الكروماتوغرافيا

الكروماتوغرافيا العمودية هي تقنية فصل يتم فيها وضع طبقة ثابتة داخل أنبوب. قد تملأ جزيئات الطور الثابت الصلب، أو الدعامة المغطاة بطور ثابت سائل، كامل الحجم الداخلي للأنبوب (عمود معبأ)، أو تتركز على جدار الأنبوب الداخلي أو على طوله، تاركةً مسارًا مفتوحًا وغير مقيد للطور المتحرك في الجزء الأوسط من الأنبوب (عمود أنبوبي مفتوح). تُحسب الاختلافات في معدلات الحركة عبر الوسط وفقًا لأوقات احتجاز العينة المختلفة. ^{[ 12 ] [ 13 ]} في عام 1978، قدم دبليو كلارك ستيل نسخة معدلة من الكروماتوغرافيا العمودية تُسمى كروماتوغرافيا العمود السريع (السريع). ^{[ 14 ] [ 15 ]} تشبه هذه التقنية إلى حد كبير الكروماتوغرافيا العمودية التقليدية، باستثناء أن المذيب يُدفع عبر العمود بتطبيق ضغط موجب. وقد سمح ذلك بإجراء معظم عمليات الفصل في أقل من 20 دقيقة، مع تحسينات ملحوظة في الفصل مقارنةً بالطريقة القديمة. تُباع أنظمة كروماتوغرافيا الفلاش الحديثة على شكل خراطيش بلاستيكية مُعبأة مسبقًا، ويتم ضخ المذيب عبرها. كما يمكن ربط هذه الأنظمة بأجهزة الكشف وجامعات الكسور لتوفير التشغيل الآلي. وقد أدى إدخال مضخات التدرج إلى تسريع عمليات الفصل وتقليل استهلاك المذيب.

في عملية الامتزاز باستخدام طبقة مميعة ، تُستخدم طبقة مميعة بدلاً من الطور الصلب المُصنّع بواسطة طبقة معبأة. وهذا يسمح بالاستغناء عن خطوات التصفية الأولية مثل الطرد المركزي والترشيح، بالنسبة لمزارع الخلايا أو معلقات الخلايا المكسورة.

تعتمد كروماتوغرافيا الفوسفوسليلوز على قوة ارتباط العديد من البروتينات المرتبطة بالحمض النووي بالفوسفوسليلوز. وكلما كان تفاعل البروتين مع الحمض النووي أقوى، زاد تركيز الملح اللازم لفصل ذلك البروتين. ^{[ 16 ]}

الكروماتوغرافيا المستوية هي تقنية فصل يكون فيها الطور الثابت موجودًا على سطح مستوٍ. قد يكون هذا السطح ورقة، إما كطبقة ثابتة أو مشبعة بمادة ما ( كروماتوغرافيا الورق )، أو طبقة من جزيئات صلبة منتشرة على دعامة مثل لوح زجاجي ( كروماتوغرافيا الطبقة الرقيقة ). تقطع المركبات المختلفة في خليط العينة مسافات متفاوتة تبعًا لقوة تفاعلها مع الطور الثابت مقارنةً بالطور المتحرك. ويمكن استخدام معامل الاحتفاظ النوعي (R_{_f} ) لكل مادة كيميائية للمساعدة في تحديد هوية المادة المجهولة.

كروماتوغرافيا الورق

الكروماتوغرافيا الورقية هي تقنية تتضمن وضع نقطة أو خط صغير من محلول العينة على شريط من ورق الكروماتوغرافيا . يوضع الورق في وعاء يحتوي على طبقة رقيقة من المذيب ويُغلق بإحكام. عندما يصعد المذيب عبر الورق، يختلط بمزيج العينة، الذي يبدأ بالصعود مع المذيب. هذا الورق مصنوع من السليلوز ، وهي مادة قطبية ، وتتحرك المركبات الأقل قطبية في المزيج لمسافة أبعد. أما المواد الأكثر قطبية فترتبط بورق السليلوز بسرعة أكبر، وبالتالي لا تقطع مسافة طويلة.

كروماتوغرافيا الطبقة الرقيقة (TLC)

تُعدّ كروماتوغرافيا الطبقة الرقيقة (TLC) تقنية مخبرية شائعة الاستخدام لفصل المواد الكيميائية الحيوية المختلفة بناءً على انجذابها النسبي إلى الطورين الثابت والمتحرك. وهي تُشبه كروماتوغرافيا الورق ، إلا أنها تستخدم طورًا ثابتًا عبارة عن طبقة رقيقة من مادة ماصة ، مثل هلام السيليكا أو الألومينا أو السليلوز، على سطح مستوٍ خامل، بدلًا من الورق . تتميز كروماتوغرافيا الطبقة الرقيقة بتعدد استخداماتها، إذ يُمكن فصل عينات متعددة في وقت واحد على الطبقة نفسها، مما يجعلها مفيدة جدًا في تطبيقات الفحص، مثل اختبار مستويات الأدوية ونقاء المياه. ^{[ 17 ]}

احتمالية التلوث المتبادل منخفضة لأن كل عملية فصل تتم على طبقة جديدة. بالمقارنة مع الورق، تتميز هذه الطريقة بسرعة التشغيل، ودقة الفصل، ودقة التحليل الكمي، وإمكانية اختيار مواد ماصة مختلفة. وللحصول على دقة أعلى وفصل أسرع باستخدام كمية أقل من المذيب، يمكن استخدام كروماتوغرافيا الطبقة الرقيقة عالية الأداء . وكان من الاستخدامات الشائعة سابقًا التمييز بين الكروموسومات من خلال ملاحظة المسافة بينها في الهلام (حيث كان فصلها خطوة منفصلة).

