اختبار الإزاحة الحرارية

تقنية قياس التألق التفاضلي النانوي ( nanoDSF ) هي تقنية توصيف بيوفيزيائي تُستخدم لتقييم استقرار البنية الفراغية لعينة بيولوجية، عادةً ما تكون بروتينًا. ^{[ 2 ]} تُعرَّض العينات إما لتغيرات تدريجية في درجة الحرارة أو لتدرجات من عامل التمسخ الكيميائي، ثم يُقاس التألق الذاتي ويُحلل لتحديد درجة الانصهار ( Tm ). تشمل تطبيقاتها تصنيف التركيبات، وهندسة البروتينات (مقارنة الطفرات بالنوع البري )، وربط الليجاندات (تحديد ثوابت التقارب). من الشروط الأساسية لهذه التقنية أن يحتوي البروتين على بقايا متألقة ذاتيًا، عادةً ما تكون بقايا التربتوفان أو التيروسين. تشمل مزاياها التحليل بدون استخدام علامات، وتجنب استخدام الفلوروفورات الخارجية _، وانخفاض استهلاك العينة، وسهولة الاستخدام، وإمكانية التشغيل الآلي، والإنتاجية العالية للفحص. أما عيوبها فتتمثل في ميلها إلى إعطاء نتائج إيجابية وسلبية خاطئة، مما يستلزم عادةً إجراء فحص لاحق باستخدام تقنية أخرى قد تكون ذات إنتاجية أقل للتأكيد. تستخدم الأجهزة التجارية الحالية إما أنابيب شعرية خاصة ^{[ 11 ] [ 12 ]} أو صفائح عامة عالية الإنتاجية مكونة من 384 بئراً ^{[ 13 ]} لتحليل العينات.

وُصفت هذه التقنية لأول مرة من قِبل سيميسوتنوف وآخرون (1991) ^{[ 14 ]} باستخدام 1,8-ANS وخلايا كوارتز. وكانت شركة ثري دايمنشنال فارماسوتيكالز أول من وصف نسخة عالية الإنتاجية باستخدام قارئ الألواح ^{[ 15 ]} ، ونشرت شركة وايث ريسيرش نسخة معدلة من الطريقة باستخدام صبغة SYPRO Orange بدلاً من 1,8-ANS. ^{[ 16 ]} تتميز صبغة SYPRO Orange بملف طول موجة الإثارة/الانبعاث المتوافق مع أجهزة qPCR، وهي أجهزة شائعة الاستخدام في المؤسسات التي تُجري أبحاث البيولوجيا الجزيئية. وقد طُرح اسم قياس التألق التفاضلي الماسح (DSF) لاحقًا ^{[ 17 ]} ، ولكن يُفضل استخدام Thermofluor لأن Thermofluor لم تعد علامة تجارية مسجلة، ولأن قياس التألق التفاضلي الماسح يُخلط بسهولة مع قياس السعرات الحرارية التفاضلي الماسح.

يرتبط صبغ SYPRO Orange بشكل غير انتقائي بالأسطح الكارهة للماء، ويؤدي الماء إلى إخماد تألقه بشكل كبير. عند تفكك البروتين، ترتبط الأسطح الكارهة للماء المكشوفة بالصبغ، مما يؤدي إلى زيادة التألق نتيجةً لاستبعاد الماء. كما ترتبط المذيلات المنظفة بالصبغ وتزيد من التشويش الخلفي بشكل ملحوظ. يُخفف هذا التأثير باستخدام صبغ ANS؛ ^{[ 18 ]} إلا أن هذا الكاشف يتطلب إثارة بالأشعة فوق البنفسجية. يتم الحصول على منحنى الاستقرار وقيمة نقطة المنتصف (درجة حرارة الانصهار، Tm _، والمعروفة أيضًا بدرجة حرارة التعرض الكاره للماء، _Th ) عن طريق زيادة درجة الحرارة تدريجيًا لفك تفكك البروتين وقياس التألق عند كل نقطة. تُقاس المنحنيات للبروتين فقط وللبروتين مع الرابط، ويتم حساب ΔTm _. قد لا تكون هذه الطريقة فعّالة جدًا في دراسة تفاعلات البروتين-بروتين إذا احتوى أحد البروتينات المتفاعلة على مناطق كارهة للماء كبيرة، إذ يصعب حينها تحديد عوامل منع التكتل، واستقرار الطيات الأصلية، والإعاقة الفراغية لوصول الصبغة إلى المواقع الكارهة للماء. إضافةً إلى ذلك، قد يحدّ البروتين المتكتل جزئيًا من الزيادة النسبية في الفلورة عند التسخين؛ وفي الحالات القصوى، لن تحدث أي زيادة في الفلورة لأن البروتين يكون متكتلًا بالكامل قبل التسخين. يُعدّ فهم هذا التأثير مفيدًا للغاية، إذ تشير الزيادة النسبية العالية في الفلورة إلى وجود نسبة كبيرة من البروتين المطوي في المادة الأولية.

