تفاعل البوليميراز المتسلسل

📅 آخر تحديث: ٣١ يوليو ٢٠٢٦
✍️ نُشر في: ٣١ يوليو ٢٠٢٦
📷 يحتوي على 11 صور
الموسوعة الحرة

شريط من ثمانية أنابيب تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR)، يحتوي كل منها على 100  ميكرولتر من خليط التفاعل
وضع شريط من ثمانية أنابيب تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR) في جهاز التدوير الحراري

يُعد تفاعل البوليميراز المتسلسل ( PCR ) طريقةً مخبريةً شائعة الاستخدام لتضخيم نسخ من تسلسلات الحمض النووي (DNA) المحددة بسرعة، مما يُتيح إجراء دراسات تفصيلية. وقد اخترع هذه التقنية عالم الكيمياء الحيوية الأمريكي كاري موليس في شركة سيتوس عام 1983. وحصل موليس وعالم الكيمياء الحيوية مايكل سميث ، اللذان طورا طرقًا أساسية أخرى لمعالجة الحمض النووي، على جائزة نوبل في الكيمياء عام 1993. [ 1 ]

يُعد تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR) أساسيًا للعديد من الإجراءات المستخدمة في الاختبارات الجينية والأبحاث، بما في ذلك تحليل عينات الحمض النووي القديمة وتحديد العوامل المعدية. باستخدام PCR، يتم تضخيم نسخ من كميات ضئيلة جدًا من تسلسلات الحمض النووي بشكل أُسّي في سلسلة من دورات تغيرات درجة الحرارة. أصبح PCR الآن تقنية شائعة، وغالبًا ما لا غنى عنها، تُستخدم في أبحاث المختبرات الطبية لمجموعة واسعة من التطبيقات، بما في ذلك البحوث الطبية الحيوية وعلم الأدلة الجنائية . [ 2 ] [ 3 ]

تعتمد معظم طرق تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR) على التدوير الحراري . يُعرّض التدوير الحراري الكواشف لدورات متكررة من التسخين والتبريد للسماح بتفاعلات مختلفة تعتمد على درجة الحرارة، وتحديدًا، ذوبان الحمض النووي وتضاعف الحمض النووي بواسطة الإنزيم . يستخدم تفاعل البوليميراز المتسلسل كاشفين رئيسيين: البادئات (وهي أجزاء قصيرة من الحمض النووي أحادي السلسلة تُعرف باسم قليل النوكليوتيدات، وهي تسلسل مكمل لمنطقة الحمض النووي المستهدفة) وبوليميراز الحمض النووي المقاوم للحرارة . في الخطوة الأولى من تفاعل البوليميراز المتسلسل، يتم فصل سلسلتي الحمض النووي المزدوج فيزيائيًا عند درجة حرارة عالية في عملية تُسمى تمسخ الحمض النووي . في الخطوة الثانية، تُخفض درجة الحرارة وترتبط البادئات بالتسلسلات المكملة للحمض النووي. تصبح سلسلتا الحمض النووي بعد ذلك قوالب لبوليميراز الحمض النووي لتجميع سلسلة حمض نووي جديدة إنزيميًا من النوكليوتيدات الحرة ، وهي الوحدات البنائية للحمض النووي. مع تقدم تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR)، يُستخدم الحمض النووي الناتج نفسه كقالب للتضاعف، مما يؤدي إلى بدء تفاعل متسلسل يتم فيه تضخيم قالب الحمض النووي الأصلي بشكل أُسّي . [ 4 ]

تستخدم جميع تطبيقات تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR) تقريبًا بوليميراز الحمض النووي المقاوم للحرارة ، مثل بوليميراز Taq ، وهو إنزيم معزول في الأصل من بكتيريا Thermus aquaticus المحبة للحرارة . إذا كان البوليميراز المستخدم حساسًا للحرارة، فإنه سيتعرض للتفكك عند درجات الحرارة العالية في خطوة التفكك . قبل استخدام بوليميراز Taq ، كان لا بد من إضافة بوليميراز الحمض النووي يدويًا في كل دورة، وهي عملية شاقة ومكلفة. [ 5 ]

تشمل تطبيقات هذه التقنية استنساخ الحمض النووي للتسلسل ، واستنساخ الجينات ومعالجتها، والطفرات الجينية؛ وبناء السلالات القائمة على الحمض النووي ، أو التحليل الوظيفي للجينات ؛ وتشخيص ومراقبة الاضطرابات الوراثية ؛ وتضخيم الحمض النووي القديم؛ [ 6 ] تحليل البصمات الوراثية لتحديد خصائص الحمض النووي (على سبيل المثال، في علم الطب الشرعي واختبارات النسب )؛ والكشف عن مسببات الأمراض في اختبارات الأحماض النووية لتشخيص الأمراض المعدية .

