عد الخلايا

حجرة العد هي شريحة مجهرية مصممة خصيصًا لعد الخلايا. ومن أنواع حجرات العد: عدادات الخلايا الدموية وحجرات سيدجويك رافتر . تحتوي عداد الخلايا الدموية على حجرتين شبكيتين في وسطها، تُغطى بشريحة زجاجية خاصة أثناء العد. توضع قطرة من مزرعة الخلايا في الفراغ بين الحجرة والغطاء الزجاجي، فتمتلئ بفعل الخاصية الشعرية . ^{[ 1 ]} عند فحص العينة تحت المجهر ، يستخدم الباحث الشبكة لعد الخلايا يدويًا في منطقة محددة الحجم. المسافة الفاصلة بين الحجرة والغطاء محددة مسبقًا، وبالتالي يمكن حساب حجم المزرعة المعدودة، ومن ثم تركيز الخلايا. كما يمكن تحديد حيوية الخلايا بإضافة أصباغ حيوية إلى السائل.

تتميز هذه الطريقة برخص ثمنها وسرعتها، مما يجعلها الطريقة المفضلة للعد في التجارب البيولوجية السريعة التي تقتصر على تحديد ما إذا كانت مزرعة الخلايا قد نمت كما هو متوقع. عادةً ما تحتاج المزرعة المدروسة إلى التخفيف، وإلا فإن الكثافة العالية للخلايا ستجعل العد مستحيلاً. يُعدّ التخفيف عيبًا، إذ يُضيف كل تخفيف عدم دقة إلى القياس. ^{[ 2 ]}

لتقدير عدد الخلايا في مزرعة بكتيرية، تُزرع الخلايا ببساطة في طبق بتري يحتوي على وسط نمو . إذا وُزعت الخلايا بكفاءة على الطبق، يُفترض عمومًا أن كل خلية ستُنتج مستعمرة واحدة أو وحدة تكوين مستعمرة (CFU) . بعد ذلك، تُحصى المستعمرات، وبناءً على الحجم المعروف للمزرعة المزروعة على الطبق، يُمكن حساب تركيز الخلايا. غالبًا ما تُجرى هذه العملية وفقًا لمعيار ASTM D5465. ^{[ 3 ]}

كما هو الحال مع غرف العد، عادةً ما تحتاج المزارع إلى تخفيف كبير قبل زراعتها؛ وإلا، فبدلاً من الحصول على مستعمرات منفردة يمكن عدها، ستتشكل ما يُسمى بـ"الطبقة الكثيفة": آلاف المستعمرات المتراصة فوق بعضها البعض. إضافةً إلى ذلك، تُعد الزراعة أبطأ الطرق على الإطلاق: إذ تحتاج معظم الكائنات الدقيقة إلى 12 ساعة على الأقل لتكوين مستعمرات مرئية.

على الرغم من أن هذه الطريقة قد تستغرق وقتًا طويلاً، إلا أنها تُعطي تقديرًا دقيقًا لعدد الخلايا الحية (لأنها وحدها القادرة على النمو وتكوين مستعمرات مرئية). ولذلك، تُستخدم على نطاق واسع في التجارب التي تهدف إلى تحديد كمية الخلايا المقاومة للأدوية أو غيرها من الظروف الخارجية (على سبيل المثال، تجربة لوريا-ديلبروك أو اختبار الحماية بالجنتاميسين ). إضافةً إلى ذلك، يُمكن تسهيل عدّ المستعمرات على أطباق الآجار بشكل كبير باستخدام عدادات المستعمرات .

عداد كولتر هو جهاز يُستخدم لحساب عدد الخلايا وقياس حجمها. يعتمد عمله على مقاومة الخلايا العالية للكهرباء ، أي أنها لا توصل الكهرباء تقريبًا . في عداد كولتر، تُسحب الخلايا، وهي تسبح في محلول موصل للكهرباء، واحدة تلو الأخرى إلى فجوة صغيرة. يحيط بهذه الفجوة قطبان كهربائيان موصلان للكهرباء. عندما لا توجد خلية في الفجوة، يتدفق التيار الكهربائي بحرية، ولكن عند سحب خلية إلى داخلها، يُقاوم التيار. يحسب عداد كولتر عدد هذه العمليات ويقيس شدة التيار (وبالتالي المقاومة)، والتي ترتبط ارتباطًا مباشرًا بحجم الخلية المحتجزة. وتُعد تقنية CASY لحساب عدد الخلايا نظامًا مشابهًا .

