الليزوزيم

الليزوزيم ( EC 3.2.1.17 ، موراميداز، N- أسيتيل موراميد جليكانهيدرولاز ؛ الاسم النظامي ببتيدوجليكان N- أسيتيل مورامويلهيدرولاز ) هو إنزيم مضاد للميكروبات تنتجه الحيوانات ويشكل جزءًا من الجهاز المناعي الفطري .

هو إنزيم هيدرولاز جليكوسيدي يحفز العملية التالية:

تحلل الروابط (1→4)-β بين حمض N- أسيتيل موراميك وبقايا N- أسيتيل- D- جلوكوزامين في الببتيدوغليكان وبين بقايا N- أسيتيل- D- جلوكوزامين في الكيتوديكسترينات ( الدكسترينات المشتقة من الكيتين )

يُعد الببتيدوغليكان المكون الرئيسي لجدار الخلية البكتيرية موجبة الجرام . ^{[ 1 ]} ويؤدي هذا التحلل بدوره إلى إضعاف سلامة جدران الخلايا البكتيرية مما يتسبب في تحلل البكتيريا.

يُعد الليزوزيم وفيرًا في الإفرازات ، بما في ذلك الدموع واللعاب وحليب الأم والمخاط . كما يوجد في الحبيبات السيتوبلازمية للخلايا البلعمية والعدلات متعددة النوى . ويمكن العثور على كميات كبيرة من الليزوزيم في بياض البيض . ترتبط الليزوزيمات من النوع C ارتباطًا وثيقًا ببروتين ألفا -لاكتالبومين من حيث التسلسل والبنية، مما يجعلها جزءًا من نفس عائلة الهيدرولازات الغليكوزيدية 22. [ ^{2 ] في} البشر، يُشفّر إنزيم الليزوزيم من النوع C بواسطة جين LYZ . ^{[ 3 ] [ 4 ]}

يتميز الليزوزيم الموجود في بياض بيض الدجاج بثباته الحراري، حيث تصل درجة انصهاره إلى 72  درجة مئوية عند درجة حموضة 5.0. ^{[ 5 ]} مع ذلك، يفقد الليزوزيم الموجود في حليب الأم نشاطه بسرعة كبيرة عند هذه الدرجة. ^{[ 6 ]} ويحافظ الليزوزيم الموجود في بياض بيض الدجاج على نشاطه ضمن نطاق واسع من درجات الحموضة (6-9). ^{[ 7 ]} وتبلغ درجة تعادله الكهربائي 11.35 . ^{[ 7 ]} أما درجة التعادل الكهربائي لليزوزيم الموجود في حليب الأم فتتراوح بين 10.5 و11. ^{[ 8 ]}

يعمل الإنزيم عن طريق تحليل الروابط الجليكوسيدية في الببتيدوغليكان . كما يمكن للإنزيم أن يكسر الروابط الجليكوسيدية في الكيتين ، وإن لم يكن بنفس فعالية الكيتينازات الحقيقية . ^{[ 9 ]}

يرتبط الموقع النشط لليزوزيم بجزيء الببتيدوغليكان في الشق البارز بين نطاقيه. ويهاجم الببتيدوغليكان (الموجود في جدران خلايا البكتيريا، وخاصة البكتيريا موجبة الجرام )، وهو ركيزته الطبيعية ، بين حمض N- أسيتيل موراميك (NAM) وذرة الكربون الرابعة من N-أسيتيل جلوكوزامين (NAG).