مبادئ

جهاز تدوير حراري قديم بثلاث درجات حرارة لتفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR).

يُضخّم تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR) منطقةً محددةً من شريط الحمض النووي (الهدف). تُضخّم معظم طرق PCR أجزاءً من الحمض النووي يتراوح طولها بين 0.1 و10 كيلو قاعدة (kbp)، مع أن بعض التقنيات تسمح بتضخيم أجزاء يصل طولها إلى 40 كيلو قاعدة. [ 7 ] تتحدد كمية الناتج المُضخّم بكمية المواد المتفاعلة المتاحة في التفاعل، والتي تصبح عاملاً مُحدداً مع تقدم التفاعل. [ 8 ]

يتطلب إعداد تفاعل البوليميراز المتسلسل الأساسي عدة مكونات وكواشف، [ 9 ] بما في ذلك:

  • قالب الحمض النووي الذي يحتوي على منطقة الحمض النووي المستهدفة للتضخيم
  • إنزيم بوليميراز الحمض النووي ( DNA polymerase )؛ وهو إنزيم يُبلمر سلاسل الحمض النووي الجديدة؛ ويُعد بوليميراز Taq المقاوم للحرارة شائعًا بشكل خاص، [ 10 ] نظرًا لاحتمالية بقائه سليمًا أثناء عملية تمسخ الحمض النووي عند درجات الحرارة العالية. أما بوليميراز Pfu فهو بوليميراز مقاوم للحرارة يتميز بدقة أعلى مقارنةً بـ Taq لقدرته على التدقيق اللغوي، ولكنه يعمل ببطء. وتؤدي إضافة كمية صغيرة من Pfu إلى Taq إلى الجمع بين مزايا كليهما. [ 11 ]
  • يُستخدم نوعان من بادئات الحمض النووي (DNA ) المُكملة للنهاية 3' (ثلاثية البادئة) لكل من سلسلتي الحمض النووي (DNA) المُستهدفة (لا يستطيع إنزيم بوليميراز الحمض النووي الارتباط بمنطقة الحمض النووي المزدوجة وإطالتها إلا منها؛ فبدون البادئات، لا يوجد موقع بدء مزدوج السلسلة يمكن للبوليميراز الارتباط به)؛ [ 12 ] يتم اختيار البادئات المُخصصة المُكملة لمنطقة الحمض النووي المُستهدفة مُسبقًا، وغالبًا ما تُصنع خصيصًا في المختبر أو تُشترى من مُوردي المواد الكيميائية الحيوية التجاريين.
  • ثلاثي فوسفات ديوكسي نيوكليوسيد ، أو dNTPs، هي الوحدات البنائية التي يقوم بوليميراز الحمض النووي بتخليق سلسلة جديدة من الحمض النووي منها
  • محلول منظم يوفر بيئة كيميائية مناسبة لتحقيق النشاط الأمثل والاستقرار لإنزيم بوليميراز الحمض النووي
  • الأيونات ثنائية التكافؤ ، وعادة ما تكون أيونات المغنيسيوم (Mg) أو المنغنيز (Mn)؛ Mg 2+ هو الأكثر شيوعًا، ولكنيمكن استخدام Mn 2+ في الطفرات الموجهة بواسطة تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR) ، حيث أن زيادة تركيز Mn 2+ يزيد من معدل الخطأ أثناء تخليق الحمض النووي؛ [ 13 ] والأيونات أحادية التكافؤ ، وعادة ما تكونأيونات البوتاسيوم (K) [ 14 ]