يسمح هذا الفحص بإجراء فحص عالي الإنتاجية للروابط بالبروتين المستهدف ويستخدم على نطاق واسع في المراحل المبكرة من اكتشاف الأدوية في صناعة الأدوية، وجهود علم الجينوم الهيكلي ، وهندسة البروتين عالية الإنتاجية.

نشر ألكسندروف وآخرون (2008) ^{[ 20 ]} تعديلًا على اختبار Thermofluor، حيث استُبدل SYPRO Orange بـ N- [4-(7-ثنائي إيثيل أمينو-4-ميثيل-3-كومارينيل)فينيل]ماليميد (CPM)، وهو مركب لا يُصدر فلورة إلا بعد تفاعله مع نيوكليوفيل . يتميز CPM بميله الشديد للثيولات مقارنةً بالنيوكليوفيلات البيولوجية الأخرى، وبالتالي يتفاعل مع السلاسل الجانبية للسيستين قبل غيرها. عادةً ما يكون السيستين مدفونًا داخل البروتين المطوي نظرًا لطبيعته الكارهة للماء. عند تمسخ البروتين، تصبح ثيولات السيستين متاحة، ويمكن قراءة إشارة فلورية من CPM المتفاعل. يبلغ طول موجة الإثارة والانبعاث لـ CPM المتفاعل 387  نانومتر/463  نانومتر، لذا يلزم استخدام قارئ لوحات فلورية أو جهاز qPCR مزود بمرشحات متخصصة. استخدمت هذه التقنية بنجاح على البروتينات الغشائية Apelin GPCR و FAAH بالإضافة إلى β-lactoglobin الذي يتحلل عند التسخين بدلاً من أن يتحول إلى كريات منصهرة .

طُوِّرت تقنية DSF-GTP (بروتين مُوسَم ببروتين GFP) بواسطة فريق بقيادة باتريك شيفر في جامعة جيمس كوك، ونُشرت في دراسة مورو وآخرون عام 2012. ^{[ 21 ]} وقد سهّل تطوير قياس التألق التفاضلي الماسح وقدرة Thermofluor على التحليل عالي الإنتاجية بشكل كبير فحص ظروف تبلور البروتينات ومكتبات الطفرات الكبيرة في برامج علم الجينوم البنيوي، بالإضافة إلى فحص الروابط في برامج اكتشاف الأدوية وعلم الجينوم الوظيفي . إلا أن هذه التقنيات محدودة بسبب حاجتها إلى بروتينات عالية النقاء وأصباغ حساسة للمذيب ، مما استدعى الحاجة إلى تقنيات أكثر كفاءة وعالية الإنتاجية يمكن استخدامها مع عينات البروتين الخام. وقد لُبّيت هذه الحاجة بتطوير تقنية جديدة عالية الإنتاجية لتحديد استقرار البروتين وارتباط الروابط كميًا باستخدام قياس التألق التفاضلي الماسح للبروتينات الموسومة ببروتين الفلورسنت الأخضر (GFP). تعتمد هذه التقنية على مبدأ قياس أي تغيير في البيئة المحيطة ببروتين GFP، مثل تفكك البروتين المراد دراسته أو تجمعه، من خلال تأثيره على تألق الفلوروفور. تتميز هذه التقنية بالبساطة والسرعة وعدم تأثرها بتغيرات حجم العينة، كما أن نطاق درجة الحرارة والرقم الهيدروجيني الأمثل لها يتراوح بين 30-80  درجة مئوية و5-11 على التوالي. لا يتطلب النظام استخدام أصباغ حساسة للمذيب، مما يقلل من خطر التداخلات. تُخلط عينات البروتين ببساطة مع ظروف الاختبار في صفيحة ذات 96 بئراً، ثم تُخضع لبروتوكول منحنى الذوبان باستخدام جهاز تدوير حراري فوري. تُجمع البيانات خلال ساعة إلى ساعتين، وتتضمن إجراءات فريدة لمراقبة الجودة من خلال إشارة GFP. وقد طُبقت تقنية DSF-GTP لتوصيف البروتينات وفحص المركبات الصغيرة. ^{[ 22 ] [ 23 ] [ 24 ] [ 25 ] [ 26 ]}