الكروماتوغرافيا الغازية (GC)، والمعروفة أيضًا باسم كروماتوغرافيا الغاز السائل (GLC)، هي تقنية فصل يكون فيها الطور المتحرك غازًا. يُجرى الفصل الكروماتوغرافي الغازي دائمًا في عمود، يكون عادةً "مُعبأً" أو "شعيريًا". تُعد الأعمدة المُعبأة هي الأكثر شيوعًا في الكروماتوغرافيا الغازية، نظرًا لانخفاض تكلفتها وسهولة استخدامها، فضلًا عن أدائها الجيد في أغلب الأحيان. أما الأعمدة الشعرية، فتُوفر عمومًا دقة فصل فائقة، ورغم ارتفاع تكلفتها، إلا أنها أصبحت شائعة الاستخدام، خاصةً مع المخاليط المعقدة. ويمكن تقسيم الأعمدة الشعرية إلى ثلاثة أنواع: أعمدة أنبوبية مفتوحة ذات طبقة مسامية (PLOT)، وأعمدة أنبوبية مفتوحة مطلية الجدران (WCOT)، وأعمدة أنبوبية مفتوحة مطلية بالدعامة (SCOT). تتميز أعمدة PLOT بأن الطور الثابت فيها مُمتص على جدران العمود، بينما في أعمدة WCOT، يكون الطور الثابت مرتبطًا كيميائيًا بجدران العمود. تُعدّ أعمدة SCOT مزيجًا من النوعين المذكورين، إذ تحتوي على جزيئات داعمة ملتصقة بجدرانها، وترتبط هذه الجزيئات كيميائيًا بالطور السائل. ^{[ 19 ]} يُصنع كلا النوعين من الأعمدة من مواد غير ماصة وخاملة كيميائيًا. يُستخدم الفولاذ المقاوم للصدأ والزجاج عادةً في صناعة الأعمدة المعبأة، بينما يُستخدم الكوارتز أو السيليكا المنصهرة في صناعة الأعمدة الشعرية.

تعتمد تقنية كروماتوغرافيا الغاز على توازن توزيع المادة المراد تحليلها بين طور ثابت صلب أو سائل لزج (غالباً ما يكون مادة سائلة أساسها السيليكون) وغاز متحرك (غالباً الهيليوم). يُلصق الطور الثابت بالجدار الداخلي لأنبوب زجاجي أو من السيليكا المنصهرة صغير القطر (عادةً 0.53 - 0.18 مم) (عمود شعري)، أو بمادة صلبة داخل أنبوب معدني أكبر (عمود معبأ). تُستخدم هذه التقنية على نطاق واسع في الكيمياء التحليلية ؛ ورغم أن درجات الحرارة العالية المستخدمة فيها تجعلها غير مناسبة للبوليمرات الحيوية أو البروتينات ذات الوزن الجزيئي العالي (حيث يؤدي التسخين إلى تغيير طبيعتها)، والتي تُصادف بكثرة في الكيمياء الحيوية ، إلا أنها مناسبة تماماً للاستخدام في مجالات البتروكيماويات ، والرصد البيئي ومعالجة التلوث ، والكيمياء الصناعية . كما تُستخدم على نطاق واسع في البحوث الكيميائية.

الاستشراب السائل (LC) هو تقنية فصل يكون فيها الطور المتحرك سائلاً. ويمكن إجراؤها إما في عمود أو في مستوى. ويُطلق على الاستشراب السائل الحديث الذي يستخدم عادةً جزيئات تعبئة صغيرة جدًا وضغطًا عاليًا نسبيًا اسم الاستشراب السائل عالي الأداء .

في تقنية كروماتوغرافيا السائل عالي الأداء (HPLC)، يُدفع العينة بواسطة سائل تحت ضغط عالٍ (الطور المتحرك) عبر عمود معبأ بطور ثابت يتكون من جزيئات غير منتظمة أو كروية الشكل، أو طبقة متجانسة مسامية ، أو غشاء مسامي. تُعرف المواد المتجانسة بأنها "وسائط كروماتوغرافية إسفنجية" ^{[ 2 ]} ، وتتكون من كتلة متصلة من أجزاء عضوية أو غير عضوية. تاريخيًا، تُقسم تقنية HPLC إلى فئتين فرعيتين مختلفتين بناءً على قطبية الطورين المتحرك والثابت. تُسمى الطرق التي يكون فيها الطور الثابت أكثر قطبية من الطور المتحرك (مثل استخدام التولوين كطور متحرك والسيليكا كطور ثابت) كروماتوغرافيا السائل ذات الطور العادي (NPLC)، بينما تُسمى الطرق العكسية (مثل استخدام خليط الماء والميثانول كطور متحرك وC18 ( أوكتاديسيل سيليل ) كطور ثابت) كروماتوغرافيا السائل ذات الطور المعكوس (RPLC).

