الاستنساخ الجزيئي

الموسوعة الحرة
رسم تخطيطي للاستنساخ الجزيئي باستخدام البكتيريا والبلازميدات

الاستنساخ الجزيئي هو مجموعة من الطرق التجريبية في علم الأحياء الجزيئي التي تستخدم لتجميع جزيئات الحمض النووي المؤتلف وتوجيه تكرارها داخل الكائنات المضيفة . [1] يشير استخدام كلمة الاستنساخ إلى حقيقة أن الطريقة تنطوي على تكرار جزيء واحد لإنتاج مجموعة من الخلايا ذات جزيئات الحمض النووي المتطابقة. يستخدم الاستنساخ الجزيئي عمومًا تسلسلات الحمض النووي من كائنين مختلفين: النوع الذي يعد مصدر الحمض النووي المراد استنساخه، والنوع الذي سيعمل كمضيف حي لتكرار الحمض النووي المؤتلف. تعد طرق الاستنساخ الجزيئي مركزية للعديد من المجالات المعاصرة في علم الأحياء والطب الحديث. [2]

في تجربة الاستنساخ الجزيئي التقليدية، يتم الحصول على الحمض النووي المراد استنساخه من كائن حي موضع اهتمام، ثم يتم معالجته بالإنزيمات في أنبوب الاختبار لتوليد شظايا الحمض النووي الأصغر. بعد ذلك، يتم دمج هذه الشظايا مع الحمض النووي المتجه لتوليد جزيئات الحمض النووي المعاد التركيب. ثم يتم إدخال الحمض النووي المعاد تركيبه إلى كائن حي مضيف (عادةً سلالة مختبرية سهلة النمو وحميدة من بكتيريا الإشريكية القولونية ). سيؤدي هذا إلى توليد مجموعة من الكائنات الحية التي يتم فيها تكرار جزيئات الحمض النووي المعاد تركيبه جنبًا إلى جنب مع الحمض النووي المضيف. نظرًا لأنها تحتوي على شظايا حمض نووي غريبة، فهي كائنات دقيقة معدلة وراثيًا أو معدلة وراثيًا ( GMOs ). [3] تستفيد هذه العملية من حقيقة أنه يمكن تحريض خلية بكتيرية واحدة على تناول وتكرار جزيء واحد من الحمض النووي المعاد تركيبه. يمكن بعد ذلك توسيع هذه الخلية المفردة بشكل كبير لتوليد عدد كبير من البكتيريا، تحتوي كل منها على نسخ من الجزيء المعاد تركيبه الأصلي. وبالتالي، يُشار عادةً إلى كل من مجموعة البكتيريا الناتجة وجزيء الحمض النووي المؤتلف باسم "الاستنساخ". وبالمعنى الدقيق للكلمة، يشير الحمض النووي المؤتلف إلى جزيئات الحمض النووي، في حين يشير الاستنساخ الجزيئي إلى الأساليب التجريبية المستخدمة لتجميعها. نشأت الفكرة بأن تسلسلات الحمض النووي المختلفة يمكن إدراجها في بلازميد وأن هذه التسلسلات الغريبة سيتم نقلها إلى البكتيريا وهضمها كجزء من البلازميد. أي أن هذه البلازميدات يمكن أن تعمل كناقلات استنساخ لحمل الجينات. [4]

يمكن استنساخ أي تسلسل DNA تقريبًا وتضخيمه، ولكن هناك بعض العوامل التي قد تحد من نجاح العملية. ومن أمثلة تسلسلات DNA التي يصعب استنساخها التكرارات المقلوبة وأصول التضاعف والسنترومير والتيلوميرات. كما تقل فرصة النجاح عند إدخال تسلسلات DNA كبيرة الحجم. فالإدخالات التي يزيد طولها عن 10 كيلو بايت تكون محدودة النجاح للغاية، ولكن يمكن تعديل البكتيريا مثل البكتيريا λ لإدخال تسلسل يصل طوله إلى 40 كيلو بايت بنجاح. [5]

تاريخ

قبل سبعينيات القرن العشرين، كان فهم علم الوراثة وعلم الأحياء الجزيئي معوقًا بشدة بسبب عدم القدرة على عزل ودراسة الجينات الفردية من الكائنات الحية المعقدة. تغير هذا بشكل كبير مع ظهور طرق الاستنساخ الجزيئي. علماء الأحياء الدقيقة، الذين يسعون إلى فهم الآليات الجزيئية التي من خلالها تقيد البكتيريا نمو البكتيريا، عزلوا نوكليازات التقييد ، وهي إنزيمات يمكنها شق جزيئات الحمض النووي فقط عند مواجهة تسلسلات الحمض النووي المحددة. [6] أظهروا أن إنزيمات التقييد شقت جزيئات الحمض النووي بطول الكروموسوم في مواقع محددة، وأنه يمكن تنقية أقسام معينة من الجزيء الأكبر عن طريق التجزئة الحجمية. باستخدام إنزيم ثانٍ، رباط الحمض النووي ، يمكن ربط الأجزاء الناتجة عن إنزيمات التقييد في تركيبات جديدة، تسمى الحمض النووي المؤتلف . من خلال إعادة دمج أجزاء من الحمض النووي ذات الاهتمام مع الحمض النووي الناقل، مثل البكتيريا أو البلازميدات، والتي تتكاثر بشكل طبيعي داخل البكتيريا، يمكن إنتاج كميات كبيرة من جزيئات الحمض النووي المعاد تركيبها في مزارع البكتيريا. تم إنشاء أول جزيئات الحمض النووي المعاد تركيبها ودراستها في عام 1972. [7] [8]