يُعدّ 4-(ثنائي سيانوفينيل)جولوليدين (DCVJ) مسبارًا دوارًا جزيئيًا يتميز بتألق يعتمد بشدة على صلابة بيئته. عند تمسخ البروتين، يزداد تألق DCVJ. وقد أُفيد بأنه يعمل مع 40  ملغم/مل من الأجسام المضادة. ^{[ 27 ]}

يختلف عمر تألق التربتوفان بين البروتينات المطوية وغير المطوية. ويُمكن قياس عمر التألق الناتج عن الإثارة بالأشعة فوق البنفسجية عند درجات حرارة مختلفة للحصول على قيمة T_{_m} . ومن أبرز مزايا هذه التقنية عدم الحاجة إلى إضافة أصباغ كاشفة، لأن التربتوفان جزء لا يتجزأ من البروتين. إلا أن هذا قد يُعد عيبًا أيضًا، إذ لا تحتوي جميع البروتينات على التربتوفان. يُمكن استخدام عمر التألق الذاتي مع البروتينات الغشائية ومذيلات المنظفات، ولكن قد يؤدي وجود فلوروفور قوي للأشعة فوق البنفسجية (مثل جزيء صغير ذاتي التألق) في المحلول المنظم إلى طمس الإشارة.

يشكّل استغلال خصائص التألق الذاتي لبقايا التربتوفان في العديد من البروتينات أساس تقنية nanoDSF. وتعتمد أطوال موجات انبعاث بقايا التربتوفان على البيئة الكيميائية المحيطة، ولا سيما الذوبان (انظر: تغير اللون بتأثير المذيب )، وبالتالي تختلف بين البروتين المطوي وغير المطوي، تمامًا كما هو الحال مع عمر التألق. عادةً، تُظهر بقايا التربتوفان الداخلية في بيئة أكثر كراهية للماء انزياحًا ملحوظًا نحو الأحمر في الانبعاث من حوالي 330  نانومتر إلى 350  نانومتر عند فك طي البروتين وتعرضه للماء. ويُتيح قياس انزياحات طول موجة التألق عند فترات حرارية مختلفة قياس درجة حرارة الانصهار (Tm ₎ . يوجد حاليًا ما لا يقل عن ثلاثة أجهزة في السوق قادرة على قراءة هذا الانزياح في الطول الموجي بكفاءة عالية أثناء تسخين العينات. ^{[ 13 ] [ 11 ] [ 12 ]} وتتشابه المزايا والعيوب مع تلك الخاصة بعمر التألق، باستثناء وجود أمثلة أكثر في الأدبيات العلمية لاستخدام هذه التقنية. ^{[ 2 ]} تستخدم تقنية nanoDSF التألق الذاتي لبقايا التربتوفان الموجودة في العديد من البروتينات لمراقبة طي البروتين واستقراره. ولأن تألق التربتوفان يعتمد على البيئة الكيميائية المحلية، فإن تفكك البروتين يُعرّض البقايا المدفونة للماء، وعادةً ما يُغيّر الحد الأقصى للانبعاث من حوالي 330 نانومتر إلى 350 نانومتر. ^{[ 28 ]}

يُتيح تشتت الضوء الساكن رصد أحجام الجزيئات في المحلول. وبما أن البروتينات تتجمع عادةً عند تمسخها (أو تُشكّل أليافًا)، فإن حجم الجزيئات المكتشفة سيزداد.