يُعدّ الاستشراب السائل النانوي (nano-LC) أحد تخصصات الاستشراب السائل. ^{[ 20 ] [ 21 ] [ 22 ]}

الكروماتوغرافيا السائلة فوق الحرجة هي تقنية فصل يكون فيها الطور المتحرك سائلاً فوق درجة حرارته وضغطه الحرجين وقريباً منهما نسبياً.

تعتمد كروماتوغرافيا التقارب ^{[ 23 ] على التفاعل غير التساهمي الانتقائي بين المادة المراد تحليلها وجزيئات محددة. وهي تتميز بدقة عالية، ولكنها ليست قوية جدًا. [ 24 ]} تُستخدم هذه التقنية بكثرة في الكيمياء الحيوية لتنقية البروتينات المرتبطة بعلامات. تُوسَم هذه البروتينات المدمجة بمركبات مثل علامات الهيستيدين ، أو البيوتين، أو المستضدات ، التي ترتبط بالطور الثابت بشكل انتقائي. بعد التنقية، تُزال هذه العلامات عادةً، ويُستخلص البروتين النقي.

تعتمد تقنية كروماتوغرافيا التقارب عادةً على ميل الجزيئات الحيوية إلى الارتباط بأيونات المعادن (الزنك، النحاس، الحديد، إلخ). تُحضّر الأعمدة عادةً يدويًا، ويمكن تصميمها خصيصًا للبروتينات المراد تحليلها. تُستخدم أعمدة التقارب التقليدية كخطوة تحضيرية للتخلص من الجزيئات الحيوية غير المرغوب فيها، أو كخطوة أساسية في تحليل بروتين ذي خصائص فيزيائية غير معروفة. ^{[ 25 ]}

مع ذلك، توجد تقنيات كروماتوغرافيا سائلة تستخدم خصائص كروماتوغرافيا التقارب. تُعد كروماتوغرافيا التقارب المعدني المُثبَّت (IMAC) ^{[ 26 ] [ 27 ]} مفيدة لفصل الجزيئات المذكورة آنفًا بناءً على تقاربها النسبي مع المعدن. غالبًا ما يمكن تحميل هذه الأعمدة بمعادن مختلفة لإنشاء عمود ذي تقارب مُستهدف. ^{[ 28 ]}

تستخدم كروماتوغرافيا التبادل الأيوني (المعروفة أيضًا باسم كروماتوغرافيا الأيونات) آلية التبادل الأيوني لفصل المواد المراد تحليلها بناءً على شحناتها. تُجرى هذه العملية عادةً في أعمدة، ولكنها قد تكون مفيدة أيضًا في الوضع المستوي. تستخدم كروماتوغرافيا التبادل الأيوني طورًا ثابتًا مشحونًا لفصل المركبات المشحونة، بما في ذلك الأنيونات والكاتيونات والأحماض الأمينية والببتيدات والبروتينات . في الطرق التقليدية ، يكون الطور الثابت عبارة عن راتنج تبادل أيوني يحمل مجموعات وظيفية مشحونة تتفاعل مع المجموعات ذات الشحنة المعاكسة في المركب للاحتفاظ بها. يوجد نوعان من كروماتوغرافيا التبادل الأيوني: التبادل الكاتيوني والتبادل الأنيوني. في كروماتوغرافيا التبادل الكاتيوني، يكون للطور الثابت شحنة سالبة ويكون الأيون القابل للتبادل كاتيونًا، بينما في كروماتوغرافيا التبادل الأنيوني، يكون للطور الثابت شحنة موجبة ويكون الأيون القابل للتبادل أنيونًا. ^{[ 29 ]} تُستخدم كروماتوغرافيا التبادل الأيوني بشكل شائع لتنقية البروتينات باستخدام تقنية FPLC .

تُعرف كروماتوغرافيا الاستبعاد الحجمي (SEC) أيضًا باسم كروماتوغرافيا نفاذية الهلام (GPC) أو كروماتوغرافيا ترشيح الهلام ، وهي تفصل الجزيئات وفقًا لحجمها (أو بدقة أكبر وفقًا لقطرها الهيدروديناميكي أو حجمها الهيدروديناميكي). تستطيع الجزيئات الأصغر حجمًا الدخول إلى مسام الوسط، وبالتالي تُحجز وتُزال من تدفق الطور المتحرك. يعتمد متوسط ​​زمن بقاء الجزيئات في المسام على الحجم الفعال لجزيئات المادة المراد تحليلها. مع ذلك، تُستبعد الجزيئات الأكبر من متوسط ​​حجم مسام الحشوة، وبالتالي لا تخضع لأي احتجاز يُذكر؛ وتكون هذه الجزيئات أول ما يُفصل. تُعد هذه التقنية عمومًا تقنية كروماتوغرافيا منخفضة الدقة، ولذلك غالبًا ما تُستخدم في الخطوة النهائية، أو ما يُعرف بـ"التنقية النهائية"، لعملية التنقية. كما أنها مفيدة لتحديد البنية الثالثية والرباعية للبروتينات المنقاة، خاصةً أنها تُجرى في ظروف المحلول الطبيعية.

