تفاعل البوليميراز المتسلسل في الوقت الحقيقي

الموسوعة الحرة
مخطط فلورة SYBR Green الناتج عن تفاعل البوليميراز المتسلسل في الوقت الحقيقي
منحنى الذوبان الناتج في نهاية تفاعل البوليميراز المتسلسل في الوقت الحقيقي

تفاعل البوليميراز المتسلسل في الوقت الحقيقي ( PCR في الوقت الحقيقي ، أو qPCR عند استخدامه كميًا) هو تقنية مخبرية في البيولوجيا الجزيئية تعتمد على تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR). يراقب هذا التفاعل تضخيم جزيء الحمض النووي المستهدف أثناء تفاعل البوليميراز المتسلسل (أي في الوقت الحقيقي)، وليس في نهايته كما هو الحال في تفاعل البوليميراز المتسلسل التقليدي. يمكن استخدام تفاعل البوليميراز المتسلسل في الوقت الحقيقي كميًا وشبه كميًا (أي فوق/تحت كمية معينة من جزيئات الحمض النووي).

هناك طريقتان شائعتان للكشف عن منتجات تفاعل البوليميراز المتسلسل في تفاعل البوليميراز المتسلسل في الوقت الحقيقي وهما (1) الأصباغ الفلورية غير المحددة التي تتداخل مع أي حمض نووي مزدوج السلسلة و (2) مجسات الحمض النووي المحددة للتسلسل والتي تتكون من قليل النوكليوتيدات التي تم وسمها بمؤشر فلوري ، مما يسمح بالكشف فقط بعد تهجين المجس مع تسلسله المكمل.

تقترح إرشادات الحد الأدنى من المعلومات اللازمة لنشر تجارب تفاعل البوليميراز المتسلسل الكمي في الوقت الحقيقي ( MIQE )، التي وضعها الأساتذة ستيفن بوستين ، وميكائيل كوبيستا ، ومايكل بفافل، وزملاؤهم، استخدام الاختصار qPCR لتفاعل البوليميراز المتسلسل الكمي في الوقت الحقيقي، واستخدام RT-qPCR لتفاعل البوليميراز المتسلسل الكمي بعد النسخ العكسي. [ 1 ] يشير الاختصار "RT-PCR" عادةً إلى تفاعل البوليميراز المتسلسل بعد النسخ العكسي، وليس تفاعل البوليميراز المتسلسل في الوقت الحقيقي.

خلفية

يستخدم تفاعل البوليميراز المتسلسل في الوقت الحقيقي الفلوروفورات للكشف عن مستويات التعبير الجيني .

تنظم الخلايا في جميع الكائنات الحية التعبير الجيني من خلال تجديد نسخ الجينات ( RNA أحادي السلسلة ): يمكن قياس كمية الجين المُعبَّر عنه في الخلية من خلال عدد نسخ RNA لهذا الجين الموجودة في العينة. وللكشف عن التعبير الجيني وتحديد كميته بدقة من كميات صغيرة من RNA، يلزم تضخيم نسخة الجين. يُعد تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR) طريقة شائعة لتضخيم الحمض النووي (DNA)؛ وفي تفاعل PCR القائم على RNA، تُنسخ عينة RNA عكسيًا أولًا إلى حمض نووي مكمل (cDNA) باستخدام إنزيم النسخ العكسي .

لتضخيم كميات صغيرة من الحمض النووي، تُستخدم نفس منهجية تفاعل البوليميراز المتسلسل التقليدي (PCR) باستخدام قالب الحمض النووي، وزوج واحد على الأقل من البادئات النوعية ، وثلاثي فوسفات ديوكسي ريبونوكليوتيد ، ومحلول منظم مناسب ، وإنزيم بوليميراز الحمض النووي المقاوم للحرارة . تُضاف مادة مُوسومة بصبغة فلورية إلى هذا المزيج في جهاز تدوير حراري مزود بمجسات لقياس تألق الصبغة بعد إثارتها عند الطول الموجي المطلوب ، مما يسمح بقياس معدل إنتاج منتج واحد أو أكثر من المنتجات النوعية. يتيح ذلك قياس معدل إنتاج المنتج المُضخّم في كل دورة من دورات تفاعل البوليميراز المتسلسل. يمكن تحليل البيانات الناتجة بواسطة برامج حاسوبية لحساب التعبير الجيني النسبي (أو عدد نسخ mRNA ) في عدة عينات. كما يمكن تطبيق تفاعل البوليميراز المتسلسل الكمي (qPCR) للكشف عن الحمض النووي وتحديد كميته في العينات لتحديد وجود ووفرة تسلسل معين من الحمض النووي في هذه العينات. [ 2 ] يتم إجراء هذا القياس بعد كل دورة تضخيم، وهذا هو السبب في تسمية هذه الطريقة بـ PCR في الوقت الحقيقي (أي PCR الفوري أو المتزامن).

يُعدّ كلٌّ من تفاعل البوليميراز المتسلسل الكمي (qPCR) ومصفوفة الحمض النووي الدقيقة ( DNA microarray) من المنهجيات الحديثة لدراسة التعبير الجيني . وكانت تُستخدم طرقٌ أقدم لقياس وفرة الحمض النووي الريبوزي الرسول (mRNA)، مثل العرض التفاضلي ، واختبار حماية الحمض النووي الريبوزي (RNase protection assay) ، والتهجين الشمالي (Northern blot ). ويُستخدم التهجين الشمالي غالبًا لتقدير مستوى التعبير الجيني من خلال تصوير وفرة نسخ الحمض النووي الريبوزي الرسول (mRNA) في العينة. في هذه الطريقة، يُفصل الحمض النووي الريبوزي (RNA) النقي بواسطة الرحلان الكهربائي على هلام الأغاروز ، ثم يُنقل إلى مادة صلبة (مثل غشاء النايلون)، ويُفحص باستخدام مسبار حمض نووي (DNA) أو حمض نووي ريبوزي (RNA) مُكمّل للجين المراد دراسته. وعلى الرغم من أن هذه التقنية لا تزال تُستخدم لتقييم التعبير الجيني، إلا أنها تتطلب كميات كبيرة نسبيًا من الحمض النووي الريبوزي (RNA) ولا تُوفر سوى معلومات نوعية أو شبه كمية عن مستويات الحمض النووي الريبوزي الرسول (mRNA). [ 3 ] ويمكن أن تكون أخطاء التقدير الناتجة عن الاختلافات في طريقة القياس الكمي ناتجةً عن سلامة الحمض النووي (DNA)، وكفاءة الإنزيم ، والعديد من العوامل الأخرى. لهذا السبب ، تم تطوير عدد من أنظمة التقييس (التي تُسمى غالبًا طرق التطبيع ). طُوِّرت بعض هذه الطرق لقياس التعبير الجيني الكلي، لكن أكثرها شيوعًا يهدف إلى قياس التعبير الجيني للجين المدروس نسبةً إلى جين آخر يُسمى الجين المعياري، والذي يُختار بناءً على مستوى تعبيره شبه الثابت. غالبًا ما تُختار هذه الجينات من بين جينات الصيانة الخلوية ، إذ أن وظائفها المتعلقة ببقاء الخلية الأساسي تتطلب عادةً تعبيرًا جينيًا مستمرًا . [ 4 ] [ 5 ] وهذا يُتيح للباحثين الإبلاغ عن نسبة تعبير الجينات محل الاهتمام مقسومًا على تعبير الجين المعياري المُختار، مما يسمح بمقارنة التعبير الجيني دون معرفة مستوى تعبير الجين المعياري المطلق.