ملخص

يستفيد الاستنساخ الجزيئي من حقيقة أن البنية الكيميائية للحمض النووي هي نفسها بشكل أساسي في جميع الكائنات الحية. لذلك، إذا تم إدخال أي جزء من الحمض النووي من أي كائن حي في جزء من الحمض النووي يحتوي على التسلسلات الجزيئية المطلوبة لتكرار الحمض النووي ، وتم إدخال الحمض النووي المعاد التركيب الناتج في الكائن الحي الذي تم الحصول منه على تسلسلات التكرار، فسيتم تكرار الحمض النووي الغريب مع الحمض النووي للخلية المضيفة في الكائن الحي المعدل وراثيًا .

الاستنساخ الجزيئي يشبه تفاعل البوليميراز المتسلسل في أنه يسمح بتكرار تسلسل الحمض النووي. والفرق الأساسي بين الطريقتين هو أن الاستنساخ الجزيئي ينطوي على تكرار الحمض النووي في كائن حي دقيق، بينما يكرر تفاعل البوليميراز المتسلسل الحمض النووي في محلول في المختبر ، خالٍ من الخلايا الحية.

في الحاسوبالاستنساخ والمحاكاة

قبل إجراء تجارب الاستنساخ الفعلية في المختبر، يتم التخطيط لمعظم تجارب الاستنساخ على جهاز كمبيوتر، باستخدام برامج متخصصة. على الرغم من أنه يمكن إجراء التخطيط التفصيلي للاستنساخ في أي محرر نصوص، جنبًا إلى جنب مع الأدوات المساعدة عبر الإنترنت مثل تصميم برايمر تفاعل البوليميراز المتسلسل، إلا أن هناك برامج مخصصة لهذا الغرض. تشمل البرامج المخصصة لهذا الغرض على سبيل المثال ApE [1] (مفتوح المصدر)، وDNAStrider [2] (مفتوح المصدر)، وSerial Cloner [3] (مجاني)، وColagene [4] (مفتوح المصدر)، وSnapGene (تجاري). تسمح هذه البرامج بمحاكاة تفاعلات تفاعل البوليميراز المتسلسل ، وعمليات الهضم التقييدية ، والربط ، وما إلى ذلك، أي جميع الخطوات الموضحة أدناه.

خطوات

الهدف العام للاستنساخ الجزيئي هو أخذ جين مهم من بلازميد واحد وإدخاله في بلازميد آخر. [9] يتم ذلك عن طريق إجراء تفاعل البوليميراز المتسلسل، وتفاعل الهضم، وتفاعل الربط، والتحويل.

في تجارب الاستنساخ الجزيئي القياسية، يتضمن استنساخ أي جزء من الحمض النووي سبع خطوات أساسية: (1) اختيار الكائن المضيف وناقل الاستنساخ، (2) إعداد الحمض النووي للناقل، (3) إعداد الحمض النووي المراد استنساخه، (4) إنشاء الحمض النووي المعاد التركيب، (5) إدخال الحمض النووي المعاد التركيب إلى الكائن المضيف، (6) اختيار الكائنات الحية التي تحتوي على الحمض النووي المعاد التركيب، (7) البحث عن المستنسخات ذات إدخالات الحمض النووي المرغوبة والخصائص البيولوجية.

من الجدير بالملاحظة أن القدرة المتزايدة والدقة لمنصات تخليق الحمض النووي تسمح بتصميمات معقدة بشكل متزايد في الهندسة الجزيئية. قد تتضمن هذه المشاريع خيوطًا طويلة جدًا من تسلسل الحمض النووي الجديد و/أو اختبار مكتبات كاملة في وقت واحد، بدلاً من التسلسلات الفردية. تؤدي هذه التحولات إلى تعقيد يتطلب من التصميم الابتعاد عن التمثيل المسطح القائم على النوكليوتيدات نحو مستوى أعلى من التجريد. ومن أمثلة هذه الأدوات GenoCAD وTeselagen [5] (مجاني للأوساط الأكاديمية) أو GeneticConstructor [6] (مجاني للأوساط الأكاديمية).

اختيار الكائن المضيف وناقل الاستنساخ

رسم تخطيطي لبلازميد استنساخ شائع الاستخدام؛ pBR322 . إنه قطعة دائرية من الحمض النووي يبلغ طولها 4361 قاعدة. يوجد جينان لمقاومة المضادات الحيوية، مما يمنح مقاومة الأمبيسلين والتتراسيكلين ، ومصدر تكرار يستخدمه المضيف لتكرار الحمض النووي.