يتألف عمود الفصل الكروماتوغرافي ذو الطبقة الموسعة (EBA) المستخدم في عملية الفصل الكيميائي الحيوي من موزع سائل لمعادلة الضغط، يتميز بوظيفة التنظيف الذاتي، ويقع أسفل صفيحة غربال مسامية مانعة للتدفق في قاع الطبقة الموسعة. كما يحتوي على مجموعة فوهات علوية ذات وظيفة تنظيف عكسي في أعلى الطبقة الموسعة. ويضمن التوزيع الأمثل لسائل التغذية المضاف إلى الطبقة الموسعة أن يكون تدفق السائل المار عبرها انسيابيًا. وتتميز الطبقة الموسعة بانسيابية التدفق. ويُسهم عمود الفصل الكروماتوغرافي ذو الطبقة الموسعة في زيادة كفاءة الفصل.

تُعدّ كروماتوغرافيا الامتزاز في طبقة مُوسّعة (EBA) تقنيةً ملائمةً وفعّالةً لاستخلاص البروتينات مباشرةً من العينات الخام غير المُصفّاة. في هذه التقنية، تُوسّع الطبقة المُرَسَّبة أولًا بتدفق محلول التوازن إلى الأعلى. ثم تُمرّر العينة الخام، وهي خليط من البروتينات الذائبة والملوثات والخلايا وبقاياها، إلى الأعلى عبر الطبقة المُوسّعة. تُستخلص البروتينات المستهدفة على المادة المازّة، بينما تمرّ الجسيمات والملوثات. يؤدي تغيير محلول الإذابة مع الحفاظ على التدفق إلى الأعلى إلى إزالة امتزاز البروتين المستهدف في وضع الطبقة المُوسّعة. أما في حال عكس اتجاه التدفق، فتترسب الجسيمات الممتزة بسرعة، ويمكن إزالة امتزاز البروتينات باستخدام محلول الإذابة. يعتمد اختيار وضع الإذابة (الطبقة المُوسّعة أو الطبقة المُرَسَّبة) على خصائص العينة الخام. بعد الإذابة، تُنظّف المادة المازّة بمحلول تنظيف مُحدّد مسبقًا (CIP)، ويتبع التنظيف إما تجديد العمود (لإعادة استخدامه) أو تخزينه.

الكروماتوغرافيا ذات الطور المعكوس (RPC) هي أي إجراء من إجراءات الكروماتوغرافيا السائلة يكون فيه الطور المتحرك أكثر قطبية بشكل ملحوظ من الطور الثابت. سُميت بهذا الاسم لأن الطور المتحرك في الكروماتوغرافيا السائلة ذات الطور العادي يكون أقل قطبية بشكل ملحوظ من الطور الثابت. تميل الجزيئات الكارهة للماء في الطور المتحرك إلى الامتزاز على الطور الثابت الكاره للماء نسبيًا، بينما تميل الجزيئات المحبة للماء في الطور المتحرك إلى الخروج أولًا. تتكون أعمدة الفصل عادةً من سلسلة كربونية C8 أو C18 مرتبطة بركيزة من جزيئات السيليكا.

كروماتوغرافيا التفاعل الكاره للماء (HIC) هي تقنية تنقية وتحليل تفصل المواد المراد تحليلها، مثل البروتينات، بناءً على التفاعلات الكارهة للماء بين هذه المادة ومصفوفة الكروماتوغرافيا. توفر هذه التقنية منهجًا متعامدًا غير مُشوِّه لفصل الطور المعكوس، مما يحافظ على البنية الأصلية للبروتين وربما نشاطه. في كروماتوغرافيا التفاعل الكاره للماء، تُستبدل مادة المصفوفة بمجموعات كارهة للماء بشكل طفيف. تتراوح هذه المجموعات بين مجموعات الميثيل، والإيثيل، والبروبيل، والبيوتيل، والأوكتيل، والفينيل. ^{[ 30 ]} عند تركيزات الملح العالية، تتفاعل السلاسل الجانبية غير القطبية على سطح البروتينات مع المجموعات الكارهة للماء؛ أي أن كلا النوعين من المجموعات يُستبعدان بواسطة المذيب القطبي (تتعزز التأثيرات الكارهة للماء بزيادة القوة الأيونية). بالتالي، تُوضع العينة على العمود في محلول منظم شديد القطبية، مما يؤدي إلى ارتباط البقع الكارهة للماء على المادة المراد تحليلها بالطور الثابت. عادةً ما يكون المذيب المستخدم محلولًا منظمًا مائيًا بتركيزات ملحية متناقصة، أو تركيزات متزايدة من المنظفات (التي تُعطّل التفاعلات الكارهة للماء)، أو تغييرات في الرقم الهيدروجيني. ويُعدّ نوع الملح المستخدم بالغ الأهمية، حيث توفر الأملاح الأكثر كزموتروبية، وفقًا لسلسلة هوفمايستر، أكبر قدر من بنية الماء حول الجزيء، مما ينتج عنه ضغط كاره للماء. ويُستخدم كبريتات الأمونيوم بشكل متكرر لهذا الغرض. وقد يُساعد إضافة المذيبات العضوية أو المكونات الأخرى الأقل قطبية في تحسين الفصل.