يُجرى التفاعل عادةً في حجم يتراوح بين 10 و200 ميكرولتر في أنابيب تفاعل صغيرة ( بحجم 0.2 إلى 0.5 مل) باستخدام جهاز التدوير الحراري . يقوم هذا الجهاز بتسخين وتبريد أنابيب التفاعل للوصول إلى درجات الحرارة المطلوبة في كل خطوة من خطوات التفاعل (انظر أدناه). تستخدم العديد من أجهزة التدوير الحراري الحديثة جهاز بلتييه ، الذي يسمح بتسخين وتبريد الكتلة الحاملة لأنابيب تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR) ببساطة عن طريق عكس التيار الكهربائي للجهاز. تسمح أنابيب التفاعل ذات الجدران الرقيقة بتوصيل حراري جيد لتحقيق توازن حراري سريع. تحتوي معظم أجهزة التدوير الحراري على أغطية مُسخّنة لمنع تكثف البخار في أعلى أنبوب التفاعل. أما أجهزة التدوير الحراري القديمة التي لا تحتوي على غطاء مُسخّن، فتتطلب وضع طبقة من الزيت فوق خليط التفاعل أو كرة من الشمع داخل الأنبوب. [ 15 ]  

إجراء

يتكون تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR) عادةً من سلسلة من 20 إلى 40 دورة حرارية، تتألف كل دورة منها عادةً من خطوتين أو ثلاث خطوات حرارية منفصلة (انظر الشكل أدناه). يسبق هذه الدورات عادةً خطوة حرارية واحدة عند درجة حرارة عالية جدًا (> 90 درجة مئوية (194 درجة فهرنهايت) )، وتليها فترة توقف في النهاية لإطالة المنتج النهائي أو تخزينه لفترة وجيزة. تعتمد درجات الحرارة المستخدمة ومدة تطبيقها في كل دورة على مجموعة متنوعة من العوامل، بما في ذلك الإنزيم المستخدم في تخليق الحمض النووي، وتركيز الأيونات ثنائية التكافؤ والنيوكليوتيدات ثلاثية الفوسفات (dNTPs) في التفاعل، ودرجة انصهار البادئات ( Tm ) . [ 16 ] الخطوات الفردية المشتركة في معظم طرق تفاعل البوليميراز المتسلسل هي : التهيئة، والتهجين، والإطالة.   