أظهرت السكريات الأقصر ، مثل رباعي السكاريد، أنها ركائز فعالة، ولكن عبر وسيط ذي سلسلة أطول. ^{[ 10 ]} كما ثبت أن الكيتين ركيزة فعالة لليزوزيم. وقد طُوّرت ركائز اصطناعية واستُخدمت في الليزوزيم. ^{[ 11 ]}

الآلية

فيليبس

اقترحت آلية فيليبس أن القدرة التحفيزية للإنزيم تنبع من كلٍّ من الإجهاد الفراغي على الركيزة المرتبطة والاستقرار الكهروستاتيكي لمركب وسيط من نوع أوكسو-كاربينيوم . استنادًا إلى بيانات علم البلورات بالأشعة السينية، اقترح فيليبس الموقع النشط للإنزيم، حيث يرتبط سداسي السكاريد. يقوم الليزوزيم بتشويه السكر الرابع (في الموقع الفرعي D أو -1) في سداسي السكاريد إلى شكل نصف كرسي. في هذه الحالة المُجهدة، يسهل كسر الرابطة الجليكوسيدية. ^{[ 12 ]} يتكون مركب وسيط أيوني يحتوي على أوكسو-كاربينيوم نتيجةً لكسر الرابطة الجليكوسيدية. ^{[ 13 ]} وبالتالي، فإن التشوه الذي يجعل جزيء الركيزة يتخذ شكلًا مُجهدًا مشابهًا لشكل الحالة الانتقالية سيخفض حاجز الطاقة للتفاعل. ^{[ 14 ]}

افترض أرييه وارشيل عام 1978 أن وسيط الأكسو-كربونيوم المقترح يتم تثبيته كهروستاتيكيًا بواسطة بقايا الأسبارتات والغلوتامات في الموقع النشط. استندت حجة التثبيت الكهروستاتيكي إلى المقارنة بالماء السائب، حيث يمكن لإعادة توجيه ثنائيات أقطاب الماء أن تلغي طاقة التثبيت الناتجة عن تفاعل الشحنات. في نموذج وارشيل، يعمل الإنزيم كمذيب فائق، مما يثبت اتجاه أزواج الأيونات ويوفر ذوبانًا فائقًا (تثبيتًا ممتازًا لأزواج الأيونات)، وخاصةً خفض الطاقة عندما يكون أيونان قريبين من بعضهما البعض. ^{[ 15 ]}

تُعدّ الخطوة المحددة لمعدل التفاعل (RDS) في هذه الآلية مرتبطة بتكوين وسيط أوكسو-كاربينيوم . وقد ظهرت بعض النتائج المتضاربة لتحديد الخطوة المحددة لمعدل التفاعل بدقة. ومن خلال تتبع تكوين الناتج ( بارا-نيتروفينول )، تبيّن أن الخطوة المحددة لمعدل التفاعل تتغير باختلاف درجات الحرارة، وهو ما يُفسّر تلك النتائج المتضاربة. فعند درجات الحرارة المرتفعة، تكون الخطوة المحددة لمعدل التفاعل هي تكوين وسيط إنزيمي جليكوزيلي، بينما عند درجات الحرارة المنخفضة، تكون الخطوة المحددة لمعدل التفاعل هي تحلل هذا الوسيط. ^{[ 16 ]}

الآلية التساهمية

في نقاش مبكر عام 1969، اقترح دالكوست آلية تساهمية لليزوزيم بناءً على تأثير النظائر الحركية ، ^{[ 13 ]} ولكن لفترة طويلة، كانت الآلية الأيونية هي الأكثر قبولًا. في عام 2001، اقترح فوكادلو آلية منقحة عبر وسيط تساهمي وليس أيوني. أشارت أدلة من تحليل ESI - MS إلى وجود وسيط تساهمي. استُخدم ركيزة مُستبدلة بـ2-فلورو لخفض معدل التفاعل وتجميع وسيط لتوصيفه. ^{[ 18 ]} وُجد أن السلاسل الجانبية للأحماض الأمينية، حمض الجلوتاميك 35 (Glu35) والأسبارتات 52 (Asp52)، ضرورية لنشاط هذا الإنزيم. يعمل Glu35 كمانح للبروتون للرابطة الجليكوسيدية، مما يؤدي إلى كسر رابطة CO في الركيزة، بينما يعمل Asp52 ككاشف نيوكليوفيلي لتوليد وسيط إنزيم جليكوزيلي. يتفاعل حمض الجلوتاميك 35 مع الماء لتكوين أيون الهيدروكسيل، وهو نيوكليوفيل أقوى من الماء، والذي يهاجم بدوره وسيط الإنزيم الجليكوزيلي، مُنتجًا ناتج التحلل المائي دون تغيير في الإنزيم. ^{[ 19 ]} وقد اقترح كوشلاند هذا النوع من الآلية التساهمية لتحفيز الإنزيم لأول مرة . ^{[ 20 ]}