بشكل عام، تُعدّ كروماتوغرافيا التفاعل الكاره للماء (HIC) مفيدةً إذا كانت العينة حساسة لتغيرات الرقم الهيدروجيني أو للمذيبات القوية المستخدمة عادةً في أنواع الكروماتوغرافيا الأخرى، ولكن ليس لتركيزات الملح العالية. عادةً ما يتم تغيير كمية الملح في المحلول المنظم. في عام 2012، وصف مولر وفرانزريب تأثيرات درجة الحرارة على كروماتوغرافيا التفاعل الكاره للماء باستخدام ألبومين مصل البقر (BSA) مع أربعة أنواع مختلفة من الراتنجات الكارهة للماء . غيّرت الدراسة درجة الحرارة للتأثير على ألفة ارتباط ألبومين مصل البقر بالمصفوفة. وخلصت الدراسة إلى أن تغيير درجة الحرارة من 40 إلى 10 درجات مئوية لن يكون كافيًا لغسل جميع ألبومين مصل البقر من المصفوفة بشكل فعال، ولكنه قد يكون فعالًا جدًا إذا تم استخدام العمود مرات قليلة فقط. ^{[ 31 ]} يُتيح استخدام درجة الحرارة لإحداث تغيير للمختبرات خفض تكاليف شراء الملح وتوفير المال.

لتجنب التركيزات العالية للأملاح وتقلبات درجات الحرارة، يمكن استخدام مادة أكثر كراهية للماء للتنافس مع العينة وفصلها. وقد أظهرت هذه الطريقة، المعروفة باسم طريقة كروماتوغرافيا التفاعل الكاره للماء (HIC) غير المعتمدة على الملح، عزلًا مباشرًا للغلوبولين المناعي البشري G (IgG) من المصل بنسبة إنتاج مرضية، وذلك باستخدام بيتا-سيكلودكسترين كمنافس لإزاحة IgG من المادة الأساسية. ^{[ 32 ]} وهذا يفتح المجال واسعًا لاستخدام HIC مع العينات الحساسة للملح، حيث أن التركيزات العالية للأملاح تؤدي إلى ترسيب البروتينات.

كروماتوغرافيا التفاعل المحب للماء ( HILIC ) هي نوع من أنواع الكروماتوغرافيا السائلة التي تستخدم طورًا ثابتًا محبًا للماء وطورًا متحركًا عالي المحتوى العضوي لفصل المواد المراد تحليلها بناءً على قطبيتها . ^{[ 33 ]} تشبه HILIC كروماتوغرافيا الطور العكسي في تركيب طورها المتحرك، كما تشبه كروماتوغرافيا الطور العادي في طورها الثابت القطبي، ولكنها تختلف عنها في آلياتها. ^{[ 34 ] [ 35 ]} تخرج المواد الأكثر كراهية للماء أولًا، بترتيب معاكس عمومًا لكروماتوغرافيا الطور العكسي. ^{[ 36 ]} في HILIC، تتوزع المواد المراد تحليلها بين الطور المتحرك الغني بالمواد العضوية وطبقة غنية بالماء تتشكل على سطح الطور الثابت القطبي، ^{[ 35 ]} حيث تتمتع المواد الأكثر قطبية بتفاعلات أقوى وتبقى على العمود لفترة أطول. ^{[ 37 ]} تساهم الروابط الهيدروجينية والتفاعلات الكهروستاتيكية مع الطور الثابت أيضًا في آلية الفصل. ^{[ 38 ]} يمكن استخدام تقنية HILIC مع نظام محلول منظم متساوي التركيز، ولكنها تُستخدم بشكل أكثر شيوعًا مع نظام متدرج، مما يزيد من محبة الماء للمحلول المنظم عن طريق زيادة محتواه المائي، وبالتالي يتم فصل المزيد من المواد التحليلية المحبة للماء. ^{[ 36 ]}

يمكن استخدام تقنية HILIC لفصل أنواع عديدة من المواد التحليلية، ولكنها شائعة الاستخدام في دراسات علم الأيض، حيث تُعدّ مناسبةً لفصل المستقلبات القطبية. ^{[ 39 ] [ 38 ]} وتُعتبر تقنية HILIC تقنيةً مُكمّلةً لتقنية كروماتوغرافيا الطور العكسي، ويمكن دمجها معها كنهجٍ مُكمّلٍ لتغطيةٍ أشمل. ^{[ 40 ] [ 36 ]}

