الفيزيولوجيا الكهربائية

ابتكر العلماء والمهندسون تقنيات الفيزيولوجيا الكهربائية البصرية للتغلب على أحد أبرز عيوب التقنيات التقليدية. تسمح هذه التقنيات بمراقبة النشاط الكهربائي عند نقطة واحدة تقريبًا داخل حجم النسيج، ما يجعلها تُفرد ظاهرة موزعة. وقد حفّز الاهتمام بالتوزيع المكاني للنشاط الكهروكيميائي الحيوي تطوير جزيئات قادرة على إصدار الضوء استجابةً لبيئتها الكهربائية أو الكيميائية، مثل الأصباغ الحساسة للجهد والبروتينات المتألقة. بعد إدخال مركب واحد أو أكثر من هذه المركبات إلى النسيج عبر التروية أو الحقن أو التعبير الجيني، يمكن رصد وتسجيل التوزيع أحادي أو ثنائي الأبعاد للنشاط الكهربائي.

تتيح تقنية تثبيت الجهد للمُجرِّب تثبيت جهد الخلية عند قيمة مُحدَّدة. وهذا يُتيح قياس كمية التيار الأيوني الذي يعبر غشاء الخلية عند أي جهد مُعيَّن. وهذا أمرٌ بالغ الأهمية لأن العديد من قنوات الأيونات في غشاء العصبون هي قنوات أيونية مُعتمدة على الجهد ، والتي لا تُفتح إلا عندما يكون جهد الغشاء ضمن نطاق مُعيَّن. وتُصبح قياسات التيار بتقنية تثبيت الجهد ممكنةً من خلال الطرح الرقمي شبه المتزامن للتيارات السعوية العابرة التي تمر أثناء شحن قطب التسجيل وغشاء الخلية لتغيير جهد الخلية.

تُسجّل تقنية تثبيت التيار جهد غشاء الخلية عن طريق حقن تيار كهربائي فيها عبر قطب التسجيل. على عكس تقنية تثبيت الجهد، حيث يُثبّت جهد الغشاء عند مستوى يحدده الباحث، فإن جهد الغشاء في تقنية تثبيت التيار حرٌّ في التغير، ويسجّل المُضخّم أي جهد تولّده الخلية تلقائيًا أو نتيجةً للتحفيز. تُستخدم هذه التقنية لدراسة كيفية استجابة الخلية عند دخول تيار كهربائي إليها؛ وهذا مهم، على سبيل المثال، لفهم كيفية استجابة الخلايا العصبية للناقلات العصبية التي تعمل عن طريق فتح قنوات أيونية في الغشاء .

معظم مضخمات تثبيت التيار لا تُضخّم تغيرات الجهد المسجلة من الخلية إلا قليلاً أو لا تُضخّمها على الإطلاق. في الواقع، المضخم عبارة عن مقياس كهربائي ، يُشار إليه أحيانًا باسم "مضخم كسب الوحدة". يتمثل غرضه الرئيسي في تقليل الحمل الكهربائي على الإشارات الصغيرة (في نطاق الميلي فولت) التي تُنتجها الخلايا، بحيث يمكن تسجيلها بدقة بواسطة إلكترونيات ذات مقاومة منخفضة . يزيد المضخم من شدة التيار المصاحب للإشارة مع تقليل المقاومة التي يمر عبرها هذا التيار. لنأخذ هذا المثال المستند إلى قانون أوم: يتم توليد جهد مقداره 10 ميلي فولت بتمرير تيار مقداره 10 نانو أمبير عبر مقاومة مقدارها 1 ميجا أوم . يُحوّل المقياس الكهربائي هذه "الإشارة ذات المقاومة العالية" إلى "إشارة ذات مقاومة منخفضة" باستخدام دائرة مُتابع الجهد . يقرأ مُتابع الجهد الجهد على المدخل (الناتج عن تيار صغير يمر عبر مقاومة كبيرة ). ثم يقوم بتوجيه دائرة متوازية تحتوي على مصدر تيار كبير خلفها (شبكة الكهرباء الرئيسية) ويضبط مقاومة تلك الدائرة المتوازية لإعطاء نفس جهد الخرج، ولكن عبر مقاومة أقل.