في الآونة الأخيرة، استُخدمت محاكاة الديناميكا الجزيئية باستخدام ميكانيكا الكم/الميكانيكا الجزيئية (QM/MM) مع بلورة إنزيم HEWL، وتنبأت بوجود وسيط تساهمي. ^{[ 21 ]} تشير الأدلة المستقاة من تحليل ESI-MS وبنية الأشعة السينية إلى وجود هذا الوسيط، لكنها تعتمد بشكل أساسي على استخدام طفرة أقل نشاطًا أو ركيزة غير أصلية. بالتالي، توفر محاكاة الديناميكا الجزيئية QM/MM القدرة الفريدة على دراسة آلية عمل إنزيم HEWL من النوع البري والركيزة الأصلية بشكل مباشر. كشفت الحسابات أن الوسيط التساهمي الناتج عن الآلية التساهمية أكثر استقرارًا بحوالي 30 كيلو كالوري/مول من الوسيط الأيوني الناتج عن آلية فيليبس. ^{[ 21 ]} تُظهر هذه الحسابات أن الوسيط الأيوني غير مواتٍ طاقيًا للغاية، وأن الوسائط التساهمية التي لوحظت في التجارب باستخدام طفرات أقل نشاطًا أو ركائز غير أصلية تُقدم رؤى مفيدة حول آلية عمل إنزيم HEWL من النوع البري.

الليزوزيم جزء من جهاز المناعة الفطرية. وقد ارتبط انخفاض مستويات الليزوزيم بخلل التنسج القصبي الرئوي لدى حديثي الولادة. ^{[ 34 ]} يمكن لصغار الخنازير التي تتغذى على حليب يحتوي على الليزوزيم البشري أن تتعافى من الإسهال الناجم عن بكتيريا الإشريكية القولونية بشكل أسرع. يبلغ تركيز الليزوزيم في حليب الأم من 1600 إلى 3000 ضعف تركيزه في حليب الماشية. الليزوزيم البشري أكثر نشاطًا من الليزوزيم الموجود في بياض بيض الدجاج. تم تطوير سلالة معدلة وراثيًا من الماعز (مؤسستها تُدعى "أرتميس") لإنتاج حليب يحتوي على الليزوزيم البشري لحماية الأطفال من الإسهال في حال عدم حصولهم على فوائد الرضاعة الطبيعية. ^{[ 35 ] [ 36 ]}

بما أن الليزوزيم يُعدّ شكلاً طبيعياً من أشكال الحماية ضد مسببات الأمراض موجبة الغرام مثل العصيات والمكورات العقدية ، ^{[ 37 ]} فإنه يلعب دوراً هاماً في مناعة الرضع الذين يرضعون رضاعة طبيعية. ^{[ 38 ]} في حين أن الجلد يُشكّل حاجزاً واقياً نظراً لجفافه وحموضته، فإن الملتحمة (الغشاء الذي يُغطي العين) محمية، بدلاً من ذلك، بواسطة إنزيمات مُفرزة، أهمها الليزوزيم والديفينسين . ومع ذلك، عندما تفشل هذه الحواجز الواقية، يحدث التهاب الملتحمة .