تُستمد تقنية الكروماتوغرافيا الهيدروديناميكية (HDC) من ظاهرة ملحوظة، وهي أن القطرات الكبيرة تتحرك أسرع من القطرات الصغيرة. ^{[ 41 ]} في العمود، يحدث هذا لأن مركز كتلة القطرات الكبيرة لا يكون قريبًا من جوانب العمود كما هو الحال مع القطرات الصغيرة، وذلك بسبب حجمها الأكبر. ^{[ 42 ]} تخرج القطرات الكبيرة أولًا من منتصف العمود، بينما تلتصق القطرات الصغيرة بجوانبه وتخرج أخيرًا. يُعد هذا النوع من الكروماتوغرافيا مفيدًا لفصل المواد المراد تحليلها حسب الكتلة المولية (أو الكتلة الجزيئية)، والحجم، والشكل، والبنية، عند استخدامه مع كاشفات تشتت الضوء ، ومقاييس اللزوجة ، ومقاييس الانكسار . ^{[ 43 ]} النوعان الرئيسيان من الكروماتوغرافيا الهيدروديناميكية هما الأنبوب المفتوح والعمود المعبأ . يوفر الأنبوب المفتوح أوقات فصل سريعة للجسيمات الصغيرة، بينما يمكن للعمود المعبأ زيادة الدقة، وهو أنسب للجسيمات ذات متوسط ​​كتلة جزيئية أكبر من 100 ميكرومتر.${\displaystyle 10^{5}}$دالتون . ^{[ 44 ]} يختلف الفصل الكروماتوغرافي عالي الكثافة عن أنواع الكروماتوغرافيا الأخرى لأن الفصل يحدث فقط في الحجم البيني، وهو الحجم المحيط بالجسيمات وبينها في عمود معبأ. ^{[ 45 ]}

تتشابه تقنية الفصل الكروماتوغرافي عالي الكثافة (HDC) مع تقنية الفصل الكروماتوغرافي الاستبعادي الحجمي (SEC) في ترتيب الإذابة، إلا أن العمليتين تختلفان في جوانب عديدة. ^{[ 44 ]} في دراسة قارنت بين نوعي الفصل، استخدم كل من إيزنبرغ وبروير وكوتيه وستريغل كلا الطريقتين لتوصيف عديدات السكاريد، وخلصوا إلى أن تقنية الفصل الكروماتوغرافي عالي الكثافة المقترنة بتشتت الضوء متعدد الزوايا (MALS) تحقق توزيعًا أكثر دقة للكتلة المولية مقارنةً بتقنية MALS غير المتصلة بالإنترنت، وذلك في وقت أقل بكثير من تقنية SEC. ^{[ 46 ]} ويعود ذلك في الغالب إلى كون تقنية SEC أكثر تدميرًا للمادة المراد تحليلها، نظرًا لأن مسام العمود تعمل على تحلل المادة أثناء الفصل، مما يؤثر على توزيع الكتلة. ^{[ 46 ]} ومع ذلك، فإن العيب الرئيسي لتقنية HDC هو انخفاض دقة قمم المادة المراد تحليلها، مما يجعل تقنية SEC خيارًا أكثر جدوى عند استخدامها مع المواد الكيميائية التي يصعب تحللها، وعندما لا تكون سرعة الإذابة مهمة. ^{[ 47 ]}

يلعب الفصل بالتيار المتردد (HDC) دورًا بالغ الأهمية في مجال الموائع الدقيقة . وقد اقترح تشميلا وزملاؤه أول جهاز ناجح لنظام HDC-on-a-chip في عام 2002. ^{[ 48 ]} تمكن تصميمهم من تحقيق عمليات فصل باستخدام  قناة طولها 80 مم خلال 3 دقائق لجزيئات بأقطار تتراوح بين 26 و110  نانومتر، إلا أن الباحثين أشاروا إلى ضرورة تحسين معايير الاحتفاظ والتشتت . [ ^{48 ] وفي} دراسة نُشرت عام 2010 من قِبل جيليما وماركستاين وويسترويل وفيربورت، أدى تطبيق تقنية HDC مع تدفق ثنائي الاتجاه معاد تدويره إلى فصل عالي الدقة يعتمد على الحجم باستخدام  قناة طولها 3 مم فقط. ^{[ 49 ]} وقد اعتُبر وجود قناة قصيرة كهذه ودقة عالية أمرًا مثيرًا للإعجاب، لا سيما بالنظر إلى أن الدراسات السابقة استخدمت قنوات  بطول 80 مم. ^{[ 48 ]} وفي تطبيق بيولوجي، قام هوه وزملاؤه في عام 2007... اقترح الباحثون جهاز فرز دقيق يعتمد على تقنية الفصل بالتدفق المغناطيسي والجاذبية، والذي كان مفيدًا في منع دخول الجسيمات الخطرة المحتملة التي يزيد قطرها عن 6 ميكرونات إلى مجرى الدم عند حقن عوامل التباين في فحوصات الموجات فوق الصوتية . ^{[ 50 ]} كما حققت هذه الدراسة تقدمًا في مجال الاستدامة البيئية في تقنية الموائع الدقيقة نظرًا لعدم وجود إلكترونيات خارجية تتحكم في التدفق، وهو ما يُعد ميزة لاستخدام جهاز يعتمد على الجاذبية.