على الرغم من استخدام عدد كبير جدًا من الكائنات المضيفة ونواقل الاستنساخ الجزيئي، فإن الغالبية العظمى من تجارب الاستنساخ الجزيئي تبدأ بسلالة معملية من بكتيريا الإشريكية القولونية ( Escherichia coli ) وناقل استنساخ بلازميدي . تُستخدم ناقلات الإشريكية القولونية والبلازميد بشكل شائع لأنها متطورة تقنيًا ومتعددة الاستخدامات ومتوفرة على نطاق واسع وتوفر نموًا سريعًا للكائنات الحية المعاد تركيبها باستخدام الحد الأدنى من المعدات. [3] إذا كان الحمض النووي المراد استنساخه كبيرًا بشكل استثنائي (مئات الآلاف إلى ملايين أزواج القواعد)، فغالبًا ما يتم اختيار كروموسوم اصطناعي بكتيري [10] أو ناقل كروموسوم اصطناعي خميرة .

قد تتطلب التطبيقات المتخصصة أنظمة ناقل مضيف متخصصة. على سبيل المثال، إذا رغب الباحثون التجريبيون في حصاد بروتين معين من الكائن الحي المعاد تركيبه، فيتم اختيار ناقل تعبير يحتوي على إشارات مناسبة للنسخ والترجمة في الكائن الحي المضيف المطلوب. بدلاً من ذلك، إذا كانت هناك رغبة في تكرار الحمض النووي في أنواع مختلفة (على سبيل المثال، نقل الحمض النووي من البكتيريا إلى النباتات)، فيمكن اختيار ناقل متعدد النطاقات المضيفة (يُطلق عليه أيضًا ناقل المكوك ). ومع ذلك، في الممارسة العملية، تبدأ تجارب الاستنساخ الجزيئي المتخصصة عادةً بالاستنساخ في بلازميد بكتيري، يليه استنساخ فرعي في ناقل متخصص.

مهما كانت تركيبة المضيف والناقل المستخدمة، فإن الناقل يحتوي دائمًا تقريبًا على أربعة أجزاء من الحمض النووي والتي تعتبر مهمة للغاية لوظيفته وفائدته التجريبية: [3]

  • يعد أصل تكرار الحمض النووي ضروريًا لتكاثر الناقل (والتسلسلات المعاد تركيبها المرتبطة به) داخل الكائن المضيف
  • موقع أو أكثر من مواقع التعرف على نوكليازات التقييد الفريدة لتكون بمثابة مواقع يمكن من خلالها إدخال الحمض النووي الغريب
  • جين علامة وراثية قابل للتحديد يمكن استخدامه لتمكين بقاء الخلايا التي تبنت تسلسلات ناقلة
  • جين وسم يمكن استخدامه لفحص الخلايا التي تحتوي على الحمض النووي الغريب
انقسام تسلسل الحمض النووي الذي يحتوي على موقع تقييد BamHI . يتم انقسام الحمض النووي عند التسلسل المتماثل لإنتاج "نهايات لاصقة".

تحضير ناقل الحمض النووي

يتم التعامل مع ناقل الاستنساخ باستخدام نوكلياز تقييد لشق الحمض النووي في الموقع الذي سيتم فيه إدخال الحمض النووي الغريب. يتم اختيار إنزيم القيد لتوليد تكوين في موقع الانقسام متوافق مع نهايات الحمض النووي الغريب (انظر نهاية الحمض النووي ). عادةً، يتم ذلك عن طريق شق الحمض النووي للناقل والحمض النووي الغريب بنفس إنزيم القيد أو نوكلياز القيد، على سبيل المثال EcoRI وتم عزل إنزيم القيد هذا من E.coli. [11] تحتوي معظم النواقل الحديثة على مجموعة متنوعة من مواقع الانقسام الملائمة الفريدة داخل جزيء الناقل (بحيث لا يمكن شق الناقل إلا في موقع واحد) وتقع داخل جين (غالبًا بيتا غالاكتوزيداز ) يمكن استخدام تعطيله للتمييز بين الكائنات الحية المعاد تركيبها وغير المعاد تركيبها في خطوة لاحقة من العملية. لتحسين نسبة الكائنات الحية المعاد تركيبها إلى الكائنات الحية غير المعاد تركيبها، يمكن معالجة الناقل المشقوق بإنزيم ( فوسفاتاز قلوي ) يعمل على إزالة الفسفرة من نهايات الناقل. لا تستطيع جزيئات الناقل ذات النهايات الخالية من الفسفرة التكاثر، ولا يمكن استعادة التكاثر إلا إذا تم دمج الحمض النووي الغريب في موقع الانقسام. [12]

إعداد الحمض النووي المراد استنساخه

يتم إنتاج الحمض النووي للاستنساخ عادة باستخدام تفاعل البوليميراز المتسلسل . يتم خلط الحمض النووي النموذجي مع القواعد (كتل بناء الحمض النووي) والبادئات (قطع قصيرة من الحمض النووي المفرد التكميلي) وإنزيم بوليميراز الحمض النووي الذي يبني سلسلة الحمض النووي. يمر الخليط بدورات من التسخين والتبريد لإنتاج كميات كبيرة من الحمض النووي المنسوخ.