طُوِّرت هذه التقنية على يد إروين نيهر وبيرت ساكمان، الحائزين على جائزة نوبل عام ١٩٩١. ^{[ ٧ ]} يتضمن التسجيل الخلوي التقليدي غرز قطب كهربائي دقيق في الخلية، بينما يعتمد تسجيل التثبيت الموضعي على نهج مختلف. يتكون قطب التثبيت الموضعي الدقيق من ماصة دقيقة ذات قطر طرف كبير نسبيًا. يُوضع القطب بجوار الخلية، ويُطبَّق شفط لطيف من خلاله لسحب جزء من غشاء الخلية (الرقعة) إلى طرف القطب؛ حيث يُشكِّل الطرف الزجاجي "ختمًا" عالي المقاومة مع غشاء الخلية. يُعرف هذا التكوين بنمط "الخلية الملتصقة"، ويمكن استخدامه لدراسة نشاط قنوات الأيونات الموجودة في رقعة الغشاء. عند زيادة الشفط، يمكن إزاحة رقعة الغشاء الصغيرة في طرف القطب، مما يجعل القطب محكم الإغلاق مع بقية الخلية. يتيح نمط "الخلية الكاملة" هذا تسجيلًا خلويًا مستقرًا للغاية. من عيوب هذه التقنية (مقارنةً بالتسجيل الخلوي التقليدي باستخدام أقطاب حادة) اختلاط السائل الخلوي بالمحلول الموجود داخل قطب التسجيل، مما قد يؤدي إلى تخفيف بعض المكونات المهمة للسائل الخلوي. وتسعى تقنية "الرقعة المثقبة"، وهي أحد أشكال هذه التقنية، إلى تقليل هذه المشاكل. فبدلاً من استخدام الشفط لإزاحة رقعة الغشاء من طرف القطب، يُمكن إحداث ثقوب صغيرة في الرقعة باستخدام عوامل مُكوِّنة للمسام، مما يسمح للجزيئات الكبيرة، كالبروتينات، بالبقاء داخل الخلية، بينما تمر الأيونات عبر هذه الثقوب بحرية. كما يُمكن سحب رقعة الغشاء بعيدًا عن باقي الخلية. يُمكّن هذا النهج من تحليل خصائص غشاء الرقعة دوائيًا. ويمكن أيضًا دمج تقنية تثبيت الرقعة مع تسلسل الحمض النووي الريبوزي (RNA) في تقنية تُعرف باسم patch-seq، وذلك باستخلاص محتويات الخلية بعد التسجيل لتحديد خصائصها الفيزيولوجية الكهربائية وعلاقتها بالتعبير الجيني ونوع الخلية.

في الحالات التي يُراد فيها تسجيل الجهد الكهربائي داخل غشاء الخلية مع الحد الأدنى من التأثير على التركيب الأيوني للسائل داخل الخلوي، يُمكن استخدام قطب كهربائي دقيق. تُشبه هذه الماصات الدقيقة (الأقطاب الكهربائية) تلك المستخدمة في تقنية التثبيت الموضعي، وهي مصنوعة من أنابيب شعرية زجاجية، إلا أن مسامها أصغر بكثير، مما يقلل من تبادل الأيونات بين السائل داخل الخلوي والإلكتروليت في الماصة. يتم تقليل المقاومة الكهربائية لقطب الماصة الدقيقة عن طريق ملئها بمحلول كلوريد البوتاسيوم بتركيز 2-4 مولار، بدلاً من استخدام تركيز ملحي يُحاكي التركيزات الأيونية داخل الخلوية كما هو الحال في تقنية التثبيت الموضعي. ^{[ 8 ]} غالبًا ما تُملأ طرف القطب الكهربائي بأنواع مختلفة من الأصباغ، مثل صبغة لوسيفير الصفراء، لملء الخلايا التي يتم التسجيل منها، وذلك لتأكيد شكلها لاحقًا تحت المجهر. يتم حقن الأصباغ بتطبيق جهد موجب أو سالب، مستمر أو نبضي، على الأقطاب الكهربائية، وذلك حسب قطبية الصبغة.