في بعض الحالات، قد لا تكون الانتقائية التي يوفرها استخدام عمود واحد كافية لفصل المواد المراد تحليلها في العينات المعقدة. يهدف الفصل الكروماتوغرافي ثنائي الأبعاد إلى زيادة دقة فصل هذه القمم باستخدام عمود ثانٍ ذي خصائص فيزيائية وكيميائية مختلفة ( تصنيف كيميائي ). ^{[ 51 ] [ 52 ]} ولأن آلية الاحتفاظ على هذا الدعامة الصلبة الجديدة تختلف عن الفصل أحادي البعد، فمن الممكن فصل مركبات لا يمكن تمييزها بالفصل الكروماتوغرافي أحادي البعد باستخدام الفصل الكروماتوغرافي ثنائي الأبعاد. علاوة على ذلك، يحدث الفصل في البعد الثاني أسرع من البعد الأول. ^{[ 51 ]} ومن أمثلة الفصل باستخدام الفصل الكروماتوغرافي ثنائي الأبعاد وضع العينة في إحدى زوايا صفيحة مربعة، ثم تطويرها، وتجفيفها بالهواء، ثم تدويرها بزاوية 90 درجة، وعادةً ما يُعاد تطويرها في نظام مذيب ثانٍ.

يمكن تطبيق تقنية الكروماتوغرافيا ثنائية الأبعاد على عمليات الفصل باستخدام كروماتوغرافيا الغاز أو كروماتوغرافيا السائل. ^{[ 51 ] [ 52 ]} تعتمد طريقة "القطع القلبي" على اختيار منطقة محددة ذات أهمية في البعد الأول للفصل، ^{[ 53 ]} بينما تستخدم الطريقة الشاملة جميع المواد المراد تحليلها في البعد الثاني. ^{[ 51 ] [ 52 ]}

تقنية السرير المتحرك المحاكي (SMB) هي نوع من أنواع كروماتوغرافيا السائل عالي الأداء (HPLC)، وتُستخدم لفصل الجزيئات و/أو المركبات الكيميائية التي يصعب أو يستحيل فصلها بطرق أخرى. ويتحقق هذا الفصل المُحسّن من خلال نظام صمامات وأعمدة يُستخدم لإطالة الطور الثابت إلى أجل غير مسمى. في تقنية السرير المتحرك في كروماتوغرافيا التحضير، يكون دخول المادة المغذية واستخلاص المادة المراد تحليلها متزامنين ومستمرين، ولكن نظرًا للصعوبات العملية في استخدام سرير متحرك باستمرار، تم اقتراح تقنية السرير المتحرك المحاكي. في هذه التقنية، بدلًا من تحريك السرير نفسه، يتم تحريك موضعَي دخول العينة وخروج المادة المراد تحليلها باستمرار، مما يُعطي انطباعًا بحركة السرير. أما كروماتوغرافيا السرير المتحرك الحقيقي (TMBC) فهي مفهوم نظري فقط، ويتم تحقيق محاكاتها، أي تقنية السرير المتحرك المحاكي، باستخدام عدد من الأعمدة المتصلة على التوالي ونظام صمامات معقد. يوفر ترتيب الصمام هذا تغذية العينة والمذيب وإخراج المادة المراد تحليلها والنفايات في المواقع المناسبة لأي عمود، مما يسمح بالتبديل على فترات منتظمة بين إدخال العينة في اتجاه واحد، وإدخال المذيب في الاتجاه المعاكس، مع تغيير مواضع إخراج المادة المراد تحليلها والنفايات بشكل مناسب أيضًا.

التحليل الحراري - كروماتوغرافيا الغاز - مطياف الكتلة هو طريقة للتحليل الكيميائي يتم فيها تسخين العينة حتى تتحلل لإنتاج جزيئات أصغر يتم فصلها بواسطة كروماتوغرافيا الغاز والكشف عنها باستخدام مطياف الكتلة.

التحلل الحراري هو عملية التفكك الحراري للمواد في جو خامل أو في فراغ. تُوضع العينة في تماس مباشر مع سلك بلاتيني، أو في أنبوب عينة كوارتزي، وتُسخّن بسرعة إلى 600-1000  درجة مئوية. وتُستخدم درجات حرارة أعلى حسب التطبيق. تُستخدم ثلاث تقنيات تسخين مختلفة في أجهزة التحلل الحراري: الفرن متساوي الحرارة، والتسخين الحثي (باستخدام خيوط نقطة كوري)، والتسخين المقاوم باستخدام خيوط بلاتينية. تنشطر الجزيئات الكبيرة عند أضعف نقاطها، مُنتجةً شظايا أصغر وأكثر تطايرًا. يمكن فصل هذه الشظايا بواسطة كروماتوغرافيا الغاز. عادةً ما تكون مخططات كروماتوغرافيا الغاز للتحلل الحراري معقدة نظرًا لتكوّن مجموعة واسعة من نواتج التحلل المختلفة. يمكن استخدام البيانات كبصمات لإثبات هوية المادة، أو تُستخدم بيانات كروماتوغرافيا الغاز/مطياف الكتلة لتحديد الشظايا الفردية والحصول على معلومات هيكلية. لزيادة تطاير الشظايا القطبية، يمكن إضافة كواشف مثيلة مختلفة إلى العينة قبل التحلل الحراري.

