد لا يحدث التفاعل في الخميرة، وهي الكائن المضيف النموذجي لتقنية التفاعل بين البروتينات في الخميرة (Y2H). على سبيل المثال، إذا تم اختبار بروتين بكتيري في الخميرة، فقد يفتقر إلى بروتين مرافق للطي الصحيح، وهو بروتين موجود فقط في البكتيريا المضيفة. علاوة على ذلك، قد لا يتم تعديل بروتين الثدييات بشكل صحيح في الخميرة (مثل غياب الفسفرة )، مما قد يؤدي أيضًا إلى نتائج خاطئة.
  • يحدث تفاعل الخميرة مع البروتينات (Y2H) في النواة. إذا لم تكن البروتينات المختبرة متمركزة في النواة (لأنها تحتوي على إشارات تمركز أخرى)، فقد يتبين أن بروتينين متفاعلين غير متفاعلين.
  • قد تتفاعل بعض البروتينات بشكلٍ خاص عند التعبير عنها معًا في الخميرة، مع أنها في الواقع لا تتواجد في الخلية نفسها في الوقت نفسه. ومع ذلك، في معظم الحالات، لا يمكن استبعاد أن هذه البروتينات تُعبَّر عنها بالفعل في خلايا معينة أو في ظروف معينة.

كل نقطة من هذه النقاط على حدة قد تؤدي إلى نتائج خاطئة. ونظرًا لتأثير جميع مصادر الخطأ مجتمعة، يجب تفسير نتائج اختبار التفاعل الثنائي للخميرة بحذر. فاحتمالية ظهور نتائج إيجابية خاطئة تعني ضرورة تأكيد جميع التفاعلات بواسطة اختبار عالي الدقة، مثل الترسيب المناعي المشترك للبروتينات الذاتية، وهو أمر صعب في حالة بيانات تفاعل البروتين-بروتين واسعة النطاق. بدلاً من ذلك، يمكن التحقق من بيانات اختبار التفاعل الثنائي للخميرة باستخدام متغيرات متعددة من هذا الاختبار [ 42 ] أو تقنيات المعلوماتية الحيوية. تختبر هذه الأخيرة ما إذا كانت البروتينات المتفاعلة تُعبَّر في الوقت نفسه، أو تشترك في بعض السمات المشتركة (مثل شروح علم وظائف الجينات أو بعض بنيات الشبكة )، أو لها تفاعلات متماثلة في أنواع أخرى [ 43 ] .

انظر أيضاً

مراجع

  1. 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 يونغ، ك. هـ . (فبراير 1998). "الخميرة ثنائية الهجين: تفاعلات كثيرة، في وقت قصير جدًا" . بيولوجيا التكاثر . 58 (2): 302-311 . doi : 10.1095/biolreprod58.2.302 . PMID 9475380 . 
  2. 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 جونغ جيه كيه، رام إي آي، بابو سي أو (يونيو 2000). " نظام اختيار ثنائي الهجين البكتيري لدراسة تفاعلات البروتين مع الحمض النووي وتفاعلات البروتين مع البروتين" . وقائع الأكاديمية الوطنية للعلوم في الولايات المتحدة الأمريكية . 97 (13): 7382-7 . Bibcode : 2000PNAS...97.7382J . doi : 10.1073/pnas.110149297 . PMC 16554. PMID 10852947 .  
  3. ١ ٢ ٣ ٤ ٥ ٦ ٧ ٨ ٩ هيرت، جيه إيه، ثيبودو، إس إيه، هيرش، إيه إس، بابو، سي أو، جونغ، جيه كيه (أكتوبر ٢٠٠٣). "بروتينات أصابع الزنك عالية التخصص تم الحصول عليها عن طريق إعادة ترتيب النطاقات الموجهة والاختيار الخلوي" . وقائع الأكاديمية الوطنية للعلوم في الولايات المتحدة الأمريكية . ١٠٠ (٢١): ١٢٢٧١-١٢٢٧٦ . Bibcode : 2003PNAS..10012271H . doi : 10.1073/pnas.2135381100 . PMC 218748. PMID 14527993 .  
  4. ↑ فيلدز إس، سونغ أو (يوليو 1989). "نظام جيني جديد للكشف عن تفاعلات البروتين-بروتين". نيتشر . 340 ( 6230): 245-246 . Bibcode : 1989Natur.340..245F . doi : 10.1038/340245a0 . PMID 2547163. S2CID 4320733 .  الملخص مجاني؛ أما المقالة كاملة النص فليست كذلك.
