مفتاح ريبوسويتش

في علم الأحياء الجزيئي ، يُعدّ مفتاح الريبوزوم جزءًا تنظيميًا في جزيء الحمض النووي الريبوزي الرسول (mRNA) يرتبط بجزيء صغير، مما يؤدي إلى تغيير في إنتاج البروتينات المشفرة بواسطة mRNA . [ 1 ^{] [ 2 ] [ 3 ] [ 4 ] وبالتالي ،} فإن mRNA الذي يحتوي على مفتاح الريبوزوم يشارك بشكل مباشر في تنظيم نشاطه، استجابةً لتركيزات جزيء المؤثر . وقد وسّع اكتشاف أن الكائنات الحية الحديثة تستخدم الحمض النووي الريبوزي (RNA) للارتباط بجزيئات صغيرة، والتمييز بينها وبين نظائرها وثيقة الصلة، القدرات الطبيعية المعروفة للحمض النووي الريبوزي (RNA) لتتجاوز قدرته على ترميز البروتينات ، أو تحفيز التفاعلات ، أو الارتباط بجزيئات كبيرة أخرى من الحمض النووي الريبوزي (RNA) أو البروتينات .

كان التعريف الأصلي لمصطلح "الريبوسويتش" ينص على أنها تستشعر تركيزات جزيئات الأيض الصغيرة بشكل مباشر . ^{[ 5 ]} ورغم أن هذا التعريف لا يزال شائع الاستخدام، فقد استخدم بعض علماء الأحياء تعريفًا أوسع يشمل أنواعًا أخرى من الحمض النووي الريبوزي التنظيمي . مع ذلك، ستقتصر هذه المقالة على مناقشة الريبوسويتشات المرتبطة بالأيضات.

توجد معظم مفاتيح الريبوزوم المعروفة في البكتيريا ، ولكن تم اكتشاف مفاتيح ريبوزوم وظيفية من نوع واحد ( مفتاح الريبوزوم TPP ) في العتائق والنباتات وبعض الفطريات . كما تم التنبؤ بوجود مفاتيح ريبوزوم TPP في العتائق ، ^{[ 6 ]} ولكن لم يتم اختبارها تجريبياً.

قبل اكتشاف مفاتيح الريبوزوم، ظلّت آلية تنظيم بعض الجينات المشاركة في مسارات أيضية متعددة غامضة. أشارت أدلة متراكمة بشكل متزايد إلى فكرة غير مسبوقة آنذاك، وهي أن جزيئات mRNA المعنية قد ترتبط بالمستقلبات مباشرةً، لتؤثر على تنظيمها الذاتي. شملت هذه البيانات بنى ثانوية محفوظة للـ RNA، والتي غالبًا ما توجد في المناطق غير المترجمة ( UTRs ) للجينات ذات الصلة، ونجاح إجراءات إنشاء جزيئات RNA اصطناعية ترتبط بجزيئات صغيرة تُسمى الأبتاميرات . ^{[ 7 ] [ 8 ] [ 9 ] [ 10 ] [ 11 ]} في عام 2002، نُشرت أولى البراهين الشاملة على وجود فئات متعددة من مفاتيح الريبوزوم، بما في ذلك فحوصات الارتباط الخالية من البروتين، وتمّ إثبات أن مفاتيح الريبوزوم المرتبطة بالمستقلبات آلية جديدة لتنظيم الجينات. ^{[ 5 ] [ 12 ] [ 13 ] [ 14 ]}