تُعدّ عدادات كولتر وكاسي أرخص بكثير من أجهزة قياس التدفق الخلوي، وهي الخيار الأمثل للتطبيقات التي تتطلب تحديد أعداد وأحجام الخلايا، مثل أبحاث دورة الخلية . وتكمن ميزتها على الطرق المذكورة أعلاه في قدرتها على معالجة عدد كبير من الخلايا في وقت قصير، يصل إلى آلاف الخلايا في الثانية الواحدة، مما يوفر دقة عالية ودلالة إحصائية قوية .

يُعدّ قياس التدفق الخلوي الطريقة الأكثر تطوراً وتكلفةً لعدّ الخلايا. في جهاز قياس التدفق الخلوي، تتدفق الخلايا في تيار ضيق أمام شعاع ليزر . يصطدم الشعاع بالخلايا واحدة تلو الأخرى، ويلتقط كاشف ضوئي الضوء المنعكس منها.

تتمتع أجهزة قياس التدفق الخلوي بالعديد من القدرات الأخرى، مثل تحليل شكل الخلايا وبنيتها الداخلية والخارجية، بالإضافة إلى قياس كمية بروتينات محددة ومواد كيميائية حيوية أخرى في الخلايا. لذلك، نادرًا ما يتم شراء أجهزة قياس التدفق الخلوي لغرض وحيد هو عدّ الخلايا.

تعتمد المناهج الحديثة على استخدام صور مجهرية عالية الجودة، حيث تُستخدم خوارزمية تصنيف إحصائية لإجراء الكشف التلقائي عن الخلايا وعدّها كجزء من مهمة تحليل الصور . ^{[ 4 ]} وتُنفَّذ هذه العملية عادةً بمعدل خطأ ثابت كعملية غير متصلة بالإنترنت (دفعية). ويمكن استخدام مجموعة متنوعة من تقنيات تصنيف الصور لهذا الغرض. ^{[ 5 ]}

في الوقت الحالي، لا يزال العد الخلوي المجسم مع اتخاذ قرار يدوي بشأن إدراج الجسم وفقًا لقواعد العد المجسم غير المتحيزة هو الطريقة الوحيدة الكافية لتحديد كمية الخلايا غير المتحيزة في مقاطع الأنسجة النسيجية، وبالتالي فهو غير كافٍ لأتمتته بالكامل. ^{[ 6 ]}

تكون معلقات الخلايا عكرة . تمتص الخلايا الضوء وتشتته. كلما زاد تركيز الخلايا، زادت العكارة. يمكن لأجهزة قياس الطيف الضوئي قياس شدة الضوء بدقة عالية. توضع مزرعة الخلايا في خلية شفافة ، ويُقاس الامتصاص نسبةً إلى الوسط الغذائي وحده. تتناسب الكثافة الضوئية (OD) طرديًا مع الكتلة الحيوية في معلق الخلايا ضمن نطاق محدد خاص بنوع الخلية. يُعرف استخدام قياس الطيف الضوئي لقياس عكارة المزارع باسم قياس العكارة .

وقد جعل هذا من قياس الطيف الضوئي الطريقة المُفضلة لقياس نمو البكتيريا والتطبيقات ذات الصلة. إلا أن عيب قياس الطيف الضوئي يكمن في عدم قدرته على توفير عدد مطلق أو التمييز بين الخلايا الحية والميتة.

علم الأحياء الدقيقة القائم على المعاوقة هو تقنية ميكروبيولوجية سريعة تُستخدم لقياس تركيز الميكروبات (وخاصة البكتيريا ، ولكن أيضًا الخمائر ) في عينة ما، وذلك من خلال مراقبة الخصائص الكهربائية لوسط النمو. وتعتمد هذه التقنية على حقيقة أن عملية التمثيل الغذائي للبكتيريا تُحوّل المركبات غير المشحونة (أو ضعيفة الشحنة) إلى مركبات عالية الشحنة، مما يُغيّر الخصائص الكهربائية لوسط النمو . ويُقدّر تركيز الميكروبات بناءً على الوقت اللازم لانحراف الخصائص الكهربائية المرصودة عن قيمتها الأساسية الأولية.

تتوفر أجهزة مختلفة (سواء كانت مصنعة في المختبر أو متوفرة تجارياً) لقياس تركيز البكتيريا باستخدام تقنية قياس المعاوقة الكهربائية. ^{[ 7 ] [ 8 ] [ 9 ] [ 10 ] [ 11 ]}