  5. 1 2 3 لو ي، باتالاو أ، تشو هـ، تشو ل (فبراير 1997). "نظام التهجين الثنائي في الثدييات: نهج تكميلي لنظام التهجين الثنائي في الخميرة" . BioTechniques . 22 (2): 350-352 . doi : 10.2144/97222pf02 . PMID 9043710 . 
  6. ↑ فيرشوري، بي. جيه.، فيسر، إيه. إي.، روتس، إم. جي. (2006). الخروج عن المألوف: أنظمة التحكم الجيني اللاجينية وعوامل النسخ المُهندسة . التقدم في علم الوراثة. المجلد 56. الصفحات 163-204 . doi : 10.1016/S0065-2660(06)56005-5 . ISBN   9780120176564PMID 16735158​​ 
  7. 1 2 بروكينر أ، بولج سي، لينتزه ن، أورباخ د، شلاتنر يو (يونيو 2009). "التفاعل الثنائي للخميرة، أداة فعالة في بيولوجيا الأنظمة" . المجلة الدولية للعلوم الجزيئية . 10 (6): 2763-88 . doi : 10.3390/ijms10062763 . PMC 2705515. PMID 19582228 .  
  8. ↑ جيتز، آر. دي.، تريغز-راين، بي.، روبنز، إيه.، غراهام، كيه. سي.، وودز، آر. إيه. (يوليو 1997). "تحديد البروتينات التي تتفاعل مع بروتين مُحدد: تطبيقات نظام التفاعل الثنائي في الخميرة". الكيمياء الحيوية الجزيئية والخلوية . 172 ( 1-2 ): 67-79 . doi : 10.1023/ A :1006859319926 . PMID 9278233. S2CID 32413316 .  
  9. 1 2 3 4 أورباخ د، ستاغليار إي (2005). "شبكات تفاعل البروتين-بروتين في الخميرة ثنائية الهجين". علم البروتينات وتفاعلات البروتين-بروتين . مراجعات البروتين. المجلد 3. الصفحات 19-31 . doi : 10.1007/0-387-24532-4_2 . ISBN   978-0-387-24531-7. S2CID 82470771 . 
  10. ↑ ويبل، ف. و. (أغسطس 1998). "التحليل الجيني لبروتينات ربط الحمض النووي في بدائيات النوى وحقيقيات النوى في الإشريكية القولونية" . مجلة أبحاث الأحماض النووية . 26 (16): 3700-3706 . doi : 10.1093/nar/26.16.3700 . PMC 147751. PMID 9685485 .  
  11. ↑ ستاغليار، آي.، كوروستينسكي، سي.، جونسون، إن.، تي هيسن، إس. (أبريل 1998). "نظام وراثي قائم على اليوبيكويتين المنقسم لتحليل التفاعلات بين البروتينات الغشائية في الكائنات الحية" . وقائع الأكاديمية الوطنية للعلوم في الولايات المتحدة الأمريكية . 95 (9): 5187-92 . Bibcode : 1998PNAS...95.5187S . doi : 10.1073/pnas.95.9.5187 . PMC 20236. PMID 9560251 .  
  12. ↑ سنايدر ج، كيتاناكوم س، كوراك ج، ستاغليار إ (فبراير 2010). "نظام الخميرة ثنائي الهجين الغشائي القائم على اليوبيكويتين المنقسم (MYTH): أداة فعالة لتحديد تفاعلات البروتين-بروتين" . مجلة التجارب المصورة (36). doi : 10.3791/1698 . PMC 2818708. PMID 20125081 .  
  13. ↑ زولغادر ك، مورتوسيفيتش أ، روثباور يو، كلاينهاينز ر، جوهلر هـ، وانكر إي إي، كاردوسو إم سي، ليونهاردت هـ (نوفمبر 2008). "اختبار تهجين ثنائي فلوري للتصوير المباشر لتفاعلات البروتين في الخلايا الحية" . علم البروتينات الجزيئي والخلوي . 7 (11): 2279-87 . doi : 10.1074/mcp.M700548-MCP200 . PMID 18622019 . 
  14. ↑ يورلوفا إل، ديركس إم، بوخفيلنر إيه، هيكسون آي، جانسن إم، موريسون دي، ستانسفيلد آي، براون سي جيه، غاديسي إف جيه، لين دي بي، روثباور يو، زولغادر كيه، كراوز إي (أبريل 2014). "اختبار التفاعل الثنائي الفلوري لفحص مثبطات تفاعل البروتين-بروتين في الخلايا الحية: استهداف تفاعل p53 مع Mdm2 وMdm4" . مجلة الفحص الجزيئي الحيوي . 19 (4): 516-25 . doi : 10.1177/1087057113518067 . PMID 24476585 . 