تتوافق العديد من أوائل مفاتيح الريبوزوم المكتشفة مع "أنماط" تسلسلية محفوظة في مناطق 5' غير المترجمة ، والتي بدت وكأنها تُطابق جزيء RNA مُهيكل. على سبيل المثال، أدى التحليل المقارن للمناطق المجاورة لعدة جينات يُتوقع تنظيمها بشكل مشترك إلى وصف صندوق S ^{[ 15 ]} (الذي يُعرف الآن باسم مفتاح الريبوزوم SAM-I)، وصندوق THI ^{[ 9 ]} (منطقة داخل مفتاح الريبوزوم TPP)، وعنصر RFN ^{[ 8 ]} (الذي يُعرف الآن باسم مفتاح الريبوزوم FMN)، وصندوق B12 [ ₁₆ ^{] ( جزء} من مفتاح الريبوزوم الكوبالامين)، وفي بعض الحالات، إلى إثباتات تجريبية تُشير إلى تورطها في تنظيم الجينات عبر آلية غير معروفة. وقد لعبت المعلوماتية الحيوية دورًا في الاكتشافات الحديثة، مع تزايد أتمتة استراتيجية علم الجينوم المقارن الأساسية . (باريك وآخرون). استخدمت دراسة (2004) ^{[ 17 ]} برنامج BLAST للعثور على مناطق UTR المتماثلة مع جميع مناطق UTR في بكتيريا Bacillus subtilis . تم فحص بعض هذه المجموعات المتماثلة بحثًا عن بنية محفوظة، مما أسفر عن تحديد 10 أنماط شبيهة بالحمض النووي الريبي (RNA). تم لاحقًا تأكيد ثلاثة منها تجريبيًا على أنها مفاتيح ريبوزية glmS، وglycine، وPreQ1-I (انظر أدناه). وقد حددت جهود علم الجينوم المقارن اللاحقة، باستخدام تصنيفات إضافية من البكتيريا وخوارزميات حاسوبية محسّنة، المزيد من المفاتيح الريبوزية التي تم تأكيدها تجريبيًا، بالإضافة إلى هياكل RNA محفوظة يُفترض أنها تعمل كمفاتيح ريبوزية. ^{[ 18 ] [ 19 ] [ 20 ]}

غالبًا ما تُقسّم مفاتيح الريبوزومية من الناحية المفاهيمية إلى جزأين: الأبتامر ومنصة التعبير. يرتبط الأبتامر مباشرةً بالجزيء الصغير، وتخضع منصة التعبير لتغيرات هيكلية استجابةً للتغيرات التي تطرأ على الأبتامر. منصة التعبير هي التي تنظم التعبير الجيني.

عادةً ما تقوم منصات التعبير الجيني بإيقاف التعبير الجيني استجابةً للجزيء الصغير، ولكن بعضها يقوم بتشغيله. وقد تم إثبات آليات مفتاح الريبوزوم التالية تجريبياً.

• يؤدي تكوين حلقات إنهاء النسخ المستقلة عن عامل رو، والتي يتم التحكم فيها بواسطة مفتاح الريبو، إلى إنهاء النسخ قبل الأوان.
• يؤدي الطي بوساطة مفتاح الريبوسوم إلى عزل موقع ارتباط الريبوسوم ، وبالتالي تثبيط عملية الترجمة .
• إن الريبوسويتش هو ريبوزيم يقوم بفصل نفسه في وجود تركيزات كافية من مستقلبه.
• تؤثر البنى البديلة للريبوسويتش على عملية التضفير للرنا الرسول الأولي.
  • يتحكم مفتاح الريبوزوم TPP في Neurospora crassa (فطر) في عملية التضفير البديل لإنتاج إطار قراءة مفتوح في الاتجاه العلوي (uORF) بشكل مشروط، مما يؤثر على التعبير عن الجينات اللاحقة ^{[ 22 ] .}
  • يقوم مفتاح الريبوزوم TPP في النباتات بتعديل عملية الربط ومعالجة النهاية 3' البديلة ^{[ 23 ] [ 24 ]}
• يُنظّم مفتاح ريبوزي في بكتيريا كلوستريديوم أسيتوبوتيلكوم جينًا مجاورًا لا ينتمي إلى نفس نسخة mRNA. في هذا التنظيم، يتداخل المفتاح الريبوزي مع نسخ الجين. الآلية غير واضحة، ولكن يُحتمل أن تكون ناجمة عن تداخل بين وحدتي بوليميراز RNA أثناء نسخهما المتزامن لنفس الحمض النووي DNA. ^{[ 25 ]}
• يُنظّم مفتاح ريبوزي في بكتيريا الليستيريا المستوحدة التعبير عن جين يقع أسفله مباشرةً. مع ذلك، تُعدّل نسخ هذا المفتاح الريبوزي لاحقًا التعبير عن جين آخر يقع في مكان آخر من الجينوم. ^{[ 26 ]} يحدث هذا التنظيم العابر عبر اقتران القواعد مع الحمض النووي الريبوزي الرسول (mRNA) للجين البعيد. مع ارتفاع درجة حرارة البكتيريا، ينفصل المفتاح الريبوزي، مما يسمح بعملية النسخ. وقد ابتكر بحثٌ غير منشور لطلاب المرحلة الجامعية مفتاحًا ريبوزيًا مشابهًا أو "مستشعرًا حراريًا" عبر طفرات عشوائية في تسلسل الليستيريا المستوحدة. ^{[ 27 ]}

فيما يلي قائمة بمفاتيح الريبوسوم التي تم التحقق منها تجريبياً، مرتبة حسب الربيطة.