إن أكثر الجينات المستخدمة في التطبيع هي تلك التي تشفر الجزيئات التالية: التوبولين ، وجليسرالدهيد-3-فوسفات ديهيدروجينيز ، والألبومين ، والسيكلوفيلين ، والحمض النووي الريبوزي الريبوسومي . [ 3 ]

المبادئ الأساسية

يُجرى تفاعل البوليميراز المتسلسل الكمي في الوقت الحقيقي (Real-time PCR) باستخدام جهاز تدوير حراري قادر على إضاءة كل عينة بشعاع ضوئي بطول موجي محدد على الأقل، والكشف عن الفلورة المنبعثة من الفلوروفور المُثار . كما يتميز هذا الجهاز بقدرته على تسخين وتبريد العينات بسرعة، مستفيدًا بذلك من الخصائص الفيزيائية والكيميائية للأحماض النووية وإنزيم بوليميراز الحمض النووي .

تتألف عملية تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR) عمومًا من سلسلة من التغيرات الحرارية التي تُكرر من 25 إلى 50 مرة. تتكون هذه الدورات عادةً من ثلاث مراحل: الأولى، عند حوالي 95  درجة مئوية، تسمح بفصل السلسلة المزدوجة للحمض النووي؛ والثانية، عند درجة حرارة تتراوح بين 50 و60  درجة مئوية، تسمح بارتباط البادئات بقالب الحمض النووي؛ [ 6 ] والثالثة، بين 68 و72  درجة مئوية، تُسهّل عملية البلمرة التي يقوم بها إنزيم بوليميراز الحمض النووي. نظرًا لصغر حجم القطع، تُحذف الخطوة الأخيرة عادةً في هذا النوع من تفاعل البوليميراز المتسلسل، حيث يكون الإنزيم قادرًا على مضاعفة ناتج تضخيم الحمض النووي أثناء الانتقال بين مرحلة المحاذاة ومرحلة التمسخ. بالإضافة إلى ذلك، في تفاعل البوليميراز المتسلسل رباعي الخطوات، يُقاس التألق خلال مراحل حرارية قصيرة لا تتجاوز بضع ثوانٍ في كل دورة، عند درجة حرارة 80  درجة مئوية على سبيل المثال، وذلك لتقليل الإشارة الناتجة عن وجود ثنائيات البادئات عند استخدام صبغة غير نوعية. [ 7 ] تعتمد درجات الحرارة والأوقات المستخدمة لكل دورة على مجموعة واسعة من المعايير، مثل: الإنزيم المستخدم لتخليق الحمض النووي، وتركيز الأيونات ثنائية التكافؤ وثلاثي فوسفات ديوكسي ريبونوكليوتيد (dNTPs) في التفاعل، ودرجة حرارة ارتباط البادئات. [ 8 ]

التصنيف الكيميائي

يمكن تصنيف تقنية تفاعل البوليميراز المتسلسل في الوقت الحقيقي حسب الكيمياء المستخدمة للكشف عن ناتج تفاعل البوليميراز المتسلسل، سواء كانت فلوركرومات محددة أو غير محددة.

الكشف غير النوعي: تفاعل البوليميراز المتسلسل في الوقت الحقيقي باستخدام أصباغ ربط الحمض النووي ثنائي السلسلة كمؤشرات

يرتبط صبغٌ مُرتبطٌ بالحمض النووي بجميع جزيئات الحمض النووي ثنائية السلسلة (dsDNA) في تفاعل البلمرة المتسلسل (PCR)، مما يزيد من كمية التألق الكمي للصبغ. وبالتالي، تؤدي زيادة ناتج الحمض النووي أثناء تفاعل البلمرة المتسلسل إلى زيادة في شدة التألق المقاسة في كل دورة. مع ذلك، فإن أصباغ الحمض النووي ثنائي السلسلة، مثل SYBR Green، سترتبط بجميع نواتج تفاعل البلمرة المتسلسل للحمض النووي ثنائي السلسلة، بما في ذلك نواتج التفاعل غير النوعية (مثل ثنائي البادئ ). قد يُعيق هذا الأمر، أو يمنع، المراقبة الدقيقة للتسلسل المستهدف.

في تفاعل البوليميراز المتسلسل الكمي باستخدام أصباغ الحمض النووي المزدوج، يُحضّر التفاعل كالمعتاد، مع إضافة صبغة فلورية خاصة بالحمض النووي المزدوج. ثم يُجرى التفاعل في جهاز تفاعل البوليميراز المتسلسل الكمي ، وبعد كل دورة، تُقاس شدة الفلورة باستخدام كاشف؛ إذ لا تُصدر الصبغة فلورة إلا عند ارتباطها بالحمض النووي المزدوج (أي ناتج تفاعل البوليميراز المتسلسل). تتميز هذه الطريقة بأنها لا تتطلب سوى زوج من البادئات لإجراء التضخيم، مما يُقلل التكاليف؛ كما يُمكن مراقبة تسلسلات مستهدفة متعددة في أنبوب واحد باستخدام أنواع مختلفة من الأصباغ.

الكشف النوعي: طريقة المسبار المُبلغ الفلوري

(1) في المجسات السليمة، ينطفئ تألق المؤشر. (2) عند تهجين المجسات مع شريط الحمض النووي المكمل، يظل تألق المؤشر منطفئًا. (3) أثناء تفاعل البلمرة المتسلسل (PCR)، يتحلل المجس بواسطة بوليميراز Taq، ويتحرر المؤشر الفلوري.

تكشف المجسات الفلورية المُبلِّغة فقط عن الحمض النووي الذي يحتوي على التسلسل المُكمِّل للمجس؛ لذا، فإن استخدام هذه المجسات يزيد من الخصوصية بشكل ملحوظ، ويُمكِّن من إجراء التقنية حتى في وجود حمض نووي مزدوج السلسلة آخر. وباستخدام علامات بألوان مختلفة، يُمكن استخدام المجسات الفلورية في فحوصات متعددة لمراقبة عدة تسلسلات مستهدفة في نفس الأنبوب. كما تمنع خصوصية المجسات الفلورية المُبلِّغة تداخل القياسات الناتج عن ثنائيات البادئات ، وهي نواتج ثانوية غير مرغوب فيها في تفاعل البلمرة المتسلسل (PCR). مع ذلك، لا تمنع المجسات الفلورية المُبلِّغة التأثير المُثبِّط لثنائيات البادئات، والذي قد يُقلِّل من تراكم المنتجات المطلوبة في التفاعل.