هذه الطريقة لا تتطلب استخدام علامات، وهي مستقلة عن بقايا محددة في البروتين أو تركيبة المحلول المنظم. الشرط الوحيد هو أن يتجمع البروتين/يتليف بعد عملية التمسخ، وأن يكون البروتين المطلوب قد تم تنقيته.

في تقنية التحلل البروتيني المتوازي السريع، يُضيف الباحث إنزيمًا بروتينيًا مقاومًا للحرارة ( ثيرموليسين ) ويأخذ عينات بالتوازي أثناء تسخينها في جهاز تدوير حراري متدرج. ^{[ 29 ]} ويمكن، على سبيل المثال ، إجراء تحليل ويسترن بلوت للبروتينات المُعبَّر عنها بمستويات منخفضة لتحديد درجة الحرارة التي يبدأ عندها البروتين بالتحلل. أما بالنسبة للبروتينات النقية أو عالية التركيز، فيُمكن الكشف المباشر عنها باستخدام تقنية SDS-PAGE، مما يُسهِّل التحديد الكمي المباشر باستخدام فلورة كوماسي. تستغل تقنية FastPP حقيقة أن البروتينات تصبح أكثر عرضة للتحلل البروتيني عند فك طيها، وأن إنزيم الثيرموليسين يقطع عند البقايا الكارهة للماء الموجودة عادةً في لب البروتينات.

لتقليل عبء العمل، يمكن استبدال لطخات ويسترن بتلوين هلام SDS-PAGE متعدد الهيستيدين ، بشرط أن يحتوي البروتين على مثل هذه العلامة ويتم التعبير عنه بكميات كافية.

يمكن استخدام تقنية FastPP على مخاليط البروتينات المعقدة غير المنقاة، والبروتينات المدمجة مع بروتينات أخرى، مثل GST أو GFP ، شريطة أن يكون التسلسل المستهدف في لطخة ويسترن، مثل His-tag ، مرتبطًا مباشرةً بالبروتين المراد فحصه. مع ذلك، يعتمد إنزيم الثيرموليسين المتوفر تجاريًا على أيونات الكالسيوم لكي يعمل، ويفقد بنيته عند درجة حرارة أعلى بقليل من 85 درجة مئوية. لذا، يجب أن يكون الكالسيوم موجودًا في المحلول المنظم، وأن تكون عوامل استخلاب الكالسيوم غائبة. كما أن وجود مركبات أخرى تتداخل مع وظيفة البروتياز (مثل التركيزات العالية من المنظفات) قد يُسبب مشاكل.

كما تم استخدام FASTpp لمراقبة عملية طي البروتينات غير المنظمة جوهريًا (IDPs) المقترنة بالربط.

يُعدّ اختبار الإزاحة الحرارية الخلوية (CETSA® ⁾ [ ^{30 ] تقنية} بيوفيزيائية قابلة للتطبيق على الخلايا الحية وكذلك خزعات الأنسجة. يعتمد اختبار CETSA® ^على اكتشاف إمكانية توليد منحنيات ذوبان البروتين في الخلايا السليمة، وأن ارتباط الدواء يؤدي إلى استقرار حراري كبير للبروتينات. عند حدوث التمسخ، تتجمع البروتينات، وبالتالي يمكن إزالتها بالطرد المركزي بعد تحلل الخلايا. يمكن الكشف عن البروتينات المستقرة الموجودة في الراشح، على سبيل المثال، باستخدام تقنية ويسترن بلوت، أو ألفا-ليزا، أو مطياف الكتلة. تتميز تقنية CETSA® بدقة عالية ^، وقابلية تكرارها، وانخفاض احتمالية ظهور نتائج إيجابية خاطئة. مع ذلك، من الممكن أن يرتبط مركب جزيئي صغير بعينة ما، أو ببروتين في مسار هدف معين. إذا حفّز هذا البروتين مزيدًا من استقرار بروتين الهدف الأصلي من خلال سلسلة من التفاعلات، فقد يظهر ذلك على شكل ارتباط مباشر بالهدف. تتميز هذه الطريقة بأنها لا تتطلب استخدام علامات، مما يجعلها قابلة للتطبيق على دراسات ارتباط الأدوية في نطاق واسع من الخلايا والأنسجة. كما يمكن إجراء تحليل CETSA® ^على مستخلصات الخلايا مقارنةً بالخلايا السليمة، مما يساعد على تحديد مدى اختراق العينة لغشاء الخلية.