  • التهيئة : هذه الخطوة مطلوبة فقط لبوليميرازات الحمض النووي التي تتطلب تنشيطًا حراريًا بواسطة تفاعل البلمرة المتسلسل ذي البداية الساخنة . [ 17 ] تتضمن تسخين حجرة التفاعل إلى درجة حرارة 94-96 درجة مئوية (201-205 درجة فهرنهايت) ، أو 98 درجة مئوية (208 درجة فهرنهايت) في حال استخدام بوليميرازات شديدة الثبات الحراري، ثم تثبيت درجة الحرارة لمدة 1-10 دقائق. [ 4 ]    
  • التمسخ : هذه الخطوة هي أولى مراحل دورة التفاعل المنتظمة، وتتضمن تسخين حجرة التفاعل إلى 94-98 درجة مئوية (201-208 درجة فهرنهايت) لمدة 20-30 ثانية. يؤدي ذلك إلى انصهار الحمض النووي ، أو تمسخه، في قالب الحمض النووي المزدوج عن طريق كسر الروابط الهيدروجينية بين القواعد المتكاملة، مما ينتج عنه جزيئان من الحمض النووي أحادي السلسلة.  
  • التلدين : في الخطوة التالية، تُخفَّض درجة حرارة التفاعل إلى 50-65 درجة مئوية (122-149 درجة فهرنهايت) لمدة 20-40 ثانية، مما يسمح بتلدين البادئات مع كل قالب من قوالب الحمض النووي أحادي السلسلة. عادةً ما يُضاف نوعان مختلفان من البادئات إلى مزيج التفاعل: بادئة لكل من سلسلتي الحمض النووي أحاديتي السلسلة المكملتين اللتين تحتويان على المنطقة المستهدفة. البادئات نفسها عبارة عن تسلسلات أحادية السلسلة، لكنها أقصر بكثير من طول المنطقة المستهدفة، وتُكمِّل فقط التسلسلات القصيرة جدًا عند الطرف 3' لكل سلسلة. [ 18 ]  
من الأهمية بمكان تحديد درجة الحرارة المناسبة لخطوة التلدين، لأن كفاءة وخصوصية التفاعل تتأثران بشدة بدرجة حرارة التلدين. يجب أن تكون هذه الدرجة منخفضة بما يكفي للسماح بتهجين البادئ مع السلسلة، ولكن مرتفعة بما يكفي لضمان خصوصية التهجين، أي أن يرتبط البادئ فقط بجزء مكمل تمامًا من السلسلة، وليس في أي مكان آخر. إذا كانت درجة الحرارة منخفضة جدًا، فقد لا يرتبط البادئ بشكل كامل. أما إذا كانت مرتفعة جدًا، فقد لا يرتبط البادئ على الإطلاق. تتراوح درجة حرارة التلدين النموذجية بين 3 و5  درجات مئوية أقل من درجة انصهار البادئات المستخدمة. تتشكل روابط هيدروجينية مستقرة بين القواعد المكملة فقط عندما يتطابق تسلسل البادئ بشكل وثيق مع تسلسل القالب. خلال هذه الخطوة، يرتبط إنزيم البوليميراز بالهجين الناتج عن البادئ والقالب ويبدأ بتكوين الحمض النووي. [ 19 ]
  • التمديد/الاستطالة : تعتمد درجة الحرارة في هذه المرحلة على إنزيم بوليميراز الحمض النووي المستخدم؛ وتتراوح درجة الحرارة المثلى لنشاط إنزيم بوليميراز الحمض النووي المقاوم للحرارة، وهو إنزيم Taq بوليميراز ، بين 75 و80 درجة مئوية (167-176 درجة فهرنهايت) تقريبًا ، [ 20 ] [ 21 ] على الرغم من أن درجة حرارة 72 درجة مئوية (162 درجة فهرنهايت) تُستخدم عادةً مع هذا الإنزيم. في هذه المرحلة، يقوم إنزيم بوليميراز الحمض النووي بتخليق سلسلة حمض نووي جديدة مكملة لسلسلة الحمض النووي الأصلية عن طريق إضافة نيوكليوتيدات ثلاثية الفوسفات (dNTPs) حرة من خليط التفاعل، مكملة للسلسلة الأصلية في الاتجاه من 5' إلى 3' ، مما يؤدي إلى تكثيف مجموعة الفوسفات 5' للنيوكليوتيدات ثلاثية الفوسفات مع مجموعة الهيدروكسيل 3' في نهاية سلسلة الحمض النووي المتكونة (المستطيلة). يعتمد الوقت اللازم للاستطالة بدقة على كل من إنزيم بوليميراز الحمض النووي المستخدم وطول منطقة الحمض النووي المستهدفة المراد تضخيمها. كقاعدة عامة، عند درجة حرارتها المثلى، تقوم معظم بوليميرازات الحمض النووي ببلمرة ألف قاعدة في الدقيقة. في ظل الظروف المثلى (أي في حال عدم وجود قيود بسبب محدودية الركائز أو الكواشف)، يتضاعف عدد تسلسلات الحمض النووي المستهدفة في كل خطوة من خطوات التمديد. مع كل دورة متتالية، تصبح خيوط القالب الأصلية بالإضافة إلى جميع الخيوط المتولدة حديثًا خيوط قالب للجولة التالية من التمديد، مما يؤدي إلى تضخيم أُسّي (هندسي) لمنطقة الحمض النووي المستهدفة المحددة. [ 22 ]    
تُشكّل عمليات التمسخ والتهجين والاستطالة دورةً واحدة. ويتطلب تضخيم الحمض النووي المستهدف إلى ملايين النسخ دوراتٍ متعددة. الصيغة المستخدمة لحساب عدد نسخ الحمض النووي المتكونة بعد عددٍ مُحدد من الدورات هي 2^ n ، حيث n هو عدد الدورات. وبالتالي، ينتج عن تفاعلٍ مُعدّ لـ 30 دورة 2^ 30 ، أو 1,073,741,824 نسخة من منطقة الحمض النووي المستهدفة الأصلية ذات السلسلتين.
  • الاستطالة النهائية : هذه الخطوة الوحيدة اختيارية، ولكن يتم إجراؤها عند درجة حرارة 70-74 درجة مئوية (158-165 درجة فهرنهايت) (نطاق درجة الحرارة المطلوب للنشاط الأمثل لمعظم البوليميرازات المستخدمة في تفاعل البوليميراز المتسلسل) لمدة 5-15 دقيقة بعد دورة تفاعل البوليميراز المتسلسل الأخيرة لضمان استطالة أي حمض نووي أحادي السلسلة متبقٍ بشكل كامل.  
  • الحفظ النهائي : الخطوة الأخيرة هي تبريد حجرة التفاعل إلى 4-15 درجة مئوية (39-59 درجة فهرنهايت) لفترة غير محددة، ويمكن استخدامها للتخزين قصير المدى لمنتجات تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR).  
رسم تخطيطي لدورة تفاعل البوليميراز المتسلسل الكاملة
رسم تخطيطي لدورة تفاعل البوليميراز المتسلسل الكاملة
تم تلوين نواتج تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR) ببروميد الإيثيديوم بعد الفصل الكهربائي الهلامي . استُخدمت مجموعتان من البادئات لتضخيم تسلسل مستهدف من ثلاث عينات نسيجية مختلفة. لم يُلاحظ أي تضخيم في العينة رقم 1؛ بينما تشير حزم الحمض النووي في العينتين رقم 2 و3 إلى نجاح تضخيم التسلسل المستهدف. يُظهر الهلام أيضًا عينة تحكم موجبة، وسلّم الحمض النووي الذي يحتوي على شظايا من الحمض النووي ذات أطوال محددة لتحديد حجم الحزم في تفاعلات البوليميراز المتسلسل التجريبية.