تعتمد هذه الطريقة على مسبار قائم على الحمض النووي (DNA) مزود بمؤشر فلوري في أحد طرفيه ومثبط للفلورة في الطرف المقابل. يمنع التقارب الشديد بين المؤشر والمثبط رصد فلورته؛ إذ يؤدي تحلل المسبار بفعل نشاط الإكسونوكلياز من 5' إلى 3' لإنزيم بوليميراز Taq إلى كسر هذا التقارب، مما يسمح بانبعاث فلوري غير مثبط، يمكن رصده بعد الإثارة بالليزر. وبالتالي، فإن زيادة كمية الناتج المستهدف بواسطة مسبار المؤشر في كل دورة من دورات تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR) تؤدي إلى زيادة متناسبة في الفلورة نتيجة لتحلل المسبار وتحرر المؤشر.

  1. يتم تحضير تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR) كالمعتاد (انظر PCR )، ويتم إضافة مسبار الإبلاغ.
  2. مع بدء التفاعل، وخلال مرحلة التلدين في تفاعل البوليميراز المتسلسل، يلتصق كل من المسبار والبادئات بالهدف DNA.
  3. تبدأ عملية بلمرة سلسلة الحمض النووي الجديدة من البادئات، وبمجرد وصول البوليميراز إلى المسبار، يقوم الإكسونوكلياز 5'-3' بتحليل المسبار، مما يؤدي إلى فصل المراسل الفلوري عن المثبط، مما ينتج عنه زيادة في الفلورة.
  4. يتم الكشف عن الفلورة وقياسها في جهاز تفاعل البوليميراز المتسلسل في الوقت الحقيقي، ويتم استخدام الزيادة الهندسية المقابلة للزيادة الأسية للمنتج لتحديد دورة التحديد الكمي (C q ) في كل تفاعل.

تحليل درجة الانصهار

منحنيات اندماج مميزة لعدد من نواتج تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR) (تظهر بألوان مميزة). يمكن رؤية تفاعلات التضخيم لناتج معين (وردي، أزرق) وأخرى ذات نتيجة سلبية (أخضر، برتقالي). تشير قمة الاندماج المشار إليها بالسهم إلى القمة الناتجة عن ثنائيات البادئات، وهي تختلف عن ناتج التضخيم المتوقع. [ 9 ]

يُتيح تفاعل البوليميراز المتسلسل في الوقت الحقيقي ( Real-time PCR) تحديد أجزاء الحمض النووي المُضخّمة باستخدام تحليل درجة انصهارها (المعروفة أيضًا بقيمة Tm ، اختصارًا لدرجة الانصهار ). تعتمد هذه التقنية عادةً على تفاعل البوليميراز المتسلسل باستخدام أصباغ ترتبط بالحمض النووي ثنائي السلاسل كمؤشرات، وغالبًا ما يكون الصبغ المستخدم هو SYBR Green. تُعد درجة انصهار الحمض النووي خاصة بالجزء المُضخّم. تُستخلص نتائج هذه التقنية بمقارنة منحنيات تفكك عينات الحمض النووي المُحللة. [ 10 ]

على عكس تفاعل البوليميراز المتسلسل التقليدي، تتجنب هذه الطريقة استخدام تقنيات الفصل الكهربائي لإثبات نتائج جميع العينات. ويعود ذلك إلى أن تفاعل البوليميراز المتسلسل الكمي، على الرغم من كونه تقنية حركية، يُقيّم عادةً عند نقطة نهاية محددة. ولذلك، توفر هذه التقنية عادةً نتائج أسرع و/أو تستخدم عددًا أقل من المواد المتفاعلة مقارنةً بالفصل الكهربائي. وفي حال تطلب الأمر إجراء فصل كهربائي لاحق، فإنه يكفي فقط لاختبار العينات التي أظهر تفاعل البوليميراز المتسلسل في الوقت الحقيقي نتائج مشكوك فيها، و/أو لتأكيد نتائج العينات التي ثبتت إيجابيتها لمحدد معين.

النمذجة

على عكس تفاعل البوليميراز المتسلسل التقليدي (PCR) ذي نقطة النهاية، يسمح تفاعل البوليميراز المتسلسل في الوقت الحقيقي بمراقبة المنتج المطلوب في أي مرحلة من مراحل التضخيم عن طريق قياس الفلورة (في الوقت الحقيقي، يتم قياس مستواها فوق عتبة محددة). تعتمد إحدى الطرق الشائعة لتحديد كمية الحمض النووي (DNA) بواسطة تفاعل البوليميراز المتسلسل في الوقت الحقيقي على رسم الفلورة مقابل عدد الدورات على مقياس لوغاريتمي . تُحدد عتبة الكشف عن الفلورة في الحمض النووي (DNA) بمقدار 3-5 أضعاف الانحراف المعياري لضوضاء الإشارة فوق مستوى الخلفية. يُطلق على عدد الدورات التي تتجاوز فيها الفلورة العتبة اسم دورة العتبة (Ct ) ، أو وفقًا لإرشادات MIQE، دورة التحديد الكمي (Cq ) . [ 1 ] باستخدام هذه الطريقة، كلما زادت كمية الحمض النووي الريبوزي الرسول (mRNA) الأولي، انخفضت قيمة Cq .

خلال مرحلة التضخيم الأسي، تتضاعف كمية قالب الحمض النووي المستهدف (المُضخَّم) في كل دورة. على سبيل المثال، تحتوي عينة الحمض النووي التي يسبق فيها قيمة العتبة (C q) قيمة العتبة لعينة أخرى بثلاث دورات على 8 أضعاف كمية القالب. مع ذلك، غالبًا ما تختلف كفاءة التضخيم بين البادئات والقوالب. لذا، تُقيَّم كفاءة توليفة البادئ والقالب في تجربة معايرة باستخدام تخفيفات متسلسلة لقالب الحمض النووي لإنشاء منحنى معياري لتغير قيمة العتبة (C q ) مع كل تخفيف. ثم يُستخدم ميل الانحدار الخطي لتحديد كفاءة التضخيم، والتي تُساوي 100% إذا نتج عن تخفيف بنسبة 1:2 فرق في قيمة العتبة (C q ) يساوي 1. تعتمد طريقة عتبة الدورة على عدة افتراضات حول آلية التفاعل، وتعتمد على بيانات من مناطق ذات نسبة إشارة إلى ضوضاء منخفضة في منحنى التضخيم، مما قد يُدخل تباينًا كبيرًا أثناء تحليل البيانات. [ 11 ]