• مفتاح الريبوز كوبالامين (أيضًا عنصر B ₁₂ )، الذي يرتبط إما بالأدينوسيل كوبالامين (الشكل الإنزيمي المساعد لفيتامين B ₁₂ ) أو الأكواكوبالامين لتنظيم التخليق الحيوي للكوبالامين ونقل الكوبالامين والمستقلبات المماثلة، وجينات أخرى.
• ترتبط مفاتيح الريبوزوم الحلقية AMP-GMP بجزيء الإشارة الحلقي AMP-GMP . وترتبط هذه المفاتيح الريبوزومية بنيوياً بمفاتيح الريبوزوم الحلقية di-GMP-I (انظر أيضاً "الحلقي di-GMP" أدناه).
• ترتبط مفاتيح الريبوزوم الحلقية ثنائية AMP (وتسمى أيضًا ydaO/yuaA ) بجزيء الإشارة الحلقي ثنائي AMP .
• ترتبط مفاتيح الريبوزوم الحلقية ثنائية فوسفات الغوانوزين (c-di-GMP) بجزيء الإشارة c-di-GMP لتنظيم مجموعة متنوعة من الجينات التي يتحكم بها هذا الرسول الثانوي. يُعرف نوعان من مفاتيح الريبوزوم الحلقية ثنائية فوسفات الغوانوزين: مفاتيح الريبوزوم الحلقية ثنائية فوسفات الغوانوزين-1 (c-di-GMP-I) ومفاتيح الريبوزوم الحلقية ثنائية فوسفات الغوانوزين-2 (c-di-GMP-II) . ولا يبدو أن هذين النوعين مرتبطان بنيويًا.
• تستشعر مفاتيح الريبوزوم الفلورايد أيونات الفلورايد، وتعمل على البقاء على قيد الحياة في ظل مستويات عالية من الفلورايد .
• يرتبط مفتاح الريبوز FMN (المعروف أيضًا باسم عنصر RFN ) بالفلافين أحادي النوكليوتيد (FMN) لتنظيم التخليق الحيوي للريبوفلافين ونقله.
• مفتاح الريبو glmS ، وهو ريبوزيم يقوم بفصل نفسه عندما يكون هناك تركيز كافٍ من الجلوكوزامين-6-فوسفات .
• ترتبط مفاتيح الريبوزومية للجلوتامين بالجلوتامين لتنظيم الجينات المشاركة في استقلاب الجلوتامين والنيتروجين ، بالإضافة إلى ببتيدات قصيرة ذات وظائف غير معروفة. يُعرف نوعان من مفاتيح الريبوزومية للجلوتامين: نمط glnA RNA ونمط الببتيد المتصل . ويُعتقد أن هذين النوعين مرتبطان بنيويًا (انظر المناقشات في تلك المقالات).
• يرتبط مفتاح الريبوزوم الخاص بالجليسين بالجليسين لتنظيم جينات استقلاب الجليسين، بما في ذلك استخدامه كمصدر للطاقة. قبل عام 2012، كان يُعتقد أن هذا المفتاح هو الوحيد الذي يُظهر ارتباطًا تعاونيًا ، لاحتوائه على مُستقبلات ثنائية متجاورة. ورغم أنه لم يعد يُثبت أنه تعاوني، إلا أن سبب وجود هذه المستقبلات الثنائية لا يزال غامضًا. ^{[ 28 ]}
• يرتبط مفتاح الريبوزوم الليسين (المعروف أيضًا باسم L-box ) بالليسين لتنظيم التخليق الحيوي لليسين، والهدم ، والنقل.
• ترتبط مفاتيح الريبوزوم المنغنيز بأيونات المنغنيز .
• ترتبط مفاتيح الريبوزوم NiCo بأيونات المعادن النيكل والكوبالت.