للتأكد من نجاح تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR) في إنتاج منطقة الحمض النووي المستهدفة (والتي تُعرف أحيانًا باسم المُضخَّم أو المُنتَج المُضخَّم )، يُمكن استخدام الرحلان الكهربائي على هلام الأغاروز لفصل نواتج تفاعل البوليميراز المتسلسل حسب الحجم. يُحدَّد حجم نواتج تفاعل البوليميراز المتسلسل بمقارنتها بسلم الحمض النووي ، وهو علامة للوزن الجزيئي تحتوي على شظايا من الحمض النووي ذات أحجام معروفة، والتي تُفصل على الهلام بجانب نواتج تفاعل البوليميراز المتسلسل.

تفاعل البوليميراز المتسلسل تاكر
تفاعل البوليميراز المتسلسل تاكر

مراحل

التضخيم الأسي

كما هو الحال مع التفاعلات الكيميائية الأخرى، يتأثر معدل تفاعل البلمرة المتسلسل (PCR) وكفاءته بعوامل محددة. لذا، يمكن تقسيم عملية البلمرة المتسلسل بأكملها إلى ثلاث مراحل بناءً على تقدم التفاعل:

  • التضخيم الأسي : في كل دورة، تتضاعف كمية الناتج (بافتراض كفاءة تفاعل بنسبة 100%). بعد 30 دورة، يمكن زيادة نسخة واحدة من الحمض النووي إلى مليار نسخة. بمعنى آخر، تتم معالجة تضاعف شريط منفصل من الحمض النووي في أنبوب ضمن ظروف مضبوطة. [ 23 ] التفاعل شديد الحساسية: يكفي وجود كميات ضئيلة جدًا من الحمض النووي.
  • مرحلة الاستقرار : يتباطأ التفاعل مع فقدان بوليميراز الحمض النووي للنشاط ومع استهلاك الكواشف، مثل dNTPs والبادئات، مما يؤدي إلى محدوديتها.
  • مرحلة الثبات : لا يتراكم المزيد من المنتج بسبب استنفاد الكواشف والإنزيم.

تحسين

عمليًا، قد يفشل تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR) لأسباب مختلفة، مثل الحساسية أو التلوث. [ 24 ] [ 25 ] يمكن أن يؤدي التلوث بحمض نووي غريب إلى نتائج خاطئة، ويتم التعامل مع هذه المشكلة من خلال بروتوكولات وإجراءات مخبرية تفصل مخاليط ما قبل تفاعل PCR عن الملوثات المحتملة للحمض النووي. [ 9 ] على سبيل المثال، عند تحليل الحمض النووي من مسرح جريمة، قد يتم تضخيم جزيء حمض نووي واحد من أحد العاملين في المختبر، مما قد يضلل التحقيق. لذا، يجب فصل مناطق إعداد تفاعل PCR عن مناطق تحليل أو تنقية منتجات PCR الأخرى، واستخدام أدوات بلاستيكية للاستخدام لمرة واحدة، وتنظيف سطح العمل جيدًا بين كل عملية إعداد للتفاعل.