بالنسبة لاستنساخ الحمض النووي الجينومي، يتم استخراج الحمض النووي المراد استنساخه من الكائن الحي المطلوب. يمكن استخدام أي مصدر أنسجة تقريبًا (حتى الأنسجة من الحيوانات المنقرضة )، [13] طالما أن الحمض النووي لم يتحلل على نطاق واسع. ثم يتم تنقية الحمض النووي باستخدام طرق بسيطة لإزالة البروتينات الملوثة (الاستخراج بالفينول) والحمض النووي الريبي (الريبونوكلياز) والجزيئات الأصغر (الترسيب و/أو الكروماتوغرافيا). غالبًا ما تُستخدم طرق تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR) لتضخيم تسلسلات الحمض النووي أو الحمض النووي الريبي المحددة ( RT-PCR ) قبل الاستنساخ الجزيئي.

يمكن أيضًا الحصول على الحمض النووي لتجارب الاستنساخ من الحمض النووي الريبي باستخدام النسخ العكسي ( استنساخ الحمض النووي التكميلي أو الحمض النووي الريبي التكميلي)، أو في شكل الحمض النووي الاصطناعي ( التخليق الجيني الاصطناعي ). يستخدم استنساخ الحمض النووي التكميلي عادةً للحصول على استنساخات تمثل مجموعة الحمض النووي الريبي المرسال للخلايا المعنية، بينما يستخدم الحمض النووي الاصطناعي للحصول على أي تسلسل دقيق يحدده المصمم. قد يكون مثل هذا التسلسل المصمم مطلوبًا عند نقل الجينات عبر الشفرات الجينية (على سبيل المثال، من الميتوكوندريا إلى النواة) [14] أو ببساطة لزيادة التعبير عبر تحسين الكودون . [15]

يتم بعد ذلك معالجة الحمض النووي المنقى باستخدام إنزيم تقييد لتوليد شظايا ذات نهايات قادرة على الارتباط بنهايات الناقل. إذا لزم الأمر، يمكن إضافة أجزاء قصيرة مزدوجة السلسلة من الحمض النووي ( روابط ) تحتوي على مواقع تقييد مرغوبة لإنشاء هياكل نهائية متوافقة مع الناقل. [3] [12]

إنشاء الحمض النووي المؤتلف باستخدام رباط الحمض النووي

إن إنشاء الحمض النووي المؤتلف هو في كثير من النواحي أبسط خطوة في عملية الاستنساخ الجزيئي. يتم خلط الحمض النووي المحضر من الناقل والمصدر الغريب معًا ببساطة بتركيزات مناسبة وتعريضه لإنزيم ( رباط الحمض النووي ) الذي يربط الأطراف معًا تساهميًا. غالبًا ما يُطلق على تفاعل الربط هذا اسم الربط . ثم يصبح خليط الحمض النووي الناتج الذي يحتوي على أطراف مترابطة عشوائيًا جاهزًا للإدخال إلى الكائن المضيف.

لا يتعرف رباط الحمض النووي إلا على نهايات جزيئات الحمض النووي الخطية ويعمل عليها، مما يؤدي عادة إلى خليط معقد من جزيئات الحمض النووي ذات النهايات المتصلة عشوائيًا. ستكون المنتجات المطلوبة (الحمض النووي المتجه المرتبط تساهميًا بالحمض النووي الغريب) موجودة، ولكن عادةً ما تكون هناك تسلسلات أخرى (على سبيل المثال الحمض النووي الغريب المرتبط بنفسه، والحمض النووي المتجه المرتبط بنفسه، والتركيبات ذات الترتيب الأعلى من الحمض النووي المتجه والغريب). يتم فرز هذا الخليط المعقد في الخطوات اللاحقة من عملية الاستنساخ، بعد إدخال خليط الحمض النووي في الخلايا. [3] [12]

إدخال الحمض النووي المؤتلف إلى الكائن الحي المضيف

يتم نقل خليط الحمض النووي، الذي تم معالجته مسبقًا في المختبر، مرة أخرى إلى خلية حية، يشار إليها بالكائن الحي المضيف. تتنوع الطرق المستخدمة لإدخال الحمض النووي إلى الخلايا، وغالبًا ما يعتمد الاسم المطبق على هذه الخطوة في عملية الاستنساخ الجزيئي على الطريقة التجريبية المختارة (على سبيل المثال التحويل ، والتحويل الجيني ، والتحويل الجيني ، والكهرباء ). [3] [12]

عندما تتمكن الكائنات الحية الدقيقة من أخذ الحمض النووي وتكراره من بيئتها المحلية، تسمى هذه العملية بالتحول ، ويقال إن الخلايا التي تكون في حالة فسيولوجية بحيث يمكنها أخذ الحمض النووي تكون كفؤة . [16] في زراعة الخلايا الثديية، تسمى العملية التناظرية لإدخال الحمض النووي إلى الخلايا عادةً بالتحويل الجيني . يتطلب كل من التحويل والنقل الجيني عادةً تحضير الخلايا من خلال نظام نمو خاص وعملية معالجة كيميائية تختلف باختلاف الأنواع وأنواع الخلايا المحددة المستخدمة.