• ترتبط مفاتيح الريبوزوم PreQ1 ببروتين ما قبل الكيوزين ₁ ، لتنظيم الجينات المشاركة في تخليق أو نقل هذا البروتين إلى الكيوزين . تُعرف ثلاثة أنواع متميزة تمامًا من مفاتيح الريبوزوم PreQ1: مفاتيح الريبوزوم PreQ1-I ، ومفاتيح الريبوزوم PreQ1-II ، ومفاتيح الريبوزوم PreQ1-III . يتميز نطاق الارتباط في مفاتيح الريبوزوم PreQ1-I بصغر حجمه بشكل غير معتاد مقارنةً بمفاتيح الريبوزوم الموجودة في الطبيعة. أما مفاتيح الريبوزوم PreQ1-II، الموجودة فقط في أنواع معينة من جنسي المكورات العقدية واللاكتوكوكوس ، فلها بنية مختلفة تمامًا، وهي أكبر حجمًا، وكذلك مفاتيح الريبوزوم PreQ1-III.
• ترتبط مفاتيح الريبوزومية البيورينية بالبيورينات لتنظيم استقلابها ونقلها. ترتبط أشكال مختلفة من هذه المفاتيح بالجوانين (شكل يُعرف سابقًا باسم صندوق G ) أو الأدينين . وتعتمد خصوصية الارتباط بالجوانين أو الأدينين كليًا على تفاعلات واتسون-كريك مع بيريميدين واحد في المفتاح عند الموضع Y74. في مفتاح الجوانين، يكون هذا الحمض الأميني دائمًا سيتوزين (أي C74)، بينما في مفتاح الأدينين يكون دائمًا يوراسيل (أي U74). ترتبط الأنواع المتماثلة من مفاتيح الريبوزومية البيورينية بالديوكسي جوانوزين ، ولكن الاختلافات بينها أكثر أهمية من مجرد طفرة نيوكليوتيدية واحدة.
• ترتبط مفاتيح الريبوزوم SAH بـ S-أدينوسيل هوموسيستين لتنظيم الجينات المشاركة في إعادة تدوير هذا المستقلب الذي يتم إنتاجه عنداستخدام S-أدينوسيل ميثيونين في تفاعلات المثيلة.
• ترتبط مفاتيح الريبوزوم SAM بـ S-أدينوزيل ميثيونين (SAM) لتنظيم تخليق ونقل الميثيونين وSAM. توجد ثلاثة أنواع متميزة من مفاتيح الريبوزوم SAM: SAM-I (المعروف سابقًا باسم S-box )، و SAM-II ، ومفتاح الريبوزوم S _MK box . ينتشر SAM-I على نطاق واسع في البكتيريا، بينما يوجد SAM-II فقط في بكتيريا ألفا وبيتا وعدد قليل من بكتيريا غاما بروتيو . يوجد مفتاح الريبوزوم S _MK box فقط في رتبة اللاكتوباسيلاليس . لا توجد أوجه تشابه واضحة بين هذه الأنواع الثلاثة من مفاتيح الريبوزوم من حيث التسلسل أو البنية. يبدو أن النوع الرابع، مفاتيح الريبوزوم SAM-IV ، يمتلك نواة ربط ليجاند مشابهة لتلك الموجودة في مفاتيح الريبوزوم SAM-I، ولكن ضمن هيكل مختلف.
• ترتبط مفاتيح الريبوزوم SAM-SAH بكل من SAM وSAH بتقارب مماثل. ونظرًا لوجودها دائمًا في موضع يسمح لها بتنظيم الجينات التي تشفر إنزيم ميثيونين أدينوسيل ترانسفيراز ، فقد اقتُرح أن ارتباطها بـ SAM فقط هو ذو أهمية فسيولوجية.
• ترتبط مفاتيح الريبوزوم رباعي هيدروفولات برباعي هيدروفولات لتنظيم جينات التخليق والنقل.
• ترتبط مفاتيح الريبوزوم TPP (المعروفة أيضًا باسم صندوق THI) بثنائي فوسفات الثيامين (TPP) لتنظيم التخليق الحيوي للثيامين ونقله، بالإضافة إلى نقل المستقلبات المماثلة. وهي مفتاح الريبوزوم الوحيد الذي تم اكتشافه حتى الآن في حقيقيات النوى. ^{[ 29 ]}
• تستشعر مفاتيح ZMP/ZTP الريبية ZMP و ZTP ، وهما نواتج ثانوية لعملية التمثيل الغذائي للبيورين من الصفر عندما تكون مستويات 10-فورميل تتراهيدروفولات منخفضة.