في حين أن مصفوفات الأقطاب الكهربائية الدقيقة على رقائق إلكترونية شبه موصلة، والتي تحتوي على آلاف إلى مئات الآلاف من الأقطاب الكهربائية لكل مصفوفة، كانت بمثابة منصة للتسجيل خارج الخلوي طويل الأمد لمزارع الخلايا العصبية في المختبر، ^{[ 9 ] [ 10 ]} فإن قدرتها يمكن أن تنطبق أيضًا على التسجيل داخل الخلوي لآلاف الخلايا العصبية في المزرعة . ^{[ 11 ]}

عند إدخال قطب كهربائي في دماغ حيوان حي، يتم رصد النشاط الكهربائي الناتج عن الخلايا العصبية المجاورة لطرف القطب. إذا كان القطب دقيقًا، بقطر طرف يبلغ حوالي ميكرومتر واحد، فإنه عادةً ما يرصد نشاط خلية عصبية واحدة على الأكثر. يُطلق على التسجيل بهذه الطريقة عمومًا اسم "تسجيل الوحدة المفردة". تشبه جهود الفعل المسجلة إلى حد كبير جهود الفعل المسجلة داخل الخلايا، ولكن الإشارات تكون أضعف بكثير (عادةً حوالي 1 ملي فولت). تُجرى معظم تسجيلات نشاط الخلايا العصبية المفردة في الحيوانات المخدرة والواعية بهذه الطريقة. وقد قدمت تسجيلات الخلايا العصبية المفردة في الحيوانات الحية رؤى مهمة حول كيفية معالجة الدماغ للمعلومات. على سبيل المثال، سجل ديفيد هوبل وتورستن ويزل نشاط الخلايا العصبية المفردة في القشرة البصرية الأولية لقطة مخدرة، وأظهرا كيف تستجيب الخلايا العصبية المفردة في هذه المنطقة لخصائص محددة للغاية للمحفز البصري. ^{[ 12 ]} حصل هوبل وويزل على جائزة نوبل في علم وظائف الأعضاء أو الطب في عام 1981. ^{[ 13 ]}

لتحضير الدماغ لإدخال الأقطاب الكهربائية، تُستخدم عادةً أجهزة تقطيع دقيقة مثل جهاز التقطيع الاهتزازي المضغوط، وجهاز التقطيع الاهتزازي من لايكا، وجهاز التقطيع الدقيق. تساعد هذه الأجهزة في الحصول على شرائح دماغية دقيقة ورقيقة ضرورية لوضع الأقطاب الكهربائية، مما يمكّن علماء الأعصاب من استهداف مناطق دماغية محددة للتسجيل. ^{[ 14 ]}

إذا كان طرف القطب الكهربائي أكبر قليلاً، فقد يسجل نشاط عدة خلايا عصبية. يُطلق على هذا النوع من التسجيل اسم "التسجيل متعدد الوحدات"، ويُستخدم غالبًا في الحيوانات الواعية لتسجيل التغيرات في نشاط منطقة دماغية محددة أثناء النشاط الطبيعي. يمكن استخدام التسجيلات من قطب كهربائي واحد أو أكثر متقاربة لتحديد عدد الخلايا المحيطة به، بالإضافة إلى تحديد مصدر كل نبضة. تُسمى هذه العملية فرز النبضات ، وهي مناسبة للمناطق التي توجد بها أنواع محددة من الخلايا ذات خصائص نبضات واضحة. أما إذا كان طرف القطب الكهربائي أكبر، فلا يمكن عمومًا تمييز نشاط الخلايا العصبية الفردية، لكن سيظل القطب قادرًا على تسجيل جهد المجال الناتج عن نشاط العديد من الخلايا.

