الحمض النووي الجنيني الخالي من الخلايا

يُفصل بلازما الدم عن عينة دم الأم باستخدام جهاز طرد مركزي مخبري . ثم يُعزل الحمض النووي الجنيني الحر (cffDNA) ويُنقى. ^{[ 22 ]} وُضع بروتوكول موحد لهذه العملية بناءً على مراجعة الأدبيات العلمية . وقد حُصل على أعلى إنتاجية في استخلاص الحمض النووي الجنيني الحر باستخدام "مجموعة QIAamp DSP Virus Kit". ^{[ 23 ]}

تؤدي إضافة الفورمالديهايد إلى عينات دم الأم إلى زيادة كمية الحمض النووي الجنيني الحر (cffDNA). يعمل الفورمالديهايد على تثبيت الخلايا السليمة، وبالتالي يمنع إطلاق المزيد من الحمض النووي للأم. مع إضافة الفورمالديهايد، تتراوح نسبة الحمض النووي الجنيني الحر المستخلص من عينة دم الأم بين 0.32% و40%، بمتوسط ​​7.7%. ^{[ 24 ]} وبدون إضافة الفورمالديهايد، تم قياس متوسط ​​نسبة الحمض النووي الجنيني الحر المستخلص عند 20.2%. ومع ذلك، تتراوح نسب أخرى بين 5% و96%. ^{[ 25 ] [ 26 ]}

قد يرتبط استخلاص الحمض النووي الجنيني الحر بطول شظايا الحمض النووي. وهناك طريقة أخرى لزيادة كمية الحمض النووي الجنيني تعتمد على الطول الفيزيائي لشظايا الحمض النووي. إذ يمكن أن تمثل الشظايا الأصغر حجماً ما يصل إلى 70% من إجمالي الحمض النووي الحر في عينة دم الأم.

في تفاعل البوليميراز المتسلسل الكمي (PCR) في الوقت الحقيقي، تُستخدم مجسات فلورية لمراقبة تراكم نواتج التضخيم . تتناسب إشارة الفلورة المُبلغة طرديًا مع عدد نواتج التضخيم المُتولدة. يُصمم بروتوكول تفاعل البوليميراز المتسلسل الكمي الأنسب وفقًا للطفرة أو النمط الجيني المراد الكشف عنه. تُحلل الطفرات النقطية باستخدام تفاعل البوليميراز المتسلسل الكمي النوعي في الوقت الحقيقي باستخدام مجسات خاصة بالأليلات . أما عمليات الإدخال والحذف ، فتُحلل بقياس الجرعة باستخدام تفاعل البوليميراز المتسلسل الكمي في الوقت الحقيقي.

يمكن الكشف عن الحمض النووي الجنيني الحر (cffDNA) من خلال البحث عن تسلسلات الحمض النووي الموروثة من الأب باستخدام تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR). ^{[ 27 ] [ 28 ]}

يُتيح تحليل الحمض النووي الجنيني الحر (cffDNA) من عينة بلازما الأم تحديد جنس الجنين قبل الولادة . وتشمل تطبيقات تحديد جنس الجنين قبل الولادة ما يلي:

• فحص الأمراض : يسمح تحديد جنس الجنين (ذكر أم أنثى) بتحديد خطر الإصابة باضطراب وراثي متنحي مرتبط بالكروموسوم X في حمل معين، خاصة إذا كانت الأم حاملة للمرض. ^{[ 41 ]}
• الاستعداد لأي جوانب متعلقة بالجنس في الأبوة والأمومة.
• اختيار الجنس ، والذي يمكن إجراؤه بعد التشخيص الجيني قبل الزرع عن طريق اختيار الأجنة من الجنس المفضل فقط، أو بعد طرق ما بعد الزرع عن طريق إجراء الإجهاض الانتقائي للجنس اعتمادًا على نتيجة الاختبار والتفضيل الشخصي.

بالمقارنة مع التصوير بالموجات فوق الصوتية في طب التوليد، الذي لا يُعتمد عليه في تحديد جنس الجنين في الثلث الأول من الحمل، وبزل السائل الأمنيوسي الذي ينطوي على خطر ضئيل للإجهاض ، فإن أخذ عينة من بلازما الأم لتحليل الحمض النووي الجنيني الحر (cffDNA) لا ينطوي على أي خطر. ^{[ 42 ]} الهدفان الرئيسيان في تحليل الحمض النووي الجنيني الحر هما الجين المسؤول عن بروتين منطقة تحديد الجنس على الكروموسوم Y (SRY) وتسلسل DYS14. ^{[ 43 ] [ 44 ]}