نوعٌ من Thermofluor مُخصَّص للبروتينات الرابطة للفلافين. على غرار فحوصات ارتباط Thermofluor، يتم تسخين حجم صغير من محلول البروتين، ثم يُتتبَّع ازدياد الفلورة كدالة لدرجة الحرارة. على عكس Thermofluor، لا حاجة إلى صبغة فلورية خارجية، لأن عامل الفلافين المساعد موجودٌ بالفعل في البروتين الرابط للفلافين، وتتغير خصائص فلورته عند فكّ بنيته. ^{[ 31 ]}

يمكن استخدام كروماتوغرافيا الاستبعاد الحجمي مباشرةً لتقييم استقرار البروتين في وجود أو غياب الروابط. ^{[ 32 ]} تُسخّن عينات البروتين المنقى في حمام مائي أو جهاز دورات حرارية ، ثم تُبرّد، وتُفصل بالطرد المركزي لإزالة البروتينات المتجمعة، وتُجرى عليها عملية كروماتوغرافيا سائلة عالية الأداء (HPLC ). عند الوصول إلى درجة حرارة الانصهار وترسب البروتين أو تجمعه، ينخفض ​​ارتفاع الذروة ويزداد ارتفاع ذروة الفراغ. يمكن استخدام هذه النتائج لتحديد الروابط والمثبطات، وتحسين ظروف التنقية. ^{[ 33 ] [ 34 ]}

على الرغم من أن إنتاجية SEC-TS أقل من FSEC-TS، وتتطلب كميات كبيرة من البروتين المنقى، إلا أنها تتجنب أي تأثير للعلامة الفلورية على استقرار البروتين الظاهري.

في كروماتوغرافيا الاستبعاد الحجمي مع الكشف الفلوري، يُوسَم البروتين المراد دراسته بصبغة فلورية (مثلًا، ببروتين GFP ) ويُمرَّر عبر عمود ترشيح هلامي في نظام FPLC مزود بكاشف فلوري. يسمح المخطط الكروماتوغرافي الناتج للباحث بتقدير تشتت البروتين الموسوم ومستوى تعبيره في المحلول المنظم الحالي. ^{[ 35 ]} بما أنه يتم قياس الفلورة فقط، فإن البروتين الموسوم فقط هو الذي يظهر في المخطط الكروماتوغرافي. تُستخدم كروماتوغرافيا الاستبعاد الحجمي مع الكشف الفلوري عادةً لمقارنة نظائر البروتينات الغشائية أو لفحص المنظفات لإذابة بروتينات غشائية محددة.

في اختبار الثبات الحراري القائم على كروماتوغرافيا الاستبعاد الحجمي مع الكشف الفلوري (FSEC-TS)، تُسخّن العينات بنفس طريقة FastPP وCETSA، وبعد الطرد المركزي لإزالة الراسب، يُعالج الراشح بنفس طريقة FSEC. ^{[ 36 ]} تُلاحظ تجمعات أكبر في حجم الفراغ، بينما ينخفض ​​ارتفاع ذروة البروتين محل الاهتمام عند الوصول إلى درجة حرارة التفكك.