تُعدّ كمونات المجال خارج الخلوي مصادر أو مصارف تيارات محلية تتولد عن النشاط الجماعي للعديد من الخلايا. عادةً، يتولد كمون المجال نتيجة التنشيط المتزامن للعديد من الخلايا العصبية عبر النقل المشبكي . يوضح الرسم البياني على اليمين كمونات المجال المشبكي في الحصين. يُظهر الخط السفلي على اليمين موجة سالبة تُقابل مصرف تيار ناتج عن دخول الشحنات الموجبة إلى الخلايا عبر مستقبلات الغلوتامات بعد المشبكية ، بينما يُظهر الخط العلوي موجة موجبة تتولد عن التيار الخارج من الخلية (عند جسم الخلية) لإكمال الدائرة الكهربائية. لمزيد من المعلومات، انظر كمون المجال المحلي .

تستخدم تقنية قياس التيار الكهربائي قطبًا كربونيًا لتسجيل التغيرات في التركيب الكيميائي للمكونات المؤكسدة في المحلول البيولوجي. وتتم الأكسدة والاختزال بتغيير الجهد الكهربائي على السطح النشط لقطب التسجيل في عملية تُعرف باسم "المسح". ولأن بعض المواد الكيميائية في الدماغ تفقد أو تكتسب إلكترونات عند جهود كهربائية مميزة، يُمكن تحديد الأنواع الفردية. وقد استُخدمت تقنية قياس التيار الكهربائي لدراسة الإخراج الخلوي في الجهازين العصبي والغدي. العديد من النواقل العصبية أحادية الأمين ، مثل النورأدرينالين والدوبامين والسيروتونين ، قابلة للأكسدة. كما يُمكن استخدام هذه الطريقة مع الخلايا التي لا تُفرز نواقل عصبية قابلة للأكسدة عن طريق "تحميلها" بالسيروتونين أو الدوبامين .

باستخدام هذا النهج الفيزيولوجي الكهربائي، تُمتصّ الليبوسومات البروتينية ، أو الحويصلات الغشائية، أو أجزاء الغشاء التي تحتوي على القناة أو الناقل المطلوب، على طبقة أحادية من الدهون مطلية فوق قطب كهربائي مُعدّل وظيفيًا. يتكون هذا القطب من دعامة زجاجية، وطبقة من الكروم ، وطبقة من الذهب ، وطبقة أحادية من أوكتاديسيل مركابتان . ولأن الغشاء المطلي مدعوم بالقطب الكهربائي، يُطلق عليه اسم الغشاء المدعوم صلبًا. لا تؤثر الاضطرابات الميكانيكية، التي عادةً ما تُتلف الغشاء الدهني البيولوجي، على عمر هذا الغشاء. يتميز القطب السعوي (المكون من الغشاء المدعوم صلبًا والحويصلات الممتصة) بثبات ميكانيكي عالٍ يسمح بتبادل المحاليل بسرعة على سطحه. تُمكّن هذه الخاصية من تطبيق قفزات سريعة في تركيز الركيزة/الرابط لدراسة النشاط الكهروكيميائي للبروتين المطلوب، والذي يُقاس عبر الاقتران السعوي بين الحويصلات والقطب الكهربائي. ^{[ 16 ]}

يُعدّ اختبار التعرّف الكهروحيوي (BERA) طريقةً مبتكرةً لتحديد جزيئات كيميائية وبيولوجية متنوعة، وذلك بقياس التغيرات في جهد غشاء الخلايا المُثبّتة في مصفوفة هلامية. فإلى جانب زيادة استقرار سطح التلامس بين القطب والخلية، يحافظ التثبيت على حيوية الخلايا ووظائفها الفيزيولوجية. يُستخدم اختبار BERA بشكل أساسي في تطبيقات أجهزة الاستشعار الحيوية لتحليل المواد التي تتفاعل مع الخلايا المُثبّتة عن طريق تغيير جهد غشاء الخلية. وبهذه الطريقة، عند إضافة عينة موجبة إلى جهاز الاستشعار، يحدث تغيير مميز في الجهد الكهربائي، يُشبه البصمة. ويُمثّل اختبار BERA التقنية الأساسية وراء مشروع FOODSCAN الأوروبي الشامل الذي أُطلق مؤخرًا، والذي يُعنى بتقييم مخاطر المبيدات الحشرية والغذاء في أوروبا. ^{[ 17 ]} استُخدمت تقنية BERA للكشف عن الفيروسات البشرية ( فيروسات التهاب الكبد B و C وفيروسات الهربس )، ^{[ 18 ]} ومسببات الأمراض البيطرية ( فيروس الحمى القلاعية ، والبريونات ، وفيروس اللسان الأزرق )، والفيروسات النباتية (فيروسات التبغ والخيار) ^{[ 19 ]} بطريقة نوعية وسريعة (1-2 دقيقة) وقابلة للتكرار وفعالة من حيث التكلفة. كما استُخدمت هذه الطريقة للكشف عن السموم البيئية، مثل المبيدات الحشرية ^{[ 20 ] [ 21 ] [ 22 ]} والسموم الفطرية ^{[ 23 ]} في الغذاء، ومركب 2،4،6-ثلاثي كلورو أنيسول في الفلين والنبيذ، ^{[ 24 ] [ 25 ]} بالإضافة إلى تحديد تركيزات منخفضة جدًا من أنيون فوق الأكسيد في العينات السريرية. ^{[ 26 ] [ 27 ]}