يمكن تعديل الخصوصية من خلال الظروف التجريبية لتجنب إنتاج نواتج غير مرغوب فيها. تُعد تقنيات تصميم البادئات مهمة لتحسين إنتاجية نواتج تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR) وتجنب تكوين نواتج غير محددة. يمكن أن يُسهم استخدام مكونات بديلة للمحلول المنظم (مثل ثنائي ميثيل سلفوكسيد للمساعدة في فصل سلسلتي الحمض النووي) أو إنزيمات البوليميراز في تضخيم المناطق الطويلة أو الصعبة من الحمض النووي. على سبيل المثال، يُقال إن بوليميراز Q5 أقل عرضة للخطأ بحوالي 280 مرة من بوليميراز Taq، وأكثر كفاءة. [ 26 ] [ 27 ] قد تُؤدي كل من معايير التشغيل (مثل درجة الحرارة ومدة الدورات)، أو إضافة الكواشف، مثل الفورماميد ، إلى زيادة خصوصية وإنتاجية تفاعل البوليميراز المتسلسل. [ 28 ] يمكن إجراء محاكاة حاسوبية لنتائج تفاعل البوليميراز المتسلسل النظرية ( تفاعل البوليميراز المتسلسل الإلكتروني ) للمساعدة في تصميم البادئات. [ 29 ]

التطبيقات

عزل الحمض النووي الانتقائي

تتيح تقنية تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR) عزل أجزاء من الحمض النووي من الحمض النووي الجينومي عن طريق التضخيم الانتقائي لمنطقة محددة من الحمض النووي. يُعزز استخدام هذه التقنية تطبيقاتٍ مثل توليد مجسات التهجين لتقنية التهجين الجنوبي أو الشمالي واستنساخ الحمض النووي ، والتي تتطلب كميات أكبر من الحمض النووي لتمثيل منطقة محددة منه. توفر تقنية PCR لهذه التقنيات كميات كبيرة من الحمض النووي النقي، مما يُمكّن من تحليل عينات الحمض النووي حتى من كميات ضئيلة جدًا من المادة الأولية. [ 30 ]

تشمل التطبيقات الأخرى لتقنية تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR) تسلسل الحمض النووي لتحديد التسلسلات غير المعروفة المُضخّمة بتقنية PCR، حيث يمكن استخدام أحد بادئات التضخيم في تسلسل سانجر ، وعزل تسلسل الحمض النووي لتسريع تقنيات الحمض النووي المُعاد تركيبه التي تتضمن إدخال تسلسل الحمض النووي في بلازميد أو عاثية أو كوزميد (بحسب الحجم) أو المادة الوراثية لكائن حي آخر. ويمكن فحص مستعمرات البكتيريا (مثل الإشريكية القولونية ) بسرعة باستخدام تقنية PCR للتأكد من صحة تركيبات ناقلات الحمض النووي . [ 31 ] كما يمكن استخدام تقنية PCR في البصمة الوراثية ؛ وهي تقنية جنائية تُستخدم لتحديد هوية شخص أو كائن حي من خلال مقارنة الحمض النووي التجريبي عبر طرق مختلفة تعتمد على تقنية PCR. [ 32 ]

الفصل الكهربائي لقطع الحمض النووي المضخمة بتقنية تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR):
  1. أب
  2. طفل
  3. الأم
لقد ورث الطفل بعض بصمات أصابع كل من والديه، ولكن ليس كلها، مما منحه بصمة إصبع جديدة وفريدة من نوعها.

تتمتع بعض طرق بصمة الحمض النووي بتقنية تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR) بقدرة تمييز عالية، ويمكن استخدامها لتحديد العلاقات الجينية بين الأفراد، مثل العلاقة بين الوالدين والأبناء أو بين الأشقاء، وتُستخدم في اختبارات إثبات النسب (الشكل 4). كما يمكن استخدام هذه التقنية لتحديد العلاقات التطورية بين الكائنات الحية عند استخدام ساعات جزيئية معينة (مثل جينات 16S rRNA و recA للكائنات الدقيقة). [ 33 ]

تضخيم وتحديد كمية الحمض النووي

نظرًا لأن تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR) يُضخّم مناطق الحمض النووي المستهدفة، يُمكن استخدامه لتحليل كميات ضئيلة للغاية من العينات. وهذا أمر بالغ الأهمية في التحليل الجنائي ، حيث لا تتوفر سوى كمية ضئيلة من الحمض النووي كدليل. كما يُمكن استخدام PCR في تحليل الحمض النووي القديم الذي يعود تاريخه إلى عشرات آلاف السنين. وقد استُخدمت هذه التقنيات القائمة على PCR بنجاح على الحيوانات، مثل الماموث الذي يبلغ عمره أربعين ألف عام ، وكذلك على الحمض النووي البشري، في تطبيقات تتراوح من تحليل المومياوات المصرية إلى تحديد هوية قيصر روسي وجثة الملك الإنجليزي ريتشارد الثالث . [ 34 ]