تبلغ درجة حرارة انصهار _{البروتين} الفلوري الأخضر (GFP) حوالي 76  درجة مئوية، لذا فإن هذه التقنية تقتصر على درجات حرارة أقل من 70  درجة مئوية. ^{[ 36 ]}

تُعدّ مستقبلات البروتين المقترن بالبروتين ج (GPCRs) بروتينات غشائية ذات أهمية دوائية . وقد كُشِفَ عن بنيتها البلورية بالأشعة السينية بعد فترة طويلة من الكشف عن بروتينات غشائية أخرى أقل أهمية. ولعلّ صعوبة الحصول على بلورات بروتينية لمستقبلات GPCRs تعود إلى مرونتها العالية. وقد تمّ الحصول على نسخ أقل مرونة منها عن طريق اقتطاعها، أو تحويرها، أو إدخال إنزيم الليزوزيم T4 في التسلسل المُعاد تركيبه. ومن بين الطرق التي استخدمها الباحثون لتوجيه هذه التعديلات، اختبار الثبات الحراري لارتباط الليجاند المشع. ^{[ 37 ]}

يُجرى التحليل بحضانة البروتين مع ربيطة مُشعّة لمدة 30 دقيقة عند درجة حرارة مُحددة، ثم يُبرّد على الجليد، ويُمرّر عبر عمود ترشيح هلامي صغير، ويُقاس مستوى الإشعاع في البروتين الخارج من العمود. يكون تركيز الربيطة المُشعّة كافيًا لتشبع البروتين. لا يستطيع البروتين المُتَمَسِّخ الارتباط بالربيطة المُشعّة، وبالتالي ينفصل البروتين والربيطة المُشعّة في عمود الترشيح الهلامي الصغير. عند فحص الطفرات، يُختار بناءً على الثبات الحراري في التكوين المحدد، أي إذا كانت الربيطة المُشعّة مُنشِّطة، يُختار بناءً على تكوين ارتباط المُنشِّط، وإذا كانت مُثبِّطة، يُختار بناءً على الثبات في تكوين ارتباط المُثبِّط.

تتميز المقايسات الإشعاعية بإمكانية التعامل مع كميات ضئيلة من البروتين. إلا أنها تتطلب التعامل مع مواد مشعة وجهداً يدوياً كبيراً. يجب معرفة نوع الرابطة ذات الألفة العالية للبروتين المراد دراسته، ويجب ألا يؤثر المحلول المنظم على ارتباط الرابطة الإشعاعية. كما يمكن لبعض المقايسات الحرارية الأخرى تحديد التكوينات المحددة بإضافة رابط من النوع المناسب إلى التجربة.

استُخدمت تقنية Thermofluor على نطاق واسع في حملات فحص الأدوية. ^{[ 15 ] [ 38 ] [ 19 ] [ 20 ] [ 16 ] [ 39 ] [ 40 ] [ 41 ] [ 10 ]} ونظرًا لقدرة Thermofluor على الكشف عن مواقع ارتباط عالية الألفة للجزيئات الصغيرة على البروتينات، فإنه يستطيع تحديد المركبات التي ترتبط بمواقع فرعية نشطة، أو مواقع عوامل مساعدة، أو مواقع ارتباط غير مباشرة، بكفاءة متساوية. تتطلب هذه الطريقة عادةً استخدام تراكيز أعلى من 10 أضعاف عتبة الارتباط المطلوبة لفحص المركبات. وبناءً على ذلك، فإن تحديد 5 ميكرومولار كعتبة معقولة للمركبات الفعالة يتطلب تركيزًا للرابط المختبر يتراوح بين 50 و100 ميكرومولار في بئر العينة. بالنسبة لمعظم مكتبات المركبات الدوائية، حيث لا تذوب العديد من المركبات عند تركيزات تتجاوز 100 ميكرومولار تقريبًا، فإن فحص مركبات متعددة يصبح غير ممكن بسبب مشاكل الذوبان. لا تتطلب فحوصات Thermofluor تطوير كواشف فحص مخصصة (مثل نظائر الركيزة القابلة للانقسام)، ولا تتطلب أي كواشف مشعة، وهي بشكل عام أقل حساسية لتأثيرات المركبات التي تتفاعل كيميائيًا مع بقايا الموقع النشط للبروتين، والتي تظهر بالتالي على أنها نتائج غير مرغوب فيها في فحوصات نشاط الإنزيم.