يتكون مستشعر BERA من جزأين:

• عناصر التعرف البيولوجي القابلة للاستهلاك
• جهاز القراءة الإلكتروني المزود بذكاء اصطناعي مدمج . ^{[ 28 ]}

ومن التطورات الحديثة تطوير تقنية تُسمى تحديد الجزيئات من خلال هندسة الأغشية (MIME). تسمح هذه التقنية ببناء خلايا ذات خصوصية محددة لأي جزيء تقريبًا، وذلك عن طريق دمج آلاف المستقبلات الاصطناعية في غشاء الخلية. ^{[ 29 ]}

على الرغم من أنها لا تُعدّ قياسًا تجريبيًا بالمعنى الدقيق، فقد طُوّرت طرقٌ لدراسة الخصائص الموصلة للبروتينات والأغشية الحيوية باستخدام المحاكاة الحاسوبية . وتعتمد هذه الطرق بشكل أساسي على محاكاة الديناميكا الجزيئية ، حيث يُعرَّض نظام نموذجي، مثل طبقة ثنائية من الدهون، لجهد كهربائي خارجي. وقد مكّنت الدراسات التي استخدمت هذه الإعدادات من دراسة ظواهر ديناميكية مثل التثقيب الكهربائي للأغشية ^{[ 30 ]} وانتقال الأيونات عبر القنوات ^{[ 31 ] .}

تكمن فائدة هذه الأساليب في مستوى التفصيل العالي لآلية التوصيل النشط، والذي توفره الدقة العالية وكثافة البيانات التي تتيحها المحاكاة الذرية. مع ذلك، توجد عيوب جوهرية، تتمثل في عدم اليقين بشأن صحة النموذج والتكلفة الحسابية لنمذجة الأنظمة الكبيرة بما يكفي وعلى مدى فترات زمنية كافية لاعتبارها قادرة على محاكاة الخصائص الكلية للأنظمة نفسها. ورغم أن المحاكاة الذرية قد تصل إلى فترات زمنية قريبة من الميكروثانية أو حتى ضمنها، إلا أن هذا لا يزال أقل بكثير من دقة الأساليب التجريبية، مثل تقنية تثبيت الرقعة.

تحدد معايير الحد الأدنى من المعلومات (MI) أو إرشادات إعداد التقارير الحد الأدنى من البيانات الوصفية (المعلومات) والبيانات المطلوبة لتحقيق هدف أو أهداف محددة في دراسة سريرية. وتهدف مجموعة إرشادات إعداد التقارير "الحد الأدنى من المعلومات حول بحث في علم الأعصاب" (MINI) إلى توفير مجموعة متسقة من الإرشادات لإعداد تقرير عن تجربة فيزيولوجية كهربائية. عمليًا، تتضمن وحدة MINI قائمة مرجعية بالمعلومات التي ينبغي تقديمها (على سبيل المثال، حول البروتوكولات المستخدمة) عند وصف مجموعة بيانات للنشر. ^{[ 32 ]}