لتقييم التعبير الجيني كميًا، يُطرح (C q ) للحمض النووي الريبوزي (RNA) أو الحمض النووي الريبوزي منقوص الأكسجين (DNA) من الجين محل الاهتمام من (C q ) للحمض النووي الريبوزي/الحمض النووي الريبوزي منقوص الأكسجين من جين مرجعي في نفس العينة، وذلك لمعايرة التباين في كمية ونوعية الحمض النووي الريبوزي بين العينات المختلفة. تُعرف هذه العملية المعايرة باسم طريقة ΔC t [ 12 ] ، وتتيح مقارنة تعبير الجين محل الاهتمام بين عينات مختلفة. مع ذلك، تتطلب هذه المقارنة أن يكون تعبير الجين المرجعي المُعاير متقاربًا جدًا في جميع العينات. لذا، يُعد اختيار جين مرجعي يستوفي هذا المعيار بالغ الأهمية، وغالبًا ما يكون صعبًا، لأن عددًا قليلًا جدًا من الجينات يُظهر مستويات تعبير متساوية عبر مجموعة من الظروف أو الأنسجة المختلفة. [ 13 ] [ 14 ] على الرغم من أن تحليل عتبة الدورة مُدمج في العديد من أنظمة البرامج التجارية، إلا أن هناك طرقًا أكثر دقة وموثوقية لتحليل بيانات ملف تعريف التضخيم، والتي ينبغي أخذها في الاعتبار في الحالات التي تُشكل فيها قابلية التكرار مصدر قلق. [ 11 ]

تم اقتراح طرق قياس كمية تفاعل البوليميراز المتسلسل الكمي (qPCR) القائمة على الآلية، وتتميز هذه الطرق بأنها لا تتطلب منحنى معياريًا للقياس الكمي. وقد أظهرت طرق مثل MAK2 [ 15 ] أداءً كميًا مساويًا أو أفضل من طرق المنحنى المعياري. تستخدم هذه الطرق القائمة على الآلية معلومات حول عملية تضخيم البوليميراز لتقدير تركيز العينة الأصلي. ويتضمن امتداد هذا النهج نموذجًا دقيقًا لملف تفاعل البوليميراز المتسلسل بأكمله، مما يسمح باستخدام بيانات ذات نسبة إشارة إلى ضوضاء عالية، والقدرة على التحقق من جودة البيانات قبل التحليل. [ 11 ]

بحسب بحث رويتر وآخرون [ 16 ] ، يفترض MAK2 كفاءة تضخيم ثابتة خلال تفاعل البلمرة المتسلسل (PCR). مع ذلك، كشف التحليل النظري لتفاعل البلمرة المتسلسل، الذي اشتُقّ منه MAK2، أن كفاءة التضخيم ليست ثابتة طوال التفاعل. في حين أن قياس MAK2 الكمي يُقدّم تقديرات موثوقة لتركيز الحمض النووي المستهدف في العينة في ظل ظروف تفاعل البلمرة المتسلسل الكمي (qPCR) العادية، إلا أنه لا يُحدّد تركيز الحمض النووي المستهدف بدقة في فحوصات qPCR التي تستخدم أجهزة قياس تنافسية.

التطبيقات

تتعدد تطبيقات تفاعل البوليميراز المتسلسل الكمي في المختبرات ، حيث يُستخدم على نطاق واسع في التشخيص والبحوث الأساسية . وتشمل استخدامات هذه التقنية في الصناعة تحديد كمية الحمل الميكروبي في الأغذية أو المواد النباتية، والكشف عن الكائنات المعدلة وراثيًا ، وتحديد كمية ونمط الجينات لمسببات الأمراض الفيروسية البشرية.

قياس التعبير الجيني

يُعدّ قياس التعبير الجيني باستخدام طرق الكشف التقليدية عن الحمض النووي غير موثوق. فالكشف عن الحمض النووي الريبوزي الرسول (mRNA) في لطخة نورثرن أو نواتج تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR) على هلام أو لطخة ساوثرن لا يسمح بالقياس الكمي الدقيق. [ 17 ] على سبيل المثال، خلال 20-40 دورة من تفاعل البوليميراز المتسلسل النموذجي، تصل كمية ناتج الحمض النووي إلى مستوى ثابت لا يرتبط ارتباطًا مباشرًا بكمية الحمض النووي المستهدف في تفاعل البوليميراز المتسلسل الأولي. [ 18 ]

يمكن استخدام تفاعل البوليميراز المتسلسل الكمي في الوقت الحقيقي (Real-time PCR) لتحديد كمية الأحماض النووية بطريقتين شائعتين: التحديد الكمي النسبي والتحديد الكمي المطلق. [ 19 ] يُعطي التحديد الكمي المطلق العدد الدقيق لجزيئات الحمض النووي المستهدف من خلال مقارنتها بمعايير الحمض النووي باستخدام منحنى معايرة . ولذلك، من الضروري أن يكون لتفاعل البوليميراز المتسلسل للعينة والمعيار نفس كفاءة التضخيم . [ 20 ] يعتمد التحديد الكمي النسبي على جينات مرجعية داخلية لتحديد الفروق في التعبير الجيني للجين المستهدف. ويُعبّر عن التحديد الكمي كتغير في مستويات التعبير عن الحمض النووي الريبوزي الرسول (mRNA) الذي يُفسّر على أنه حمض نووي تكميلي (cDNA، الناتج عن النسخ العكسي للحمض النووي الريبوزي الرسول). يُعد التحديد الكمي النسبي أسهل في التنفيذ لأنه لا يتطلب منحنى معايرة، حيث تتم مقارنة كمية الجين المدروس بكمية جين مرجعي ضابط.

بما أن الوحدات المستخدمة للتعبير عن نتائج التحديد الكمي النسبي غير مهمة، يمكن مقارنة النتائج عبر عدد من تفاعلات RT-qPCR المختلفة. والسبب في استخدام جين مرجعي واحد أو أكثر هو تصحيح التباين غير النوعي، مثل الاختلافات في كمية ونوعية الحمض النووي الريبوزي المستخدم، والذي قد يؤثر على كفاءة النسخ العكسي وبالتالي على كفاءة عملية تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR) ككل. ومع ذلك، فإن الجانب الأكثر أهمية في هذه العملية هو ضرورة استقرار الجين المرجعي. [ 21 ]

كان اختيار هذه الجينات المرجعية يتم تقليديًا في البيولوجيا الجزيئية باستخدام دراسات نوعية أو شبه كمية، مثل الفحص البصري لهلامات الحمض النووي الريبوزي (RNA)، أو قياس كثافة النقل الشمالي ، أو تفاعل البوليميراز المتسلسل شبه الكمي (محاكاة تفاعل البوليميراز المتسلسل). أما الآن، في عصر الجينوم ، أصبح من الممكن إجراء تقدير أكثر تفصيلًا للعديد من الكائنات الحية باستخدام تقنيات النسخ الجيني . [ 22 ] ومع ذلك، فقد أظهرت الأبحاث أن تضخيم غالبية الجينات المرجعية المستخدمة في تحديد كمية التعبير عن الحمض النووي الريبوزي الرسول (mRNA) يختلف باختلاف الظروف التجريبية. [ 23 ] [ 24 ] [ 25 ] لذلك، من الضروري إجراء دراسة منهجية أولية سليمة إحصائيًا لاختيار الجين المرجعي الأنسب.