تتيح طرق تفاعل البوليميراز المتسلسل الكمي (qPCR) أو تفاعل البوليميراز المتسلسل في الوقت الحقيقي (يُرجى عدم الخلط بينه وبين تفاعل البوليميراز المتسلسل العكسي RT-PCR ) تقدير كمية تسلسل معين موجود في عينة، وهي تقنية تُستخدم غالبًا لتحديد مستويات التعبير الجيني كميًا . توضح إرشادات MIQE، التي وضعها الأساتذة ستيفن بوستين ومايكل بفافل وميكائيل كوبيستا وزملاؤهم، كيفية إجراء تجارب qPCR والإبلاغ عن النتائج. [ 35 ] يُعد تفاعل البوليميراز المتسلسل الكمي أداةً راسخةً لتحديد كمية الحمض النووي، حيث يقيس تراكم ناتج الحمض النووي بعد كل دورة من تضخيم تفاعل البوليميراز المتسلسل.

تتيح تقنية تفاعل البوليميراز المتسلسل الكمي (qPCR) تحديد كمية تسلسل الحمض النووي (DNA) والكشف عنه في الوقت الحقيقي، إذ تقيس تركيزه أثناء عملية التخليق. توجد طريقتان للكشف والقياس الكمي المتزامنين. تعتمد الطريقة الأولى على استخدام أصباغ فلورية تُحفظ بشكل غير انتقائي بين سلسلتي الحمض النووي المزدوجتين. أما الطريقة الثانية فتعتمد على مجسات تحمل رموزًا لتسلسلات محددة وموسومة بصبغات فلورية. لا يمكن الكشف عن الحمض النووي باستخدام هاتين الطريقتين إلا بعد تهجين المجسات مع الحمض النووي المكمل (cDNA). ومن التقنيات المثيرة للاهتمام دمج تفاعل البوليميراز المتسلسل الكمي مع النسخ العكسي. تتيح هذه التقنية المتطورة، المسماة RT-qPCR، تحديد كمية ضئيلة من الحمض النووي الريبوزي (RNA). من خلال هذه التقنية المدمجة، يُحوّل الحمض النووي الريبوزي الرسول (mRNA) إلى cDNA، والذي يُقاس كميًا باستخدام qPCR. تقلل هذه التقنية من احتمالية الخطأ في نهاية تفاعل البوليميراز المتسلسل، [ 36 ] مما يزيد من فرص الكشف عن الجينات المرتبطة بالأمراض الوراثية كالسرطان. [ 6 ] تستخدم المختبرات تقنية RT-qPCR لقياس تنظيم الجينات بدقة عالية. وتُسهّل الأسس الرياضية للقياس الكمي الموثوق لتقنية PCR [ 37 ] وتقنية RT-qPCR [ 38 ] تطبيق إجراءات مطابقة دقيقة للبيانات التجريبية في مجالات البحث، والطب، والتشخيص، والأمراض المعدية. [ 39 ] [ 40 ] [ 41 ] [ 42 ]

التطبيقات الطبية والتشخيصية

يمكن فحص الوالدين المحتملين للتأكد من كونهم حاملين للجينات المسببة للمرض، أو فحص أطفالهم للتأكد من إصابتهم به . [ 2 ] يمكن الحصول على عينات الحمض النووي للفحص قبل الولادة عن طريق بزل السائل الأمنيوسي ، أو أخذ عينات من الزغابات المشيمية ، أو حتى عن طريق تحليل خلايا جنينية نادرة في دم الأم. كما يُعد تحليل تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR) ضروريًا للتشخيص الجيني قبل الزرع ، حيث تُفحص خلايا الجنين النامي بحثًا عن الطفرات.