إلى جانب استخدام أجهزة التحلل الحراري المتخصصة، يمكن إجراء تحليل كروماتوغرافيا الغاز للتحلل الحراري للعينات الصلبة والسائلة مباشرةً داخل حاقنات المبخر ذي درجة الحرارة القابلة للبرمجة (PTV)، والتي توفر تسخينًا سريعًا (يصل إلى 30  درجة مئوية/ثانية) ودرجات حرارة قصوى عالية تتراوح بين 600 و650  درجة مئوية. وهذا كافٍ لبعض تطبيقات التحلل الحراري. وتتمثل الميزة الرئيسية في عدم الحاجة إلى شراء جهاز متخصص، حيث يمكن إجراء التحلل الحراري كجزء من تحليل كروماتوغرافيا الغاز الروتيني. في هذه الحالة، يجب استخدام بطانات مدخل كروماتوغرافيا الغاز المصنوعة من الكوارتز. ويمكن الحصول على بيانات كمية، كما نُشرت نتائج جيدة لعملية الاشتقاق داخل حاقن PTV.

يُعدّ الفصل الكروماتوغرافي السريع للبروتينات (FPLC) أحد أنواع الكروماتوغرافيا السائلة، ويُستخدم غالبًا لتحليل أو تنقية مخاليط البروتينات. وكما هو الحال في أنواع الكروماتوغرافيا الأخرى، يُمكن الفصل نظرًا لاختلاف ميل مكونات الخليط لمادتين: سائل متحرك (الطور المتحرك) ومادة صلبة مسامية (الطور الثابت). في تقنية FPLC، يكون الطور المتحرك محلولًا مائيًا، أو ما يُعرف بـ"المحلول المنظم". ويتم التحكم في معدل تدفق المحلول المنظم بواسطة مضخة إزاحة موجبة، ويُحافظ عليه ثابتًا عادةً، بينما يُمكن تغيير تركيبه عن طريق سحب سوائل بنسب مختلفة من خزانين خارجيين أو أكثر. أما الطور الثابت، فهو عبارة عن راتنج مُكوّن من حبيبات، عادةً من الأغاروز المتشابك ، مُعبأة في عمود أسطواني من الزجاج أو البلاستيك. وتتوفر راتنجات FPLC بأحجام حبيبات وروابط سطحية متنوعة، وذلك حسب التطبيق.

الكروماتوغرافيا ذات التيار المعاكس (CCC) هي نوع من أنواع الكروماتوغرافيا السائلة-السائلة، حيث تكون كل من المرحلة الثابتة والمتحركة سوائل، ويتم تثبيت المرحلة الثابتة السائلة بواسطة قوة طرد مركزي قوية. ^{[ 54 ]}

على عكس كروماتوغرافيا التيار المعاكس (انظر أعلاه)، تستخدم كروماتوغرافيا التيار المعاكس الدورية (PCC) طورًا ثابتًا صلبًا وطورًا متحركًا سائلًا فقط. ولذلك فهي أقرب إلى كروماتوغرافيا التقارب التقليدية منها إلى كروماتوغرافيا التيار المعاكس. تستخدم PCC أعمدة متعددة، يتم توصيلها على التوالي أثناء مرحلة التحميل. يسمح هذا النمط بتحميل العمود الأول في هذه السلسلة بشكل زائد دون فقدان المنتج، الذي يتسرب بالفعل عبر العمود قبل تشبع الراتنج بالكامل. يتم التقاط المنتج المتسرب على العمود (الأعمدة) التالية. في الخطوة التالية، يتم فصل الأعمدة عن بعضها البعض. يتم غسل العمود الأول وفصله، بينما لا يزال يتم تحميل العمود (الأعمدة) الأخرى. بمجرد إعادة توازن العمود الأول (مبدئيًا)، يتم إعادته إلى تيار التحميل، ولكن كآخر عمود. ثم تستمر العملية بشكل دوري.

تتضمن الكروماتوغرافيا الكيرالية فصل المتصاوغات الفراغية . في حالة المتصاوغات المرآتية، لا توجد فروق كيميائية أو فيزيائية بينها سوى كونها صورًا معكوسة ثلاثية الأبعاد. ولإتمام عمليات الفصل الكيرالي، يجب أن يكون الطور المتحرك أو الطور الثابت كيراليًا، مما يُعطي تقاربًا مختلفًا بين المواد المراد تحليلها. تتوفر أعمدة كروماتوغرافيا السائل عالي الأداء (HPLC) الكيرالية (ذات الطور الثابت الكيرالي) في كلٍ من الطور العادي والطور المعكوس تجاريًا.

لا تستطيع تقنيات الاستشراب التقليدية فصل المخاليط الراسيمية من المتماكبات الضوئية. مع ذلك، في بعض الحالات، قد يتم فصل مخاليط غير راسيمية من المتماكبات الضوئية بشكل غير متوقع باستخدام الاستشراب السائل التقليدي (مثل الاستشراب السائل عالي الأداء بدون طور متحرك أو طور ثابت كيرالي). ^{[ 55 ] [ 56 ]}

تتميز كروماتوغرافيا الطور العادي المائي (ANP) بسلوك الإذابة في نمط الطور العادي الكلاسيكي (أي عندما يكون الطور المتحرك أقل قطبية بشكل ملحوظ من الطور الثابت)، حيث يُعد الماء أحد مكونات نظام المذيب في الطور المتحرك. وتختلف عن كروماتوغرافيا التفاعل الهيدروفيلي السائل (HILIC) في أن آلية الاحتفاظ فيها تعود إلى الامتزاز وليس التوزيع. ^{[ 57 ]}