تستخدم الكهرومسام نبضات كهربائية عالية الجهد لنقل الحمض النووي عبر غشاء الخلية (وجدار الخلية، إذا كان موجودًا). ​​[17] وعلى النقيض من ذلك، تتضمن عملية النقل تغليف الحمض النووي في جزيئات مشتقة من الفيروسات، واستخدام هذه الجزيئات الشبيهة بالفيروسات لإدخال الحمض النووي المغلف إلى الخلية من خلال عملية تشبه العدوى الفيروسية. على الرغم من أن الكهرومسام والتحويل طريقتان متخصصتان للغاية، إلا أنهما قد تكونان أكثر الطرق كفاءة لنقل الحمض النووي إلى الخلايا.

اختيار الكائنات الحية التي تحتوي على تسلسلات ناقلة

أياً كانت الطريقة المستخدمة، فإن إدخال الحمض النووي المؤتلف إلى الكائن المضيف المختار عادة ما يكون عملية منخفضة الكفاءة؛ أي أن جزءاً صغيراً فقط من الخلايا سوف يستوعب الحمض النووي بالفعل. ويتعامل العلماء التجريبيون مع هذه القضية من خلال خطوة من خطوات الانتقاء الجيني الاصطناعي، حيث يتم قتل الخلايا التي لم تستوعب الحمض النووي بشكل انتقائي، ولا تتمكن من البقاء إلا الخلايا القادرة على تكرار الحمض النووي الذي يحتوي على الجين المحدد الذي تم ترميزه بواسطة الناقل. [3] [12]

عندما تُستخدم الخلايا البكتيرية ككائنات مضيفة، يكون المؤشر القابل للاختيار عادةً عبارة عن جين يمنح مقاومة لمضاد حيوي من شأنه أن يقتل الخلايا بخلاف ذلك، وعادةً ما يكون الأمبيسلين . ستبقى الخلايا التي تحتوي على البلازميد على قيد الحياة عند تعرضها للمضاد الحيوي، بينما تموت الخلايا التي فشلت في استيعاب تسلسلات البلازميد. عند استخدام الخلايا الثديية (مثل خلايا الإنسان أو الفئران)، تُستخدم استراتيجية مماثلة، باستثناء أن جين المؤشر (في هذه الحالة عادةً ما يتم ترميزه كجزء من شريط kanMX ) يمنح مقاومة للمضاد الحيوي Geneticin .

البحث عن المستنسخات التي تحتوي على إدخالات الحمض النووي والخصائص البيولوجية المرغوبة

تستخدم ناقلات الاستنساخ البكتيري الحديثة (مثل pUC19 ومشتقاته اللاحقة بما في ذلك ناقلات pGEM) نظام الفحص الأزرق والأبيض للتمييز بين مستعمرات (مستنسخات) الخلايا المعدلة وراثيًا وتلك التي تحتوي على الناقل الأصلي (أي الحمض النووي للناقل بدون تسلسل معاد التركيب). في هذه المتجهات، يتم إدخال الحمض النووي الغريب في تسلسل يشفر جزءًا أساسيًا من بيتا غالاكتوزيداز ، وهو إنزيم يؤدي نشاطه إلى تكوين مستعمرة زرقاء اللون على وسط الثقافة المستخدم في هذا العمل. يؤدي إدخال الحمض النووي الغريب في تسلسل ترميز بيتا غالاكتوزيداز إلى تعطيل وظيفة الإنزيم بحيث تظل المستعمرات التي تحتوي على الحمض النووي المحول عديمة اللون (أبيض). لذلك، يتمكن التجريبيون بسهولة من تحديد وإجراء المزيد من الدراسات على المستنسخات البكتيرية المعدلة وراثيًا، مع تجاهل تلك التي لا تحتوي على الحمض النووي المعاد التركيب.

غالبًا ما يُطلق على إجمالي عدد النسخ الفردية التي تم الحصول عليها في تجربة استنساخ جزيئي مصطلح مكتبة الحمض النووي . قد تكون المكتبات معقدة للغاية (كما هو الحال عند استنساخ الحمض النووي الجينومي الكامل من كائن حي) أو بسيطة نسبيًا (كما هو الحال عند نقل جزء من الحمض النووي المستنسخ مسبقًا إلى بلازميد مختلف)، ولكن من الضروري دائمًا فحص عدد من النسخ المختلفة للتأكد من الحصول على بنية الحمض النووي المطلوبة. يمكن تحقيق ذلك من خلال مجموعة واسعة جدًا من الأساليب التجريبية، بما في ذلك استخدام تهجينات الأحماض النووية ، ومجسات الأجسام المضادة ، وتفاعل البوليميراز المتسلسل ، وتحليل شظايا القيد و/أو تسلسل الحمض النووي . [3] [12]

التطبيقات

يوفر الاستنساخ الجزيئي للعلماء كمية غير محدودة من أي أجزاء فردية من الحمض النووي مشتقة من أي جينوم. ويمكن استخدام هذه المادة لمجموعة واسعة من الأغراض، بما في ذلك تلك المستخدمة في العلوم البيولوجية الأساسية والتطبيقية. وفيما يلي تلخيص لبعض التطبيقات الأكثر أهمية.