  15. ^ Lievens S، Gerlo S، Lemmens I، De Clercq DJ، Risseeuw MD، Vanderroost N، De Smet AS، Ruyssinck E، Chevet E، Van Calenbergh S، Tavernier J (ديسمبر 2014). "مستشعر الركيزة كيناز (KISS)، وهو مستشعر تفاعل البروتين في الثدييات" . البروتينات الجزيئية والخلوية . 13 (12): 3332-42 . دوى : 10.1074/mcp.M114.041087 . بمك 4256487 . بميد 25154561 .  
  16. ^ تشي، يانبينغ؛ تشانغ، تشونلي. يوان، شان؛ شو، شين؛ صن، شي؛ تشانغ، ليكسين؛ ليو، لوبينج؛ وو، تينجتينج؛ هان، تيانفو؛ وو، كونشيانغ؛ جيانغ ، بينججون (يوليو 2025). "سائل Y2H-Seq، بديل سريع وغني بالبيانات لفحص الخميرة التقليدية ثنائي الهجين" . البروتينات . 25 (13)هـ13970. دوى : 10.1002/pmic.13970 . ردمك 1615-9853 . بميد 40484918 .  
  17. ↑ فويتك، أ.ب.؛ هولنبرغ، س.م.؛ كوبر، ج.أ. (16 يوليو 1993). "يتفاعل بروتين راس في الثدييات مباشرةً مع كيناز سيرين/ثريونين راف" . مجلة الخلية . 74 (1): 205-214 . doi : 10.1016/0092-8674(93)90307-c . ISSN 0092-8674 . 
  18. ↑ يوريف، أنطون؛ وينوجل، لورانس ب. (يونيو 1998). "عائلة RAF: شبكة متنامية من الضوابط ما بعد الترجمة وتفاعلات البروتين-بروتين" . أبحاث الخلية . 8 (2): 81-98 . doi : 10.1038/cr.1998.9 . ISSN 1748-7838 . 
  19. ^ تيتز ، بيورن. توماس، سيندهو؛ راجاجوبالا، سيساندرا ف؛ تشيبا، توموكو؛ إيتو، تاكاشي؛ أوتز، بيتر (2006). "المنشطات النسخية في الخميرة" . أبحاث الأحماض النووية . 34 (3): 955-967 . دوى : 10.1093/nar/gkj493 . ردمك 1362-4962 . بمك 1361621 . بميد 16464826 .   
  20. ↑ ستاينن ب، تورنو هـ، تافيرنييه ج، فان ديجك ب (يونيو 2012). "التنوع في الطرق الجينية الحيوية لدراسة تفاعلات البروتين-بروتين: من نظام الخميرة ثنائي الهجين إلى نظام اللوسيفيراز المنقسم في الثدييات" . مراجعات علم الأحياء الدقيقة والبيولوجيا الجزيئية . 76 (2): 331-382 . doi : 10.1128/MMBR.05021-11 . PMC 3372256. PMID 22688816 .  
  21. ١ ٢ ٣ حمدي أ، كولاس ب (فبراير ٢٠١٢). "طرق التفاعل الثنائي للخميرة وتطبيقاتها في اكتشاف الأدوية" . اتجاهات في العلوم الدوائية . ٣٣ (٢): ١٠٩-١٨ . doi : 10.1016/j.tips.2011.10.008 . PMID 22130009 . 
  22. ↑ فرومونت-راسين م، رين جيه سي، ليجرين ب (يوليو 1997). "نحو تحليل وظيفي لجينوم الخميرة من خلال فحوصات شاملة للتفاعل الثنائي". علم الوراثة الطبيعية . 16 (3): 277-282 . doi : 10.1038/ng0797-277 . PMID 9207794. S2CID 32591856 .  
  23. ↑ لو إل، هورستمان إتش، نغ سي، هونغ دبليو (ديسمبر 2001). "تنظيم بنية ووظيفة جهاز غولجي بواسطة البروتين الشبيه بـ ARF-1 (Arl1)". مجلة علوم الخلية . 114 (الجزء 24): 4543-55 . doi : 10.1242/jcs.114.24.4543 . PMID 11792819 . 
  24. ^ Khadka S، Vangeloff AD، Zhang C، Siddavatam P، Heaton NS، Wang L، Sengupta R، Sahasrabudhe S، Randall G، Gribskov M، Kuhn RJ، Perera R، LaCount DJ (ديسمبر 2011). "شبكة تفاعل فيزيائي بين فيروس حمى الضنك والبروتينات البشرية" . البروتينات الجزيئية والخلوية . 10 (12) م111.012187. دوى : 10.1074/mcp.M111.012187 . بمك 3237087 . بميد 21911577 .  