طُوِّرت العديد من الخوارزميات الإحصائية القادرة على تحديد الجين أو الجينات الأنسب للاستخدام في ظل ظروف معينة. تستطيع خوارزميات مثل geNORM وBestKeeper مقارنة الأزواج أو المتوسطات الهندسية لمصفوفة من جينات وأنسجة مرجعية مختلفة . [ 3 ] [ 5 ] يُطبَّق سير عمل تحليل qPCR بالكامل، مع مراعاة انتشار الأخطاء، في برنامج GenEx.

الاستخدامات التشخيصية

يُستخدم تفاعل البوليميراز المتسلسل النوعي التشخيصي للكشف السريع عن الأحماض النووية التي تُشخّص أمراضًا مثل الأمراض المعدية ، [ 26 ] [ 27 ] والسرطان والتشوهات الجينية. وقد ساهم إدخال فحوصات تفاعل البوليميراز المتسلسل النوعي إلى مختبرات الأحياء الدقيقة السريرية في تحسين تشخيص الأمراض المعدية بشكل ملحوظ، [ 28 ] ويُستخدم كأداة للكشف عن الأمراض المستجدة، مثل سلالات جديدة من الإنفلونزا وفيروس كورونا ، [ 29 ] في الاختبارات التشخيصية . [ 30 ] [ 31 ]

الاستخدامات الميكروبيولوجية

يستخدم علماء الأحياء الدقيقة تقنية تفاعل البوليميراز المتسلسل الكمي (qPCR) أيضاً في مجالات سلامة الأغذية، وتلف الأغذية، والتخمير، ولتقييم المخاطر الميكروبية لجودة المياه (مياه الشرب والمياه الترفيهية)، وفي حماية الصحة العامة. [ 32 ]

يمكن استخدام تفاعل البوليميراز المتسلسل الكمي (qPCR) لتضخيم المؤشرات التصنيفية أو الوظيفية للجينات في الحمض النووي المستخلص من العينات البيئية. [ 33 ] تُمثل هذه المؤشرات بقطع جينية من الحمض النووي أو الحمض النووي المكمل. [ 33 ] من خلال تضخيم عنصر جيني معين، يمكن تحديد كمية هذا العنصر في العينة قبل التضخيم. [ 33 ] يساعد استخدام المؤشرات التصنيفية (الجينات الريبوزومية) مع تفاعل البوليميراز المتسلسل الكمي في تحديد كمية الكائنات الدقيقة في العينة، ويمكن من خلاله تحديد العائلات أو الأجناس أو الأنواع المختلفة بناءً على خصوصية المؤشر. [ 33 ] كما يمكن استخدام المؤشرات الوظيفية (الجينات المشفرة للبروتينات) لإظهار التعبير الجيني داخل مجتمع حيوي، مما قد يكشف معلومات عن البيئة. [ 33 ]

الكشف عن مسببات الأمراض النباتية

يسعى القطاع الزراعي باستمرار إلى إنتاج شتلات نباتية خالية من مسببات الأمراض، وذلك لتجنب الخسائر الاقتصادية والحفاظ على الصحة. وقد طُوّرت أنظمة تسمح بالكشف عن كميات ضئيلة من الحمض النووي لفطر Phytophthora ramorum ، وهو فطر بيضي يُسبب موت أشجار البلوط وأنواع أخرى، مختلطًا مع الحمض النووي للنبات المضيف. ويعتمد التمييز بين الحمض النووي للممرض والنبات على تضخيم تسلسلات ITS، وهي فواصل تقع في المنطقة المشفرة لجين الحمض النووي الريبوزي ، وتُميز كل نوع. [ 34 ] كما طُوّرت نسخ ميدانية من هذه التقنية لتحديد نفس الممرض. [ 35 ]

الكشف عن الكائنات المعدلة وراثيًا

يمكن استخدام تفاعل البوليميراز المتسلسل الكمي باستخدام النسخ العكسي (RT-qPCR) للكشف عن الكائنات المعدلة وراثيًا نظرًا لحساسيته ونطاقه الديناميكي في الكشف عن الحمض النووي. أما البدائل الأخرى، مثل تحليل الحمض النووي أو البروتين، فعادةً ما تكون أقل حساسية. تُستخدم بادئات نوعية لتضخيم ليس الجين المُدخل، بل المحفز أو المُنهي أو حتى التسلسلات الوسيطة المستخدمة أثناء عملية هندسة الناقل. ولأن عملية إنتاج نبات معدل وراثيًا تؤدي عادةً إلى إدخال أكثر من نسخة واحدة من الجين المُدخل، فإنه يتم تقييم كميته بشكل شائع. ويتم ذلك غالبًا عن طريق التحديد الكمي النسبي باستخدام جين تحكم من النوع المُعالج، والذي يوجد بنسخة واحدة فقط. [ 36 ] [ 37 ]

التحديد الكمي السريري والتنميط الجيني

قد تتواجد الفيروسات في جسم الإنسان نتيجة العدوى المباشرة أو العدوى المشتركة، مما يُصعّب التشخيص باستخدام التقنيات التقليدية، وقد يؤدي إلى تشخيص خاطئ وعلاج غير مناسب. يسمح استخدام تفاعل البوليميراز المتسلسل الكمي (qPCR) بتحديد كمية الفيروس وتحديد نمطه الجيني (توصيف السلالة، باستخدام منحنيات الذوبان) كما في حالة فيروس التهاب الكبد ب . [ 38 ] تُعدّ درجة العدوى، المُقاسة بعدد نسخ الجينوم الفيروسي لكل وحدة من أنسجة المريض، ذات أهمية في كثير من الحالات؛ فعلى سبيل المثال، يرتبط احتمال إعادة تنشيط فيروس الهربس البسيط من النوع الأول بعدد الخلايا العصبية المصابة في العقد العصبية . [ 39 ] يُجرى هذا التحديد الكمي إما باستخدام النسخ العكسي أو بدونه، كما يحدث إذا اندمج الفيروس في الجينوم البشري في أي مرحلة من مراحل دورته، كما هو الحال مع فيروس الورم الحليمي البشري ( HPV )، حيث ترتبط بعض متغيراته بظهور سرطان عنق الرحم . [ 40 ] كما أتاح تفاعل البوليميراز المتسلسل في الوقت الحقيقي إمكانية تحديد كمية الفيروس المضخم للخلايا البشري (CMV) الذي يُلاحظ لدى المرضى الذين يعانون من نقص المناعة بعد زراعة الأعضاء الصلبة أو نخاع العظم. [ 41 ]