في حالة تضخم الغدة الكظرية الخلقي ، تفتقر قشرة الغدة الكظرية إلى التخليق الكافي للكورتيكوستيرويدات ، مما يؤدي إلى زيادة إفراز الأندروجينات الكظرية ويؤثر على الأجنة الإناث. ^{[ 45 ]} يُلاحظ تذكير خارجي للأعضاء التناسلية لدى الأجنة الإناث. ^{[ 46 ]} تُعطى أمهات الأجنة المعرضة للخطر ديكساميثازون في الأسبوع السادس من الحمل لكبح إفراز الغدة النخامية للأندروجينات . ^{[ 47 ]}

إذا لم يُظهر تحليل الحمض النووي الجنيني الحر (cffDNA) المُستخلص من عينة بلازما الأم وجود علامات وراثية موجودة فقط على الكروموسوم Y، فهذا يُشير إلى جنين أنثى. مع ذلك، قد يُشير ذلك أيضًا إلى فشل التحليل نفسه (نتيجة سلبية خاطئة). يُمكن استخدام التعددات الشكلية الجينية الأبوية والعلامات غير المرتبطة بالجنس للكشف عن الحمض النووي الجنيني الحر. ويتطلب هذا التطبيق وجود درجة عالية من التغاير الزيجوتي لهذه العلامات. ^{[ 48 ]}

تتوفر فحوصات الحمض النووي لتحديد الأبوة قبل الولادة تجارياً. ويمكن إجراء الفحص في الأسبوع التاسع من الحمل.

تشمل الاضطرابات الوراثية المتنحية والواسعة النطاق، التي تُشخَّص قبل الولادة بتحليل الحمض النووي الموروث من الأب ، التليف الكيسي ، والثلاسيميا بيتا ، وفقر الدم المنجلي ، وضمور العضلات الشوكي ، وضمور العضلات التوتري . ^{[ 27 ] [ 43 ]} أما التشخيص قبل الولادة للاضطرابات الوراثية المتنحية الناتجة عن طفرة وراثية متنحية، أو طفرة وراثية سائدة موروثة من الأم، أو طفرات تسلسلية كبيرة تشمل تكرار أو تمدد أو إدخال تسلسلات الحمض النووي، فهو أكثر صعوبة. ^{[ 49 ]}

في الحمض النووي الجنيني الحر، يصعب اكتشاف أجزاء بطول 200-300 زوج قاعدي متورطة في اضطرابات الجينات المفردة.

على سبيل المثال، تُسبب طفرة نقطية في جين FGFR3 حالة وراثية سائدة متنحية. [ ^{50 ] في} حالتي حمل بجنين مصاب بالوهن الغضروفي، وُجدت طفرة G1138A موروثة من الأب في الحمض النووي الجنيني الحر (cffDNA) من عينة بلازما الأم في إحدى الحالتين، وطفرة G1138A جديدة في الحالة الأخرى. ^{[ 50 ]}

في دراسات علم الوراثة لمرض هنتنغتون باستخدام تقنية qRT-PCR للحمض النووي الجنيني الحر من عينات بلازما الأمهات، تم الكشف عن تكرارات CAG بمستويات طبيعية (17 و20 و24). ^{[ 51 ]}

يمكن أيضًا استخدام الحمض النووي الجنيني الحر (cffDNA) لتشخيص اضطرابات الجينات المفردة . ^{[ 15 ]} قد تسمح التطورات في العمليات المختبرية باستخدام الحمض النووي الجنيني الحر (cffDNA) بالتشخيص قبل الولادة لاختلالات الصيغة الصبغية مثل التثلث الصبغي 21 (متلازمة داون) لدى الجنين. ^{[ 52 ] [ 32 ]}

يُعد عدم توافق مستضدات RhD بين الجنين والأم السبب الرئيسي لمرض انحلال الدم لدى حديثي الولادة . ^{[ 53 ]} حوالي 15% من النساء القوقازيات ، و3 إلى 5% من النساء الأفريقيات السود ، وأقل من 3% من النساء الآسيويات لديهن مستضد RhD سالب. ^{[ 54 ]}

يُعد التشخيص الدقيق قبل الولادة أمراً بالغ الأهمية لأن المرض قد يكون مميتاً للمولود الجديد، ولأن العلاج الذي يشمل الغلوبولين المناعي العضلي (مضاد-د) أو الغلوبولين المناعي الوريدي يمكن إعطاؤه للأمهات المعرضات للخطر. ^{[ 55 ]}

يُظهر تفاعل البوليميراز المتسلسل ( PCR) للكشف عن الإكسونات 5 و7 من جين RHD في الحمض النووي الجنيني الحر ( cffDNA) المستخلص من بلازما الأم بين الأسبوعين 9 و13 من الحمل، درجة عالية من الخصوصية والحساسية والدقة التشخيصية (>90%) مقارنةً بتحديد RhD من مصل دم الحبل السري للمولود الجديد. ^{[ 53 ]} وقد تم الحصول على نتائج مماثلة عند استهداف الإكسونات 7 و10. ^{[ 56 ]} وكان تفاعل البوليميراز المتسلسل الرقمي القطري (droplet digital PCR) في تحديد RhD الجنيني مماثلاً لتقنية تفاعل البوليميراز المتسلسل الروتينية في الوقت الحقيقي. ^{[ 57 ]}