مفاتيح الريبوزوم المفترضة:

• يفترض أن Moco RNA motif يرتبط بعامل مساعد الموليبدينوم ، لتنظيم الجينات المشاركة في التخليق الحيوي ونقل هذا الإنزيم المساعد، بالإضافة إلى الإنزيمات التي تستخدمه أو مشتقاته كعامل مساعد.

تم تحديد مفاتيح ريبوزية مرشحة لربط المستقلبات باستخدام المعلوماتية الحيوية، وتتميز هذه المفاتيح ببنية ثانوية معقدة نوعًا ما ، بالإضافة إلى العديد من مواقع النيوكليوتيدات المحفوظة بدرجة عالية ، حيث تُعد هذه الخصائص نموذجية للمفاتيح الريبوزية التي يجب أن ترتبط بجزيء صغير على وجه التحديد. كما تتواجد هذه المفاتيح الريبوزية المرشحة باستمرار في المناطق غير المترجمة 5' للجينات المشفرة للبروتينات، وتوحي هذه الجينات بقدرتها على ربط المستقلبات، إذ تُعد هذه الخصائص أيضًا من سمات معظم المفاتيح الريبوزية المعروفة. وفيما يلي بعض المفاتيح الريبوزية المرشحة المفترضة والمتوافقة إلى حد كبير مع المعايير السابقة: وحدة crcB RNA ، ووحدة manA RNA ، ووحدة pfl RNA ، والتسلسل الرائد ydaO/yuaA ، والتسلسل الرائد yjdF RNA ، والتسلسل الرائد ykkC-yxkD (والتسلسل ykkC-III RNA ذي الصلة)، والتسلسل الرائد yybP-ykoY . ولا تزال وظائف هذه المفاتيح الريبوزية الافتراضية غير معروفة.

كما تم دراسة مفاتيح الريبوزوم باستخدام أساليب المحاكاة الحاسوبية. ^{[ 30 ] [ 31 ] [ 32 ]} وعلى وجه الخصوص، يمكن تقسيم حلول التنبؤ بمفاتيح الريبوزوم إلى فئتين رئيسيتين:

• أدوات البحث عن جينات الريبوسويتش ، أي الأنظمة التي تهدف إلى الكشف عن الريبوسويتشات من خلال عمليات الفحص الجينومي، والتي تعتمد في الغالب على آليات البحث عن الأنماط. تضم هذه المجموعة برنامج Infernal، وهو المكون الأساسي لقاعدة بيانات Rfam ، ^{[ 33 ]} وأدوات أكثر تخصصًا مثل RibEx ^{[ 34 ]} أو RiboSW. ^{[ 35 ]}
• تُعدّ مُتنبئات التبديل التوافقي ، أي الطرق القائمة على التصنيف البنيوي للهياكل البديلة، مثل paRNAs، ^{[ 36 ]} و RNAshapes ^{[ 37 ]} وRNAbor. ^{[ 38 ]} علاوة على ذلك، تم اقتراح مناهج خاصة بالعائلات للتنبؤ ببنية التشغيل/الإيقاف. ^{[ 39 ]}

أداة SwiSpot ^{[ 40 ]} تغطي كلا المجموعتين بطريقة ما، حيث تستخدم التنبؤات المطابقة لتقييم وجود مفاتيح الريبوزوم.

تتناول دراسات حسابية أخرى خصائص قابلية مواقع ارتباط الريبوسويتش للاستهداف الدوائي، وتقييم فعاليتها كأهداف دوائية جديدة محتملة. ^{[ 41 ] [ 42 ] [ 43 ]} بالإضافة إلى ذلك، تم تطبيق نماذج توليدية مثل آلات بولتزمان المقيدة لتعلم تبعيات التسلسل وتصميم ريبوسويتشات RNA وظيفية جديدة ^{[ 44 ]} .