مراجع

  1. 1 2 بوستين، ستيفن أ؛ بينيس، فلاديمير؛ غارسون، جيريمي أ؛ هيلمانز، جان؛ هوجيت، جيم؛ كوبيستا، ميكائيل؛ مولر، راينهولد؛ نولان، تانيا؛ بفافل، مايكل و؛ شيبلي، غريغوري ل؛ فانديسومبيل، جو؛ ويتوير، كارل ت (1 أبريل 2009). "إرشادات MIQE: الحد الأدنى من المعلومات اللازمة لنشر تجارب تفاعل البوليميراز المتسلسل الكمي في الوقت الحقيقي" . الكيمياء السريرية . 55 (4): 611-622 . doi : 10.1373/clinchem.2008.112797 . PMID 19246619 . 
  2. ↑ واتسون، جيه دي؛ بيكر، تي إيه؛ بيل، إس بي؛ غان، إيه؛ ليفين، إم؛ لوسيك، آر (2004). البيولوجيا الجزيئية للجين ( الطبعة الخامسة). سان فرانسيسكو: بنجامين كامينغز. ISBN  978-0-321-22368-5.
  3. 1 2 3 بفافل، إم دبليو؛ تيشوباد، إيه؛ برغوميت، سي؛ نوفيانس، تي بي (مارس 2004). "تحديد جينات الصيانة الخلوية المستقرة، والجينات المستهدفة المنظمة تفاضليًا، وسلامة العينة: BestKeeper - أداة قائمة على Excel باستخدام الارتباطات الثنائية". رسائل التكنولوجيا الحيوية . 26 (6): 509-15 . Bibcode : 2004BiotL..26..509P . doi : 10.1023/b:bile.0000019559.84305.47 . PMID 15127793. S2CID 977404 .  
  4. ↑ بفافل، إم دبليو؛ هورغان، جي دبليو؛ ديمبفل، إل (2002). "أداة برمجية للتعبير النسبي (REST©) للمقارنة الجماعية والتحليل الإحصائي لنتائج التعبير النسبي في تفاعل البوليميراز المتسلسل في الوقت الحقيقي" . أبحاث الأحماض النووية . 30 (9) e36. doi : 10.1093/nar/ 30.9.e36 . PMC 113859. PMID 11972351 .  
  5. 1 2 فانديسومبيل، ج؛ دي بريتر، ك؛ باتين، ف؛ بوب، ب؛ فان روي، ن؛ دي بايب، أ؛ سبيلمان، ف (2002). "التطبيع الدقيق لبيانات تفاعل البوليميراز المتسلسل الكمي في الوقت الحقيقي عن طريق المتوسط ​​الهندسي لجينات تحكم داخلية متعددة" . علم الأحياء الجينومي . 3 (7): 1-12 . doi : 10.1186/gb-2002-3-7-research0034 . PMC 126239. PMID 12184808 .  
  6. ↑ ريتشليك، دبليو؛ سبنسر، دبليو جيه؛ رودز، آر إي (1990). "تحسين درجة حرارة التلدين لتضخيم الحمض النووي في المختبر" . مجلة أبحاث الأحماض النووية . 18 (21): 6409-6412 . doi : 10.1093/nar/18.21.6409 . PMC 332522. PMID 2243783 .  
  7. ↑ بفافل، مايكل (2000). "تطوير وتوثيق طريقة تفاعل البوليميراز المتسلسل الكمي المعياري الخارجي لعامل النمو الشبيه بالأنسولين-1 باستخدام تقنية LightCycler SYBR Green I" (ملف PDF) . مجلة Biochemica (3) - عبر gene-quantification.org.
  8. ↑ سامبروك، جوزيف؛ راسل، ديفيد دبليو. (2001). الاستنساخ الجزيئي: دليل المختبر ( الطبعة الثالثة). كولد سبرينغ هاربور، نيويورك: مطبعة مختبر كولد سبرينغ هاربور. ISBN  978-0-87969-576-7.
  9. ↑ بونشيل، فريدريك؛ تومز، كارميل؛ برانسفيلد، كيران؛ ليونغ، فونغ ت؛ دوغلاس، سوزان هـ؛ فيلد، سارة ل؛ بيل، ساندرا م؛ كومباريه، فاليري؛ بويزيو، آلان؛ ميغيل، آلان ج؛ روبنسون، فيليب أ؛ إنجلهيرن، كريس ف؛ إسحاق، جون د؛ ماركهام، أليكس ف (13 أكتوبر 2003). "تفاعل البوليميراز المتسلسل في الوقت الحقيقي القائم على تألق SYBR-Green I: بديل لفحص TaqMan للقياس الكمي النسبي لإعادة ترتيب الجينات، وتضخيم الجينات، وحذف الجينات الصغيرة" . BMC Biotechnology . 3 (1) 18. Bibcode : 2003BMCBt...3...18P . doi : 10.1186/1472-6750-3-18 . PMC 270040 . PMID 14552656 .  
  10. ↑ ريري، كيرك م.؛ راسموسن، راندي ب.؛ ويتوير، كارل ت. (فبراير 1997). "تمييز المنتجات بتحليل منحنيات ذوبان الحمض النووي أثناء تفاعل البوليميراز المتسلسل". الكيمياء الحيوية التحليلية . 245 (2): 154-160 . doi : 10.1006/abio.1996.9916 . PMID 9056205 . 
  11. 1 2 3 كار، أ.س.؛ مور، س.د. (2012). لوسيا، أليخاندرو (محرر). "القياس الكمي الدقيق لتفاعلات البوليميراز المتسلسل باستخدام المطابقة الشاملة" . PLOS ONE . 7 (5) e37640. Bibcode : 2012PLoSO...737640C . doi : 10.1371/journal.pone.0037640 . PMC 3365123. PMID 22701526 .  
  12. ↑ شيف، يان هـ.؛ ليمان، كيرستين إي.؛ بوشمان، إيفو ر.؛ أونغر، توماس؛ فونكه-كايزر، هايكو (26 أكتوبر 2006). "تحليل بيانات تفاعل البوليميراز المتسلسل الكمي في الوقت الحقيقي: المفاهيم الحالية وصيغة "فرق قيمة العتبة للتعبير الجيني" الجديدة". مجلة الطب الجزيئي . 84 (11): 901-910 . doi : 10.1007/s00109-006-0097-6 . ​​PMID 16972087. S2CID 10427299 .  
  13. ↑ نيليس، هيلين؛ كوينيه، توم؛ فان نيوفيربورغ، فيليب؛ ديفورس، ديتر؛ نيليس، هانز جيه (ديسمبر 2006). "تطوير وتقييم استراتيجيات تطبيع مختلفة لدراسات التعبير الجيني في الأغشية الحيوية لـ Candida albicans بواسطة تفاعل البوليميراز المتسلسل في الوقت الحقيقي" . BMC Molecular Biology . 7 (1) 25. doi : 10.1186/1471-2199-7-25 . PMC 1557526. PMID 16889665 .  