تنظيم الجينوم والتعبير الجيني

لقد أدى الاستنساخ الجزيئي بشكل مباشر إلى توضيح التسلسل الكامل للحمض النووي لجينومات عدد كبير جدًا من الأنواع وإلى استكشاف التنوع الجيني داخل الأنواع الفردية، وهو العمل الذي تم إنجازه في الغالب من خلال تحديد تسلسل الحمض النووي لأعداد كبيرة من أجزاء الجينوم المستنسخة عشوائيًا، وتجميع التسلسلات المتداخلة.

على مستوى الجينات الفردية، تُستخدم المستنسخات الجزيئية لتوليد مجسات تُستخدم لفحص كيفية التعبير عن الجينات ، وكيف يرتبط هذا التعبير بعمليات أخرى في علم الأحياء، بما في ذلك البيئة الأيضية، والإشارات خارج الخلية، والتطور، والتعلم، والشيخوخة وموت الخلايا. يمكن للجينات المستنسخة أيضًا توفير أدوات لفحص الوظيفة البيولوجية وأهمية الجينات الفردية، من خلال السماح للمحققين بتعطيل الجينات ، أو إجراء طفرات أكثر دقة باستخدام الطفرات الإقليمية أو الطفرات الموجهة للموقع . توفر الجينات المستنسخة في متجهات التعبير للاستنساخ الوظيفي وسيلة لفحص الجينات على أساس وظيفة البروتين المعبر عنه.

إنتاج البروتينات المعاد تركيبها

إن الحصول على نسخة جزيئية من جين ما قد يؤدي إلى تطوير كائنات حية تنتج المنتج البروتيني للجينات المستنسخة، والذي يطلق عليه اسم البروتين المعاد التركيب. وفي الممارسة العملية، كثيراً ما يكون تطوير كائن حي ينتج شكلاً نشطاً من البروتين المعاد تركيبه بكميات مرغوبة أكثر صعوبة من استنساخ الجين. ويرجع هذا إلى أن الإشارات الجزيئية للتعبير الجيني معقدة ومتغيرة، ولأن طي البروتين واستقراره ونقله قد يكون صعباً للغاية.

يتوفر حاليًا العديد من البروتينات المفيدة كمنتجات معاد التركيب . وتشمل هذه - (1) البروتينات المفيدة طبيًا والتي يمكن لإدارتها تصحيح جين معيب أو ضعيف التعبير (على سبيل المثال، العامل الثامن المعاد التركيب ، وهو عامل تخثر الدم الناقص في بعض أشكال الهيموفيليا ، [18] والأنسولين المعاد التركيب ، المستخدم لعلاج بعض أشكال مرض السكري [19] )، (2) البروتينات التي يمكن إعطاؤها للمساعدة في حالة الطوارئ المهددة للحياة (على سبيل المثال، منشط البلازمينوجين النسيجي ، المستخدم لعلاج السكتات الدماغية [20] )، (3) لقاحات الوحدة الفرعية المعاد تركيبها، حيث يمكن استخدام بروتين نقي لتحصين المرضى ضد الأمراض المعدية، دون تعريضهم للعامل المعدي نفسه (على سبيل المثال، لقاح التهاب الكبد ب [21] )، و (4) البروتينات المعاد تركيبها كمواد قياسية للاختبارات المعملية التشخيصية.

الكائنات الحية المعدلة وراثيا

بمجرد وصف الجينات المستنسخة ومعالجتها لتوفير إشارات للتعبير المناسب، يمكن إدخالها في الكائنات الحية، مما يؤدي إلى إنتاج كائنات معدلة وراثيًا، والتي يطلق عليها أيضًا الكائنات المعدلة وراثيًا (GMOs). على الرغم من أن معظم الكائنات المعدلة وراثيًا يتم إنتاجها لأغراض البحث البيولوجي الأساسي (انظر على سبيل المثال، الفأر المعدل وراثيًا )، فقد تم تطوير عدد من الكائنات المعدلة وراثيًا للاستخدام التجاري، بدءًا من الحيوانات والنباتات التي تنتج الأدوية أو المركبات الأخرى ( الصيدلة )، والنباتات المقاومة لمبيدات الأعشاب ، والأسماك الاستوائية الفلورية ( GloFish ) للترفيه المنزلي. [1]