تُظهر مفاتيح الريبوزوم أن الحمض النووي الريبوزي (RNA) الموجود طبيعيًا قادر على الارتباط بجزيئات صغيرة بشكلٍ انتقائي، وهي قدرة كان يُعتقد سابقًا أنها حكرٌ على البروتينات أو جزيئات الحمض النووي الريبوزي المصنّعة صناعيًا والتي تُسمى الأبتاميرات . وبالتالي، فإن وجود مفاتيح الريبوزوم في جميع مجالات الحياة يُعزز فرضية عالم الحمض النووي الريبوزي ، التي تفترض أن الحياة وُجدت في الأصل باستخدام الحمض النووي الريبوزي فقط، وأن البروتينات ظهرت لاحقًا؛ وتتطلب هذه الفرضية أن جميع الوظائف الحيوية التي تؤديها البروتينات (بما في ذلك الارتباط بالجزيئات الصغيرة) يُمكن أن يؤديها الحمض النووي الريبوزي. وقد اقتُرح أن بعض مفاتيح الريبوزوم قد تُمثل أنظمة تنظيمية قديمة، أو حتى بقايا من ريبوزيمات عالم الحمض النووي الريبوزي التي حُفظت نطاقات ارتباطها. ^{[ 13 ] [ 18 ] [ 45 ]}

يُعد الحمض النووي الريبوزي (RNA) هدفًا دوائيًا ناشئًا بالفعل . ^{[ 46 ]} تساهم عوامل متعددة في جعل مفاتيح الريبوزوم أهدافًا للمضادات الحيوية الجديدة : ^{[ 47 ] [ 48 ] [ 41 ]}

• إن قدرتها على الارتباط بالجزيئات الصغيرة بتقارب عالٍ تجعلها مناسبة لاستهداف الأدوية
• تحتوي بعض مفاتيح الريبوزوم على مواقع ربط تُظهر خصائص واعدة فيما يتعلق بإمكانية استهدافها بالأدوية . ^{[ 49 ]}
• إن غياب مفاتيح الريبوزوم في الخلايا حقيقية النواة يجعلها أهدافًا شديدة التخصص للمضادات الحيوية الجديدة
• لقد ثبت أن تثبيط بعض مفاتيح الريبوزوم فعال في التسبب في موت الخلايا البكتيرية.

في الواقع، تبين أن بعض المضادات الحيوية التي ظلت آلية عملها مجهولة لعقود، تعمل عن طريق استهداف مفاتيح الريبوزوم. ^{[ 50 ]} على سبيل المثال، عندما يدخل المضاد الحيوي بيريثيامين إلى الخلية، يتم استقلابه إلى بيريثيامين بيروفوسفات. وقد ثبت أن بيريثيامين بيروفوسفات يرتبط بمفتاح الريبوزوم TPP وينشطه، مما يؤدي إلى توقف الخلية عن تصنيع واستيراد TPP. ولأن بيريثيامين بيروفوسفات لا يحل محل TPP كإنزيم مساعد، تموت الخلية.

نظراً لأن مفاتيح الريبوزومية تُعد طريقة فعالة للتحكم في التعبير الجيني في الكائنات الحية الطبيعية، فقد كان هناك اهتمام بهندسة مفاتيح الريبوزومية الاصطناعية ^{[ 51 ] [ 52 ] [ 53 ] [ 54 ]} للتطبيقات الصناعية والطبية مثل العلاج الجيني . ^{[ 55 ] [ 56 ]}

• مقياس حرارة الحمض النووي الريبي - فئة أخرى من أجزاء تنظيم الحمض النووي الريبي الرسول التي تغير شكلها استجابة لتقلبات درجة الحرارة، وبالتالي تكشف أو تحجب موقع ارتباط الريبوسوم.

• فيري-داماري، أدريان ر.؛ وينكلر، ويد س. (2011). "الفصل 5. أدوار أيونات المعادن في التنظيم بواسطة مفاتيح الريبوزوم". في: أستريد سيجل، وهيلموت سيجل، ورولاند ك. أو. سيجل (محررون). الأدوار البنيوية والحفزية لأيونات المعادن في الحمض النووي الريبوزي . أيونات المعادن في علوم الحياة. المجلد  9. كامبريدج، المملكة المتحدة: دار نشر الجمعية الملكية للكيمياء. الصفحات 141-173 . doi : 10.1039/9781849732512-00141 . ISBN  978-1-84973-094-5. PMC 3454353 . PMID 22010271 .