  14. ↑ نولان، تانيا؛ هاندز، ريبيكا إي؛ بوستين، ستيفن أ (أغسطس 2006). "قياس كمية الحمض النووي الريبوزي الرسول باستخدام تفاعل البوليميراز المتسلسل العكسي في الوقت الحقيقي". بروتوكولات الطبيعة . 1 (3): 1559-1582 . doi : 10.1038/nprot.2006.236 . PMID 17406449. S2CID 10108148 .  
  15. ↑ بوغي، غريغوري جيه؛ وولف، بيتر جيه (30 أغسطس 2010). "نموذج آلي لتفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR) من أجل التحديد الكمي الدقيق لبيانات تفاعل البوليميراز المتسلسل الكمي" . PLOS ONE . 5 (8) e12355. Bibcode : 2010PLoSO...512355B . doi : 10.1371/journal.pone.0012355 . PMC 2930010. PMID 20814578 .  
  16. ^ رويتر، جان م. بفافل، مايكل دبليو؛ تشاو، شنغ؛ جواسيس، أندريه ن.؛ بوغي، غريغوري. بلوم، يوخن. روتليدج، روبرت ج. سيستي، دافيد؛ ليفينز، أنطون؛ دي بريتر، كاتلين؛ ديرفو، ستيفان. هيلمانز، يناير؛ فانديسومبيلي ، جو (يناير 2013). “تقييم طرق تحليل منحنى qPCR لاكتشاف العلامات الحيوية الموثوقة: التحيز والدقة والدقة والآثار المترتبة”. طُرق . 59 (1): 32– 46. بيب كود : 2013MCME...59...32R . دوى : 10.1016/j.ymeth.2012.08.011 . بميد 22975077 . 
  17. ↑ جيليرتر، بروس. "العلاج بالمجالات الكهرومغناطيسية النبضية لعلاج اضطرابات القرنية" . lemuriatechnologies.com . مؤرشف من الأصل بتاريخ 2014-06-09.
  18. ↑ أوفربيرغ، ل.؛ جيوليتي، أ.؛ فالكس، د.؛ ديكالون، ر.؛ بويون، ر.؛ ماثيو، س. (2003). " استخدام تفاعل البوليميراز المتسلسل العكسي في الوقت الحقيقي لتحديد كمية التعبير الجيني للسيتوكينات" . مجلة التقنيات الجزيئية الحيوية . 14 (1): 33-43 . PMC 2279895. PMID 12901609 .  
  19. ↑ داناسيكاران، س.؛ دوهرتي، ت. مارك؛ كينيث، جون؛ مجموعة دراسة تجارب السل (مارس 2010). "مقارنة المعايير المختلفة للقياس الكمي المطلق القائم على تفاعل البوليميراز المتسلسل في الوقت الحقيقي". مجلة أساليب علم المناعة . 354 ( 1-2 ): 34-39 . doi : 10.1016/j.jim.2010.01.004 . PMID 20109462 . 
  20. ↑ بار، تساتشي؛ كوبيستا، ميكائيل؛ تيشوباد، أليس (19-10-2011). "التحقق من صحة تشابه الحركية في تفاعل البوليميراز المتسلسل الكمي" . مجلة أبحاث الأحماض النووية . 40 (4): 1395-1406 . doi : 10.1093/nar/gkr778 . ISSN 0305-1048 . PMC 3287174. PMID 22013160 .   
  21. ↑ برونر، أ.م.؛ ياكوفليف، إ.أ.؛ شتراوس، ش.هـ. (2004). "التحقق من صحة الضوابط الداخلية لدراسات التعبير الجيني الكمي في النباتات" . مجلة بي إم سي لبيولوجيا النبات . 4 (1) 14. رمز Bibcode : 2004BMCPB...4...14B . doi : 10.1186/1471-2229-4-14 . PMC 515301. PMID 15317655 .  
  22. ↑ ماكجيتيغان، بول أ. (2013). "علم النسخ في عصر تسلسل الحمض النووي الريبوزي". الرأي الحالي في البيولوجيا الكيميائية . 17 (1): 4-11 . Bibcode : 2013COCB...17....4M . doi : 10.1016/j.cbpa.2012.12.008 . PMID 23290152 . 
  23. ^ ثيلين، أوه؛ زورزي، دبليو؛ لاكاي، ب؛ دي بورمان، ب؛ كومانز، ب؛ هيني، ج؛ جريسار، تي؛ إيغوت، أ؛ هاينن، إي (1999). "جينات التدبير المنزلي كمعايير داخلية: الاستخدام والحدود" . ي بيوتكنول . 75 ( 2– 3): 197– 200. دوى : 10.1016/s0168-1656(99)00163-7 . اتش دي ال : 2268/3661 . بميد 10617337 . 
  24. ↑ رادونيك، أ؛ ثولكه، س؛ ماكاي، إم؛ لاندت، أ؛ سيجرت، و؛ نيتشه، أ (2004). "دليل لاختيار الجين المرجعي لتفاعل البوليميراز المتسلسل الكمي في الوقت الحقيقي" . مجلة بحوث الكيمياء الحيوية والفيزياء الحيوية . 313 (4): 856-862 . رمز Bibcode : 2004BBRC..313..856R . doi : 10.1016/j.bbrc.2003.11.177 . PMID 14706621 . {{cite journal}}: CS1 maint: deprecated archiveal service ( link )
  25. ↑ ديدا، ك؛ هوجيت، ج. ف؛ بوستين، س. أ؛ جونسون، م. أ؛ روك، ج؛ زوملا، أ (2004). "التحقق من صحة جينات التدبير المنزلي لتطبيع التعبير الجيني للرنا في تفاعل البوليميراز المتسلسل الكمي" . تقنيات حيوية . 37 (1): 112-119 . doi : 10.2144/04371RR03 . PMID 15283208 . 
  26. ↑ جاورث، نيكول (27 مارس 2020). "كيف يتم الكشف عن فيروس كوفيد-19 باستخدام تفاعل البوليميراز المتسلسل العكسي في الوقت الحقيقي؟" . الوكالة الدولية للطاقة الذرية . تم الاطلاع عليه بتاريخ 16 فبراير 2023 .
  27. ↑ شيو، ليشان؛ بيندر، راكيل أ.؛ ألارجيا، ناتالي أ.؛ كوتشيك، كارا؛ كولمان، كريستين ك.؛ ثان، سون ت.؛ بيلي، إميلي س.؛ بوي، فونغ ن.؛ توه، تيك-هوك؛ إردمان، دين د.؛ غراي، غريغوري س. (يوليو 2020). "فحص تفاعل البوليميراز المتسلسل العكسي للكشف عن فيروسات كورونا من أربعة أجناس" . مجلة علم الفيروسات السريرية . 128 104391. doi : 10.1016/j.jcv.2020.104391 . PMC 7192118. PMID 32403008 .  