  25. ^ شوترز ، فلوريس. ^ فان ديك ، باتريك (7 أغسطس 2019). "تفاعلات البروتين البروتين في المبيضات البيضاء" . الحدود في علم الأحياء الدقيقة . 10 : 1792. دوى : 10.3389/fmicb.2019.01792 . بمك 6693483 . بميد 31440220 .  
  26. ^ ستينن ب، فان ديك ب، تورنو ح (أكتوبر 2010). "كودون CUG يتكيف مع نظام هجين ثنائي للفطريات المسببة للأمراض Candida albicans" . أبحاث الأحماض النووية . 38 (19): هـ184. دوى : 10.1093/نار/gkq725 . بمك 2965261 . بميد 20719741 .  
  27. ↑ شوترز، فلوريس؛ مونرو، كارول أ.؛ دانفيرت، كريستوف؛ فان ديجك، باتريك؛ ميتشل، آرون ب. (22 أغسطس 2018). " نظام هجين ثنائي عالي الإنتاجية" . mSphere . 3 (4). doi : 10.1128/mSphere.00391-18 . PMC 6106057. PMID 30135223 .  
  28. ^ ليجراند ، ميلاني. باشيلير باسي، صوفي؛ لي ، كيونسوك ك. تشودري، يوغيش؛ تورنو، هيلين؛ اربوجاست، لورانس؛ بوير، هيلين. شوفيل، موريل. كابرال، فيتور؛ موفرايس، كورين؛ نصير، أودري؛ ماسلانكا، إيرينا؛ بيرمال، إيمانويل؛ روسينول، تريستان؛ ووكر ، لويز أ ؛ زيدلر، يوت. الزنايدي، صدري؛ شوترز، فلوريس؛ ماجير، شارلوت؛ جوليان رينو أ. أماه، لورانس؛ تيشيت، مجالي؛ بوشييه، كريستيان. فان ديك، باتريك؛ مونرو ، كارول أ. دينفيرت ، كريستوف (10 أغسطس 2018). “توليد منصات الجينوم لدراسة التسبب في المبيضات البيضاء” (PDF) . مجلة أبحاث الأحماض النووية . 46 (16): 8664. doi : 10.1093/nar/ gky747 . PMC 6144791. PMID 30107554 .  
  29. ^ شوترز ، فلوريس. فان ديك، باتريك (2019). "تفاعلات البروتين البروتين في المبيضات البيضاء" . الحدود في علم الأحياء الدقيقة . 10 : 1792. دوى : 10.3389/fmicb.2019.01792 . ISSN 1664-302X . بمك 6693483 . بميد 31440220 .   
  30. ↑ نظام CheckMate™ للتهجين الثنائي للثدييات promega.com
  31. ↑ فينغ إكس إتش، ديرينك آر (2001). "اختبارات التفاعل الثنائي في الثدييات: تحليل تفاعلات البروتين-بروتين في مسار إشارات عامل النمو المحول بيتا". أنظمة التفاعل الثنائي . المجلد 177. الصفحات 221-239 . doi : 10.1385/1-59259-210-4:221 . ISBN   978-1-59259-210-4PMID 11530609​​ 
  32. 1 2 دين سي إم، سالوينسكي إل، زيناريوس آي، أيزنبرغ دي (مايو 2002). "تفاعلات البروتين: طريقتان لتقييم موثوقية الملاحظات عالية الإنتاجية" . علم البروتينات الجزيئي والخلوي . 1 (5): 349-56 . doi : 10.1074/mcp.M100037-MCP200 . PMID 12118076 . 
  33. ↑ بوكهولز، آر. جي.، وجليسون ، إم. إيه. (نوفمبر 1991). "أنظمة الخميرة للإنتاج التجاري للبروتينات غير المتجانسة". التكنولوجيا الحيوية . 9 (11): 1067-1072 . doi : 10.1038/nbt1191-1067 . PMID 1367623. S2CID 31597609 .  
  34. ↑ فاجان ر، فلينت كيه جيه، جونز ن (سبتمبر 1994). "فسفرة E2F-1 تُعدّل تفاعله مع ناتج جين الورم الأرومي الشبكي وبروتين E4 الفيروسي الغدي بوزن 19 كيلو دالتون". الخلية . 78 ( 5): 799-811 . doi : 10.1016/s0092-8674(94)90522-3 . PMID 8087847. S2CID 22888513 .  
  35. ↑ ليو، جون أو. (1998). "كل ما تحتاج معرفته عن نظام التفاعل الثنائي للخميرة". مجلة نيتشر للبيولوجيا التركيبية . 5 (7): 535-536 . doi : 10.1038/788 . S2CID 37127696 . 