العلاج الجيني

يتضمن العلاج الجيني تزويد الخلايا التي تفتقر إلى تلك الوظيفة بجين وظيفي، بهدف تصحيح اضطراب وراثي أو مرض مكتسب. يمكن تقسيم العلاج الجيني على نطاق واسع إلى فئتين. الأولى هي تغيير الخلايا الجرثومية، أي الحيوانات المنوية أو البويضات، مما يؤدي إلى تغيير وراثي دائم للكائن الحي بأكمله والأجيال اللاحقة. يعتبر "العلاج الجيني للخط الجرثومي" هذا من قبل الكثيرين غير أخلاقي بالنسبة للبشر. [22] النوع الثاني من العلاج الجيني، "العلاج الجيني للخلايا الجسدية"، يشبه عملية زرع الأعضاء. في هذه الحالة، يتم استهداف نسيج واحد أو أكثر من الأنسجة المحددة عن طريق العلاج المباشر أو عن طريق إزالة النسيج، وإضافة الجين أو الجينات العلاجية في المختبر، وإعادة الخلايا المعالجة إلى المريض. بدأت التجارب السريرية للعلاج الجيني للخلايا الجسدية في أواخر التسعينيات، في الغالب لعلاج السرطان واضطرابات الدم والكبد والرئة. [23]

وعلى الرغم من الدعاية الكبيرة والوعود، فقد اتسم تاريخ العلاج الجيني البشري بنجاح محدود نسبيًا. [23] وغالبًا ما يعزز تأثير إدخال جين إلى الخلايا تخفيفًا جزئيًا و/أو مؤقتًا لأعراض المرض الذي يتم علاجه. وقد عانى بعض مرضى تجارب العلاج الجيني من عواقب وخيمة للعلاج نفسه، بما في ذلك الوفيات. وفي بعض الحالات، تنجم الآثار الضارة عن تعطيل الجينات الأساسية داخل جينوم المريض عن طريق التعطيل الإدراجي. وفي حالات أخرى، تلوثت النواقل الفيروسية المستخدمة في العلاج الجيني بفيروس معدي. ومع ذلك، لا يزال العلاج الجيني يُعَد مجالًا واعدًا في الطب في المستقبل، وهو مجال يشهد مستوى كبيرًا من نشاط البحث والتطوير.