  28. ↑ إسباي، إم جيه (يناير 2006). "التفاعل التسلسلي للبوليميراز في الوقت الحقيقي في علم الأحياء الدقيقة السريري: تطبيقات للاختبارات المعملية الروتينية" . مراجعات علم الأحياء الدقيقة السريري . 19 (3): 165-256 . Bibcode : 2006CliMR..19..165E . doi : 10.1128/CMR.19.1.165-256.2006 . PMC 1360278. PMID 16418529 .  
  29. ^ داماد، الإمارات العربية المتحدة؛ عبد الرضا, ماجستير (2020). "كوفيد-19: طرق الكشف الجزيئي والمصلي" . بيرج . 8 إي10180. دوى : 10.7717/peerj.10180 . بمك 7547594 . بميد 33083156 .  
  30. ↑ "فحوصات RT-PCR المعتمدة من إدارة الغذاء والدواء الأمريكية وغيرها من الفحوصات الجزيئية لفيروسات الإنفلونزا" (ملف PDF) . cdc.gov .
  31. ↑ "تقنية تفاعل البوليميراز المتسلسل العكسي في الوقت الحقيقي (rRT-PCR)، طريقة لتأكيد الإصابة بفيروس كورونا في ووهان - الذكاء الاصطناعي في الكيمياء" . 24 يناير 2020. تاريخ الاسترجاع: 26 يناير 2020 .
  32. ↑ فيليون، م، محرر. (2012). تفاعل البوليميراز المتسلسل الكمي في الوقت الحقيقي في علم الأحياء الدقيقة التطبيقي . دار كايستر الأكاديمية للنشر . رقم ISBN 978-1-908230-01-0.
  33. 1 2 3 4 5 بوشز، ت.؛ بليو، AL. ديكويدت، S .؛ دوميزون، أنا. دوفريسن، أ. فيريرا، S .؛ جودون، جي جي؛ هلال، J.؛ جوليان، C .؛ كويزر، أ.؛ مارتن لوران، ف؛ موفريت، أ.؛ منير، JM. بيريت، P.؛ شميت-كوبلين، ب. سيبورج، O .؛ ديرون، إي؛ بيسبو، أ. ديبورتيس، أنا؛ جراند، سي؛ كوني، ص. مارون، بنسلفانيا؛ رانجارد، إل. (ديسمبر 2016). “طرق علم الأحياء الدقيقة الجزيئية للتشخيص البيئي”. رسائل الكيمياء البيئية . 14 (4): 423– 441. بيب كود : 2016EnvCL..14..423B . دوى : 10.1007/s10311-016-0581-3 . S2CID 88827291 . 
  34. ↑ بالدوين، بي جي (1992). "الفائدة التطورية للفواصل المنسوخة الداخلية للحمض النووي الريبوزي النووي في النباتات: مثال من علم التصنيف". علم الوراثة الجزيئية والتطور . 1 (1): 3-16 . Bibcode : 1992MolPE...1....3B . doi : 10.1016/1055-7903(92)90030-K . PMID 1342921 . 
  35. ↑ توملينسون، جيه إيه؛ باركر، آي؛ بونهام، إن. (2007). "طرق أسرع وأبسط وأكثر تحديدًا لتحسين الكشف الجزيئي عن فطر Phytophthora ramorum في الحقل" . علم الأحياء الدقيقة التطبيقي والبيئي . 73 (12): 4040-4047 . Bibcode : 2007ApEnM..73.4040T . doi : 10.1128/AEM.00161-07 . PMC 1932743. PMID 17449689 .  
  36. ^ هولست جنسن، آرني؛ رونينغ، سيسيل B .؛ لوفسيث، ​​أستريد؛ بيردال، كنوت ج. (2003). “تقنية PCR لفحص وقياس الكائنات المعدلة وراثيا (GMOs)”. الكيمياء التحليلية والتحليلية الحيوية . 375 (8): 985-993 . دوى : 10.1007 / s00216-003-1767-7 . بميد 12733008 . S2CID 43681211 .  
  37. ↑ برودمان، ب. د.؛ إيلغ، إ. س.؛ بيرثود، هـ.؛ هيرمان، أ. (2002). "طرق تفاعل البوليميراز المتسلسل الكمي في الوقت الحقيقي لأربعة أصناف من الذرة المعدلة وراثيًا ومحتوى الحمض النووي للذرة في الغذاء" . مجلة AOAC الدولية . 85 (3): 646-653 . doi : 10.1093/jaoac/85.3.646 . PMID 12083257 . 
  38. ^ نعم شيو هوي. تساي، تشينغ يي؛ كاو، جيا-هورنج؛ ليو، تشون جين؛ كو، تي جونج؛ لين، مينغ وي؛ هوانغ، ون لينغ؛ لو، شو فين؛ جيه، جين؛ تشن، دينغ شين؛ تشين ، باي جير (أكتوبر 2004). “القياس الكمي والتنميط الجيني لفيروس التهاب الكبد B في تفاعل واحد عن طريق PCR في الوقت الحقيقي وتحليل منحنى الانصهار”. مجلة أمراض الكبد . 41 (4): 659-666 . دوى : 10.1016/j.jhep.2004.06.031 . بميد 15464248 . 
  39. ↑ سوتيل، نيو مكسيكو (أغسطس 1998). "تزداد احتمالية إعادة تنشيط فيروس الهربس البسيط من النوع الأول في الجسم الحي مع ازدياد عدد الخلايا العصبية المصابة بشكل كامن في العقد العصبية" . مجلة علم الفيروسات . 72 (8): 6888-6892 . doi : 10.1128/JVI.72.8.6888-6892.1998 . PMC 109900. PMID 9658140 .  
  40. ↑ بيتر، م؛ روستي، س؛ كوتورييه، ج؛ رادفاني، ف؛ تيشيما، هـ؛ ساستر-غارو، إكس (28 سبتمبر 2006). "تنشيط جين MYC المرتبط بتكامل الحمض النووي لفيروس الورم الحليمي البشري في موضع جين MYC في أورام الأعضاء التناسلية" . مجلة Oncogene . 25 (44): 5985-5993 . doi : 10.1038/sj.onc.1209625 . PMID 16682952 . 
  41. ↑ ماكاي، إيان م.؛ آردن، كاثرين إي.؛ نيتشه، أندرياس (15 مارس 2002). "تفاعل البوليميراز المتسلسل في الوقت الحقيقي في علم الفيروسات" . مجلة أبحاث الأحماض النووية . 30 (6): 1292-1305 . doi : 10.1093/nar/30.6.1292 . ISSN 0305-1048 . PMC 101343. PMID 11884626 .   

فهرس