في بعض أنواع السرطان (وخاصةً سرطان الدم النخاعي الأحادي )، قد يؤدي الإنتاج المفرط لليزوزيم من قِبَل الخلايا السرطانية إلى ارتفاع مستوياته في الدم إلى مستويات سامة. ويمكن أن يؤدي ارتفاع مستويات الليزوزيم في الدم إلى الفشل الكلوي وانخفاض مستوى البوتاسيوم في الدم، وهي حالات قد تتحسن أو تُشفى مع علاج الورم الخبيث الأساسي.

يُعدّ الليزوزيم في المصل أقلّ نوعيةً بكثير لتشخيص الساركويد من إنزيم تحويل الأنجيوتنسين في المصل؛ ومع ذلك، ولأنه أكثر حساسية، فإنه يُستخدم كعلامة على نشاط مرض الساركويد، وهو مناسب لمراقبة المرض في الحالات المؤكدة. ^{[ 39 ]}

أُجريت أول محاولة للتخليق الكيميائي لبروتين الليزوزيم على يد البروفيسور جورج دبليو كينر وفريقه في جامعة ليفربول بإنجلترا. ^{[ 40 ]} وقد تحقق ذلك أخيرًا في عام 2007 على يد توماس دوريك في مختبر ستيف كينت بجامعة شيكاغو، حيث صنع جزيء ليزوزيم وظيفيًا اصطناعيًا. ^{[ 41 ]}

استُخدمت بلورات الليزوزيم في إنماء مواد وظيفية أخرى لأغراض التحفيز والتطبيقات الطبية الحيوية. ^{[ 42 ] [ 43 ] [ 44 ]} يُعد الليزوزيم إنزيمًا شائع الاستخدام لتحليل البكتيريا موجبة الجرام. ^{[ 45 ]} نظرًا لوظيفة الليزوزيم الفريدة، حيث يمكنه هضم جدار الخلية وإحداث صدمة أسموزية (انفجار الخلية عن طريق تغيير مفاجئ في تركيز المذاب حولها، وبالتالي الضغط الأسموزي )، يُستخدم الليزوزيم بشكل شائع في المختبرات لتحرير البروتينات من الفراغ المحيط بالخلية البكتيرية ، بينما يبقى الغشاء الداخلي مغلقًا على شكل حويصلات تُسمى الكريات البروتوبلاستية . ^{[ 46 ] [ 47 ]}

على سبيل المثال، يمكن تحليل بكتيريا الإشريكية القولونية باستخدام الليزوزيم لتحرير محتويات الحيز المحيط بالبلازما . يُعدّ هذا مفيدًا بشكل خاص في المختبرات لجمع محتويات هذا الحيز. ^{[ 1 ]} يكون استخدام الليزوزيم مثاليًا عند درجات حرارة ونطاقات أس هيدروجيني وتركيزات ملحية محددة. يزداد نشاط الليزوزيم مع ارتفاع درجة الحرارة، حتى 60 درجة مئوية، ضمن نطاق أس هيدروجيني يتراوح بين 6.0 و7.0. تؤثر الأملاح الموجودة أيضًا على فعالية الليزوزيم، حيث يُظهر بعضها تأثيرات مثبطة، بينما يُحفز البعض الآخر عملية التحلل. يُحفز كلوريد الصوديوم عملية التحلل، ولكنه يُصبح مثبطًا فعالًا لها عند التركيزات العالية. وقد لوحظت نتائج مماثلة عند استخدام أملاح البوتاسيوم. توجد اختلافات طفيفة نتيجة لاختلاف سلالات البكتيريا. ^{[ 48 ]} ​​من نتائج استخدام الليزوزيم في استخلاص البروتينات المؤتلفة لغرض بلورة البروتين ، احتمال تلوث البلورة بوحدات من الليزوزيم، مما ينتج عنه مزيج غير ذي صلة فسيولوجيًا. في الواقع، لا يمكن لبعض البروتينات أن تتبلور بدون هذا التلوث. ^{[ 49 ] [ 50 ]}