يمكن ربط قياسات درجة حرارة الانصهار ( Tm ₎ بتقنية Thermofluor كميًا بقيم ثابت التفكك (Kd _{) للدواء،} ^{[ 42 ]} على الرغم من أن ذلك يتطلب قياسات حرارية إضافية لإنثالبي تفكك البروتينات المستهدفة، والتي تُحدد باستخدام تقنية المسح الحراري التفاضلي (DSC). يتميز نطاق Thermofluor الديناميكي باتساعه الكبير، مما يسمح باستخدامه لاكتشاف مركبات فعالة بتركيزات ميكرومولية وتحسين المركبات الرائدة بتركيزات دون النانومولية، الأمر الذي يجعل هذه الطريقة مفيدة بشكل خاص في تطوير علاقات QSAR لتحسين المركبات الرائدة.

تتطلب العديد من البروتينات ارتباطًا متزامنًا أو متتابعًا لعدة ركائز وعوامل مساعدة و/أو مؤثرات تنظيمية. يمكن أن تساعد دراسات التألق الحراري للجزيئات التي ترتبط بمواقع فرعية في الموقع النشط، أو مواقع العوامل المساعدة، أو مواقع الارتباط التنظيمي، في توضيح خصائص محددة لآلية عمل الإنزيم، والتي قد تكون مهمة في تصميم حملات فعالة لفحص الأدوية ^{[ 43 ]} وفي توصيف آليات تثبيط جديدة. ^{[ 44 ]}

يمكن إجراء فحوصات أولية باستخدام تقنية Thermofluor، والتي تغطي نطاقًا واسعًا من قيم الأس الهيدروجيني، والقوة الأيونية، والمواد المضافة مثل أيونات المعادن والعوامل المساعدة. يُعدّ إنشاء سطح استجابة البروتين مفيدًا لتحديد ظروف الفحص المثلى، ويمكن أن يؤدي غالبًا إلى تحسين مخططات التنقية، وهو أمر ضروري لدعم حملات الفحص عالي الإنتاجية والدراسات الفيزيائية الحيوية. ^{[ 17 ] [ 45 ]}

تتضمن العديد من تطبيقات هندسة البروتين، سواءً في اكتشاف الأدوية أو في تطبيقات الفيزياء الحيوية، تعديل تسلسل الأحماض الأمينية للبروتين من خلال البتر، أو دمج النطاقات، أو التعديلات الموضعية، أو الطفرات العشوائية. يوفر جهاز Thermofluor طريقة عالية الإنتاجية لتقييم تأثيرات هذه التغيرات في التسلسل على استقرار البروتين، بالإضافة إلى وسائل لتطوير ظروف استقرار عند الحاجة. ^{[ 46 ] [ 47 ]}

على الرغم من أن البروتينات هياكل ديناميكية في المحلول، إلا أنه من المتوقع أن يكون تكوين بلورات البروتين مفضلاً عندما تكون جميع الجزيئات في أدنى حالة طاقة لها. وبالتالي، يُعد التقييم الحراري الفلوري للظروف التي تُثبّت البروتينات استراتيجية مفيدة لإيجاد ظروف التبلور المثلى ^{[ 9 ] [ 48 ] [ 8 ].}

بما أن تقنية Thermofluor هي فحص لا يتطلب استخدام علامات، ويكشف عن ارتباط الجزيئات الصغيرة بمواقع ارتباط عالية الألفة على البروتين المستهدف، فهي مناسبة تمامًا لاكتشاف مثبطات الجزيئات الصغيرة لتفاعلات البروتين-بروتين أو مواقع التعديل التغايري. ^{[ 49 ] [ 50 ]} وبالطبع، فإن إمكانية استهداف تفاعل البروتين-بروتين بجزيء صغير تتطلب وجود موقع ارتباط مناسب على البروتين المستهدف، يوفر تفاعلات طاقية محلية كافية للسماح بارتباط الدواء بشكل محدد.