  36. ↑ إهلرت أ، ويلتماير ف، وانغ إكس، ماير سي إس، سميكينز إس، فيسنتي-كارباخوسا ج، دروج-لازر دبليو (يونيو 2006). "تحليل تفاعل البروتين-بروتين ثنائي الهجين في بروتوبلاستات نبات الأرابيدوبسيس: إنشاء خريطة لتكوين ثنائيات غير متجانسة لعوامل النسخ bZIP من المجموعتين C وS" . مجلة النبات . 46 (5): 890-900 . doi : 10.1111/j.1365-313X.2006.02731.x . PMID 16709202 . 
  37. ↑ تشوي جيه إتش، لي جيه إيه، ييم إس دبليو، ليم سي إس، لي سي إتش، لي واي دي، بارتش دي، كاندل إي آر، كانغ بي كيه (2003). "استخدام نظام التهجين الثنائي في الأبليسيا لدراسة التفاعلات بين عوامل النسخ المشاركة في التسهيل طويل الأمد في الجهاز العصبي للأبليسيا" . التعلم والذاكرة . 10 (1): 40-43 . doi : 10.1101/lm.55303 . PMC 196654. PMID 12551962 .  
  38. ↑ لي جيه إيه، لي إس إتش، لي سي، تشانغ دي جيه، لي واي، كيم إتش، تشيانغ واي إتش، كو إتش جي، لي واي إس، جون إتش، بارتش دي، كاندل إي آر، كانغ بي كيه (سبتمبر 2006). "يُعدّ ثنائي ApAF-ApC/EBP المُنشّط بواسطة PKA مُؤثّرًا رئيسيًا في مسار ApCREB، وهو ضروري وكافٍ لترسيخ التسهيل طويل الأمد" . مجلة بيولوجيا الخلية . 174 (6): 827-38 . doi : 10.1083/jcb.200512066 . PMC 2064337. PMID 16966424 .  
  39. ↑ مون هـ، سوغاهارا ر، هونغ إس إم، لي جيه إم، كاماتشي واي، كاواغوتشي واي، كوساكابي تي (سبتمبر 2009). "تحليل تفاعلات البروتين باستخدام نظام التهجين الثنائي في خلايا الحشرات المستزرعة". الكيمياء الحيوية التحليلية . 392 (2): 180-182 . doi : 10.1016/j.ab.2009.05.033 . PMID 19481053 . 
  40. ↑ غومانس، دبليو إم، هايسما، إتش جيه، روتس، إم جي (ديسمبر 2005). "هندسة عوامل النسخ البروتينية ذات الأصابع الزنكية: الأهمية العلاجية لتشغيل أو إيقاف التعبير الجيني الداخلي عند الطلب" . مجلة البيولوجيا الجزيئية . 354 (3): 507-19 . doi : 10.1016/j.jmb.2005.06.082 . PMID 16253273 . 
  41. ^ يو إتش، براون بي، يلدريم إم إيه، ليمنس الأول، فينكاتيسان ك، ساهالي جيه، هيروزان كيشيكاوا تي، جبريب إف، لي إن، سيمونيس إن، هاو تي، روال جي إف، دريكو أ، فاسكويز أ، موراي آر آر، سيمون سي، تارديفو إل، تام إس، سفرزيكابا ن، فان سي، دي سميت إيه إس، موتيل أ، هدسون ME، Park J، Xin X، Cusick ME، Moore T، Boone C، Snyder M، Roth FP، Barabási AL، Tavernier J، Hill DE، Vidal M (أكتوبر 2008). "خريطة تفاعل البروتين الثنائي عالية الجودة لشبكة تفاعل الخميرة" . علوم . 322 (5898): 104– 10. بيب كود : 2008Sci...322..104Y . doi : 10.1126/ science.1158684 . PMC 2746753. PMID 18719252 .  
  42. ↑ تشين واي سي، راجاغوبالا إس في، ستيلبرغر تي، أويتز بي (سبتمبر 2010). "تقييم شامل لنظام التفاعل الثنائي للخميرة" . نيتشر ميثودز . 7 (9): 667-668 ، رد المؤلف 668. doi : 10.1038/ nmeth0910-667 . PMC 10332476. PMID 20805792. S2CID 35834541 .   
  43. ↑ كوجل م، أوتز ب (ديسمبر 2007). "تحسين أنظمة فحص التفاعل الثنائي في الخميرة" . موجزات في علم الجينوم الوظيفي وعلم البروتينات . 6 (4): 302-312 . doi : 10.1093/bfgp/elm035 . PMID 18218650 .