علاوة على ذلك، يمكن استخدام الليزوزيم كأداة في إنتاج البروتينات المؤتلفة السامة. ويتم إنتاج هذه البروتينات في سلالات BL21(DE3) عادةً بواسطة بوليميراز الحمض النووي الريبي T7. ومن خلال التحفيز باستخدام IPTG، يتم تثبيط مثبط UV-5، مما يؤدي إلى نسخ بوليميراز الحمض النووي الريبي T7، وبالتالي نسخ البروتين المطلوب. ومع ذلك، يمكن ملاحظة مستوى أساسي من بوليميراز الحمض النووي الريبي T7 حتى بدون تحفيز. ويعمل الليزوزيم T7 كمثبط لبوليميراز الحمض النووي الريبي T7. وتُنتج السلالات المُستحدثة، التي تحتوي على بلازميد مساعد (pLysS)، مستويات منخفضة من الليزوزيم T7 بشكل دائم، مما يوفر دقة عالية وتعبيرًا ثابتًا للبروتين المؤتلف السام. ^{[ 51 ]}

لاحظ لاشتشينكو لأول مرة عام 1909 الخاصية المضادة للبكتيريا لبياض بيض الدجاج، وذلك بفضل إنزيم الليزوزيم الذي يحتويه. ^{[ 52 ]} وفي عام 1922، أثبت ألكسندر فليمنج ، مكتشف البنسلين ، فعالية مخاط الأنف في قتل البكتيريا، وهو من صاغ مصطلح "الليزوزيم". ^{[ 53 ]} ونُقل عنه قوله: "بما أن هذه المادة لها خصائص مشابهة لخصائص الإنزيمات، فقد أطلقت عليها اسم "الليزوزيم". ^{[ 54 ]} ثم بيّن فليمنج وجود مادة إنزيمية في مجموعة واسعة من الإفرازات، وقدرتها على تحليل (أي إذابة) أنواع مختلفة من البكتيريا بسرعة، ولا سيما نوع من البكتيريا الصفراء "المكورة" التي درسها. ^{[ 55 ]}

تم بلورة الليزوزيم لأول مرة على يد إدوارد أبراهام عام 1937، مما مكّن ديفيد تشيلتون فيليبس من وصف البنية ثلاثية الأبعاد لليزوزيم الموجود في بياض بيض الدجاج عام 1965، عندما حصل على أول نموذج بدقة 2 أنغستروم (200 بيكومتر ) باستخدام تقنية حيود الأشعة السينية . ^{[ 56 ] [ 57 ]} عُرضت البنية علنًا في محاضرة مسائية يوم الجمعة في المؤسسة الملكية عام 1965. ^{[ 58 ]} كان الليزوزيم ثاني بنية بروتينية وأول بنية إنزيمية تُحل باستخدام طرق حيود الأشعة السينية، وأول إنزيم يُحدد تسلسله بالكامل ويحتوي على جميع الأحماض الأمينية العشرين الشائعة. ^{[ 59 ]} نتيجةً لتوضيح فيليبس لبنية الليزوزيم، كان أيضًا أول إنزيم يُقترح له آلية عمل تفصيلية ومحددة لطريقة عمله التحفيزي. ^{[ 60 ] [ 61 ] [ 10 ]} قاد هذا العمل فيليبس إلى تقديم تفسير لكيفية تسريع الإنزيمات للتفاعل الكيميائي من حيث بنيته الفيزيائية. وقد تم تنقيح الآلية الأصلية التي اقترحها فيليبس مؤخرًا. ^{[ 18 ]}

• حساسية البيض

• موراميداز في رؤوس الموضوعات الطبية (MeSH) التابعة للمكتبة الوطنية الأمريكية للطب
• بروتوبيديا.أورج، ليزوزيم
• يوفر PDBe-KB نظرة عامة على جميع معلومات البنية المتاحة في PDB لإنزيم الليزوزيم C البشري.
• يوفر PDBe-KB نظرة عامة على جميع معلومات التركيب المتاحة في PDB لـ Lysozyme C في بياض بيض الدجاج.