يُتيح التحديد الروتيني لحالة RhD للجنين من الحمض النووي الجنيني الحر في مصل الأم الإدارة المبكرة للحمل المعرض للخطر مع تقليل الاستخدام غير الضروري لمضاد D بأكثر من 25 بالمائة. ^{[ 58 ]}

الكروموسومات الجنسية

يمكن لتحليل الحمض النووي الجنيني الحر في مصل الأم باستخدام تقنية التسلسل عالي الإنتاجية الكشف عن اختلالات الكروموسومات الجنسية الجنينية الشائعة مثل متلازمة تيرنر ومتلازمة كلاينفلتر ومتلازمة تريبل إكس، ولكن القيمة التنبؤية الإيجابية لهذا الإجراء منخفضة. ^{[ 59 ]}

التثلث الصبغي 21

يُعدّ التثلث الصبغي 21 في الجنين سببًا لمتلازمة داون. ويمكن الكشف عن هذا التثلث بتحليل الحمض النووي الجنيني الحر (cffDNA) من دم الأم باستخدام تقنية التسلسل المتوازي عالي الإنتاجية (MPSS). ^{[ 61 ]} وهناك تقنية أخرى هي التحليل الرقمي للمناطق المختارة (DANSR). ^{[ 61 ]} تُظهر هذه الاختبارات حساسيةً تبلغ حوالي 99% وخصوصيةً تزيد عن 99.9%. لذا، لا يُمكن اعتبارها إجراءات تشخيصية، ولكن يُمكن استخدامها لتأكيد نتيجة إيجابية لاختبار فحص الأم، مثل فحص الثلث الأول من الحمل أو مؤشرات الموجات فوق الصوتية للحالة. ^{[ 61 ] [ 62 ]}

التثلث الصبغي 13 و 18

من الممكن تحليل الحمض النووي الجنيني الحر من بلازما الأم باستخدام MPSS للبحث عن التثلث الصبغي 13 أو 18 ^{[ 63 ].}

تشمل العوامل التي تحد من الحساسية والنوعية مستويات الحمض النووي الجنيني الحر في بلازما الأم؛ وقد تحتوي كروموسومات الأم على فسيفساء . ^{[ 64 ]}

يمكن الكشف عن عدد من جزيئات الحمض النووي الجنيني المشتقة من الكروموسومات المختلة الصبغيات، بما في ذلك mRNA الخاص بـ SERPINEB2، وclad B، وSERPINB5 ناقص الميثيل من الكروموسوم 18 ، وPLAC4 الخاص بالمشيمة، وHLCS مفرط الميثيل، وmRNA الخاص بـ c21orf105 من الكروموسوم 12. [ ^{65 ] في} حالة التثلث الصبغي الكامل، لا تكون نسبة أليلات mRNA في بلازما الأم طبيعية (1:1)، بل هي في الواقع 2:1. كما يمكن استخدام نسب الأليلات المحددة بواسطة المؤشرات فوق الجينية للكشف عن التثلث الصبغي الكامل. ويمكن استخدام تقنيات التسلسل المتوازي واسع النطاق وPCR الرقمي للكشف عن اختلال الصيغة الصبغية الجنينية دون اقتصارها على جزيئات الحمض النووي الخاصة بالجنين. يُقدّر أن حساسية اختبار (MPSS) تتراوح بين 96 و100%، ونوعيته بين 94 و100% في الكشف عن متلازمة داون. ويمكن إجراؤه في الأسبوع العاشر من الحمل . ^{[ 66 ]} وقدّرت دراسة أُجريت في الولايات المتحدة معدل النتائج الإيجابية الكاذبة بنسبة 0.3% والقيمة التنبؤية الإيجابية بنسبة 80% عند استخدام الحمض النووي الجنيني الحر (cffDNA) للكشف عن متلازمة داون. ^{[ 67 ]}

تسمم الحمل حالة معقدة تصيب الحوامل، وتتضمن ارتفاع ضغط الدم وبروتينية البول، وتظهر عادةً بعد الأسبوع العشرين من الحمل. ^{[ 68 ]} ويرتبط هذا التسمم بضعف غزو الخلايا الأرومية المغذية لعضلة الرحم . ويُعتبر ظهور هذه الحالة بين الأسبوعين العشرين والرابع والثلاثين من الحمل "مبكرًا". ^{[ 69 ]} وتُظهر عينات بلازما الأمهات في حالات الحمل المصحوبة بتسمم الحمل مستويات أعلى بكثير من الحمض النووي الجنيني الحر (cffDNA) مقارنةً بمستوياته في حالات الحمل الطبيعية. ^{[ 70 ] [ 71 ] [ 72 ]} وينطبق هذا أيضًا على حالات تسمم الحمل المبكر. ^{[ 69 ]}