غالبًا ما تُعزل البروتينات الغشائية في وجود عوامل مذيبة كارهة للماء، والتي قد تفصل الأصباغ الرابطة الكارهة للماء مثل 1,8-ANS وSYPRO orange، مما يُولّد خلفية فلورية تحجب ملاحظة إشارة ذوبان البروتين باستخدام Thermofluor. ومع ذلك، فإن التحسين الدقيق للظروف (مثل تجنب تكوين المذيلات للعامل المذيب) يُمكن أن يُنتج في كثير من الأحيان ظروفًا مُرضية للتحليل ^{[ 18 ] [ 20 ].}

غالبًا ما تكون الوظيفة البيوكيميائية للبروتينات المستهدفة، التي يتم تحديدها من خلال تقنيات تعطيل الجينات أو علم البروتينات، غير واضحة إذا كانت ذات تشابه منخفض في تسلسل الأحماض الأمينية مع بروتينات ذات وظائف معروفة. في كثير من الحالات، يمكن الحصول على معلومات مفيدة من خلال تحديد العوامل المساعدة الرابطة أو نظائر الركائز في تصنيف وظائف البروتينات. ويمكن أن تساعد هذه المعلومات، عند استخدام تقنية Thermofluor، في "فك شفرة" وظائف البروتينات التي قد تكون وظيفتها البيوكيميائية غير معروفة لولا ذلك. ^{[ 51 ] [ 52 ]}

أدت التطورات الحديثة إلى توسيع نطاق استخدام تقنيات قياس الإزاحة الحرارية لتحليل تفاعلات الليجاندات في الخلائط المعقدة، بما في ذلك الخلايا السليمة. أظهرت الملاحظات الأولية للبروتينات الفردية باستخدام التحلل البروتيني المتوازي السريع (FastPP) أن تثبيت البروتينات عن طريق ارتباط الليجاندات قد يُكسبها مقاومةً للهضم البروتيني بواسطة إنزيم الثيرموليسين. تم قياس الحماية مقارنةً بالبروتين المرجعي إما عن طريق تلوين البروتين على الهلام أو باستخدام تقنية ويسترن بلوت مع جسم مضاد مُوَسِّم مُوَجَّه إلى علامة مُلتحمة بالبروتين المستهدف. ^{[ 29 ]} يُعدّ اختبار الإزاحة الحرارية الخلوية (CETSA) طريقةً لرصد تأثير تثبيت ارتباط الدواء من خلال منع ترسيب البروتين غير العكوس، والذي يبدأ عادةً عند تعرض البروتين للتمسخ الحراري. في اختبار CETSA، تُسخَّن عينات من مستخلص الخلية مؤقتًا إلى درجات حرارة مختلفة، ثم تُفصل العينات بالطرد المركزي لفصل الأجزاء الذائبة عن البروتينات المترسبة. يُحدد وجود البروتين المستهدف في كل جزء قابل للذوبان باستخدام تقنية التلطيخ الغربي، ويُستخدم هذا التحديد لرسم منحنى ذوبان CETSA الذي يُمكن من خلاله الحصول على معلومات حول الاستهداف الحيوي، وتوزيع الدواء، والتوافر الحيوي. ^{[ 30 ]} تتطلب كل من تقنيتي FastPP وCETSA عمومًا استخدام الأجسام المضادة لتسهيل الكشف عن الهدف، وبالتالي تُستخدمان عادةً في الحالات التي تكون فيها هوية الهدف معروفة مسبقًا. تسعى التطورات الحديثة إلى دمج جوانب من نهجي FastPP وCETSA، وذلك بتقييم الحماية البروتينية المعتمدة على الربيطة للأهداف في الخلايا باستخدام مطياف الكتلة (MS) للكشف عن التحولات في أنماط التحلل البروتيني المرتبطة باستقرار البروتين. ^{[ 53 ]} لا تزال التطبيقات الحالية تتطلب معرفة مسبقة بالأهداف المتوقعة لتسهيل تحليل البيانات، ولكن التحسينات في استراتيجيات جمع بيانات مطياف الكتلة، إلى جانب استخدام أدوات حسابية وهياكل قواعد بيانات مُحسّنة، يُمكن أن تسمح باستخدام هذا النهج لفك تشفير الهدف من الصفر على نطاق بروتينات الخلية الكاملة. سيكون هذا بمثابة تقدم كبير في اكتشاف الأدوية لأنه سيسمح بتحديد الأهداف الجزيئية المنفصلة (بالإضافة إلى التفاعلات خارج الهدف) للأدوية التي تم تحديدها من خلال عمليات الفحص الخلوي أو الظاهري عالية المحتوى للأدوية.