مراجع

  1. ^ ab Watson JD (2007). الحمض النووي المؤتلف: الجينات والجينومات: دورة قصيرة . سان فرانسيسكو: WH Freeman. ISBN 978-0-7167-2866-5.
  2. ^ Patten CL, Glick BR, Pasternak J (2009). التكنولوجيا الحيوية الجزيئية: مبادئ وتطبيقات الحمض النووي المؤتلف . واشنطن العاصمة: ASM Press. ISBN 978-1-55581-498-4.
  3. ^ abcdefgh Brown T (2006). استنساخ الجينات وتحليل الحمض النووي: مقدمة . كامبريدج، ماساتشوستس: دار بلاكويل للنشر. رقم ISBN 978-1-4051-1121-8.
  4. ^ Garrett RH, Grisham CM (2013). الكيمياء الحيوية (الطبعة الخامسة). Brooks/Cole, Cengage Learning. ISBN 978-1-133-10629-6. OCLC  777722371.
  5. ^ Garrett RH, Grisham CM (2010). Biochemistry (الطبعة الرابعة). Belmont, CA, Brooks/Cole: Cengage Learning. ص. 380. ISBN 978-0-495-10935-8. OCLC  297392560.
  6. ^ Nathans D, Smith HO (1975). "Restriction endonucleases in the analysis and restructuring of dna molecular". Annual Review of Biochemistry . 44 : 273–93. doi :10.1146/annurev.bi.44.070175.001421. PMID  166604.
  7. ^ Cohen SN, Chang AC, Boyer HW, Helling RB (Nov 1973). "إنشاء البلازميدات البكتيرية الوظيفية بيولوجيًا في المختبر". وقائع الأكاديمية الوطنية للعلوم في الولايات المتحدة الأمريكية . 70 (11): 3240–4. Bibcode :1973PNAS...70.3240C. doi : 10.1073 /pnas.70.11.3240 . PMC 427208. PMID  4594039. 
  8. ^ جاكسون دي إيه، سيمونز آر إتش، بيرج بي (أكتوبر 1972). "الطريقة الكيميائية الحيوية لإدخال معلومات وراثية جديدة في الحمض النووي لفيروس القردة 40: جزيئات الحمض النووي الدائرية SV40 التي تحتوي على جينات فاج لامدا وأوبرون الجلاكتوز لإشريكية كولاي". وقائع الأكاديمية الوطنية للعلوم في الولايات المتحدة الأمريكية . 69 (10): 2904-9. رمز Bibcode : 1972PNAS...69.2904J. doi : 10.1073/pnas.69.10.2904 . PMC 389671. PMID  4342968 . 
  9. ^ "البلازميد / البلازميدات | تعلم العلوم في Scitable". www.nature.com . تم الاسترجاع في 2017-12-06 .
  10. ^ Shizuya H, Birren B, Kim UJ, Mancino V, Slepak T, Tachiiri Y, Simon M (سبتمبر 1992). "استنساخ وصيانة مستقرة لأجزاء من الحمض النووي البشري بطول 300 كيلو قاعدة في Escherichia coli باستخدام ناقل قائم على عامل F". وقائع الأكاديمية الوطنية للعلوم في الولايات المتحدة الأمريكية . 89 (18): 8794–7. Bibcode :1992PNAS...89.8794S. doi : 10.1073/pnas.89.18.8794 . PMC 50007. PMID  1528894. 
  11. ^ Pingoud A, Jeltsch A (سبتمبر 2001). "بنية ووظيفة نوكليازات القيد من النوع الثاني". Nucleic Acids Research . 29 (18): 3705–3727. doi :10.1093/nar/29.18.3705. PMC 55916. PMID  11557805 . 
  12. ^ abcdef Russell DW, Sambrook J (2001). الاستنساخ الجزيئي: دليل مختبري . كولد سبرينج هاربور، نيويورك: مختبر كولد سبرينج هاربور. ISBN 978-0-87969-576-7.
  13. ^ Higuchi R، Bowman B، Freiberger M، Ryder OA، Wilson AC (1984). "تسلسلات الحمض النووي من الكواجا، عضو منقرض من عائلة الخيول". Nature . 312 (5991): 282–284. Bibcode :1984Natur.312..282H. doi :10.1038/312282a0. PMID  6504142. S2CID  4313241.
  14. ^ Boominathan A, Vanhoozer S, Basisty N, Powers K, Crampton AL, Wang X, et al. (نوفمبر 2016). "التعبير النووي المستقر عن جينات ATP8 وATP6 ينقذ طفرة خالية من مركب mtDNA V". Nucleic Acids Research . 44 (19): 9342–9357. doi :10.1093/nar/gkw756. PMC 5100594. PMID  27596602 . 
  15. ^ بلوتكين جيه بي، كودلا جي (يناير 2011). "مرادفان ولكن ليسا نفس الشيء: أسباب وعواقب تحيز الكودون". مراجعات الطبيعة. علم الوراثة . 12 (1): 32-42. doi :10.1038/nrg2899. PMC 3074964. PMID  21102527 . 
  16. ^ ليدربيرج ج (فبراير 1994). "تحويل علم الوراثة عن طريق الحمض النووي: احتفال بذكرى أفيري وماكليود وماكارتي (1944)". علم الوراثة . 136 (2): 423-6. doi :10.1093/genetics/136.2.423. PMC 1205797. PMID  8150273 . 
  17. ^ Wirth R, Friesenegger A, Fiedler S (مارس 1989). "تحويل أنواع مختلفة من البكتيريا سلبية الجرام التي تنتمي إلى 11 جنسًا مختلفًا عن طريق الكهرومسام". علم الوراثة الجزيئي والعام . 216 (1): 175-7. doi :10.1007/BF00332248. PMID  2659971. S2CID  25214157.
  18. ^ Oldenburg J, Dolan G, Lemm G (Jan 2009). "رعاية مرضى الهيموفيليا آنذاك والآن وفي المستقبل". Haemophilia . 15 (Suppl 1): 2–7. doi : 10.1111/j.1365-2516.2008.01946.x ​​. PMID  19125934. S2CID  29118026.
  19. ^ The MJ (نوفمبر 1989). "الأنسولين البشري: أول عقار بتقنية الحمض النووي". المجلة الأمريكية لصيدلة المستشفيات . 46 (11 ملحق 2): ص 9-11. PMID  2690608.
  20. ^ Lewandowski C, Barsan W (فبراير 2001). "علاج السكتة الدماغية الإقفارية الحادة". Annals of Emergency Medicine . 37 (2): 202–16. doi :10.1067/mem.2001.111573. PMID  11174240.
  21. ^ Chang MH ، Chen CJ ، Lai MS، Hsu HM، Wu TC، Kong MS، Liang DC، Shau WY، Chen DS (يونيو 1997). "التطعيم الشامل ضد التهاب الكبد B في تايوان ومعدل الإصابة بسرطان الخلايا الكبدية لدى الأطفال. مجموعة دراسة أورام الكبد لدى الأطفال في تايوان". مجلة نيو إنجلاند الطبية . 336 (26): 1855-9. doi : 10.1056/NEJM199706263362602 . PMID  9197213.
  22. ^ August JT (1997). العلاج الجيني. المجلد 40. أكاديميك بريس. ص 508. ISBN 978-0-08-058132-3.
  23. ^ ab Pfeifer A, Verma IM (2001). "العلاج الجيني: الوعود والمشاكل". المراجعة السنوية لعلم الجينوم وعلم الوراثة البشرية . 2 : 177–211. doi :10.1146/annurev.genom.2.1.177. PMID  11701648.

قراءة إضافية

  • ماتسومورا الأول (سبتمبر 2015). "لماذا لا يستطيع جوني الاستنساخ: المزالق الشائعة والحلول غير الشائعة". التقنيات الحيوية . 59 (3): IV–XIII. doi : 10.2144/000114324 . PMID  26345511. مؤرشف من الأصل في 2015-09-16 . تم الاسترجاع في 2 فبراير 2016 .
مصادر المكتبة حول
الاستنساخ الجزيئي
  • الموارد الموجودة في مكتبتك
  • الموارد في المكتبات الأخرى
  • الوسائط المتعلقة بالاستنساخ الجزيئي في ويكيميديا ​​كومنز
Retrieved from "https://en.wikipedia.org/w/index.php?title=Molecular_cloning&oldid=1241351149"
Original text
Rate this translation
Your feedback will be used to help improve Google Translate