  • يمكن أيضًا استخدام تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR) كجزء من اختبار حساس لتحديد نوع الأنسجة ، وهو أمر بالغ الأهمية لزراعة الأعضاء . اعتبارًا من عام 2008،بل إن هناك اقتراحاً باستبدال الاختبارات التقليدية القائمة على الأجسام المضادة لتحديد فصيلة الدم باختبارات تعتمد على تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR). [ 43 ]
  • تتضمن العديد من أنواع السرطان تغيرات في الجينات الورمية . وباستخدام اختبارات تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR) لدراسة هذه الطفرات، يمكن في بعض الأحيان تخصيص بروتوكولات العلاج لكل مريض على حدة. يسمح تفاعل البوليميراز المتسلسل بالتشخيص المبكر للأمراض الخبيثة مثل سرطان الدم (اللوكيميا) والأورام اللمفاوية ، وهو حاليًا الأكثر تطورًا في أبحاث السرطان ويُستخدم بالفعل بشكل روتيني. يمكن إجراء فحوصات تفاعل البوليميراز المتسلسل مباشرةً على عينات الحمض النووي الجينومي للكشف عن الخلايا الخبيثة الناتجة عن عمليات الانتقال الكروموسومي بحساسية تفوق حساسية الطرق الأخرى بما لا يقل عن 10000 ضعف. [ 44 ] يُعد تفاعل البوليميراز المتسلسل مفيدًا جدًا في المجال الطبي لأنه يسمح بعزل وتضخيم الجينات الكابتة للأورام. على سبيل المثال، يمكن استخدام تفاعل البوليميراز المتسلسل الكمي لتحديد كمية الخلايا المفردة وتحليلها، بالإضافة إلى التعرف على تراكيب الحمض النووي (DNA) والحمض النووي الريبوزي الرسول (mRNA) والبروتينات . [ 36 ]

تطبيقات الأمراض المعدية

يُتيح تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR) تشخيصًا سريعًا ودقيقًا للغاية للأمراض المعدية، بما في ذلك تلك التي تُسببها البكتيريا أو الفيروسات. [ 45 ] كما يُتيح PCR تحديد الكائنات الدقيقة غير القابلة للزراعة أو بطيئة النمو، مثل المتفطرات والبكتيريا اللاهوائية والفيروسات ، من خلال فحوصات زراعة الأنسجة والنماذج الحيوانية . ويستند استخدام PCR في التشخيص الميكروبيولوجي إلى الكشف عن العوامل المعدية والتمييز بين السلالات غير الممرضة والممرضة بناءً على جينات محددة. [ 45 ] [ 46 ]

لقد أحدثت تقنية تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR) ثورة في توصيف وكشف الكائنات المسببة للأمراض المعدية بالطرق التالية:

  • يُعدّ فيروس نقص المناعة البشرية ( HIV ) هدفًا صعبًا للكشف عنه والقضاء عليه. اعتمدت الاختبارات الأولى للكشف عن العدوى على وجود أجسام مضادة للفيروس في مجرى الدم. إلا أن هذه الأجسام المضادة لا تظهر إلا بعد أسابيع عديدة من الإصابة، كما أن الأجسام المضادة لدى الأم تُخفي العدوى لدى المولود الجديد، ولا تؤثر العلاجات المستخدمة لمكافحة العدوى على الأجسام المضادة. وقد طُوّرت اختبارات تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR ) التي يمكنها الكشف عن جينوم فيروسي واحد فقط ضمن الحمض النووي لأكثر من 50,000 خلية مضيفة. [ 47 ] وبذلك، يُمكن الكشف عن العدوى في وقت مبكر، وفحص الدم المتبرع به مباشرةً للكشف عن الفيروس، وإجراء اختبارات فورية للمواليد الجدد للكشف عن العدوى، وقياس فعالية العلاجات المضادة للفيروسات .
  • يصعب أخذ عينات من بعض الكائنات المسببة للأمراض، مثل مسبب السل ، من المرضى، كما أن زراعتها في المختبر تستغرق وقتًا طويلاً. وقد أتاحت الاختبارات القائمة على تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR) الكشف عن أعداد قليلة من هذه الكائنات (سواء كانت حية أو ميتة) في عينات يسهل الحصول عليها . ويمكن أيضًا استخدام التحليل الجيني المفصل للكشف عن مقاومة المضادات الحيوية، مما يسمح ببدء العلاج فورًا وبفعالية. كما يمكن تقييم آثار العلاج على الفور.
  • يمكن رصد انتشار الكائنات المسببة للأمراض بين مجموعات الحيوانات الأليفة أو البرية باستخدام اختبار تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR). وفي كثير من الحالات، يمكن الكشف عن ظهور سلالات فرعية جديدة شديدة الضراوة ومراقبتها. كما يمكن تحديد السلالات الفرعية للكائن الحي التي كانت مسؤولة عن الأوبئة السابقة من خلال تحليل PCR.
  • يمكن الكشف عن الحمض النووي الفيروسي باستخدام تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR). يجب أن تكون البادئات المستخدمة نوعية للتسلسلات المستهدفة في الحمض النووي للفيروس، ويمكن استخدام تفاعل البوليميراز المتسلسل للتحليلات التشخيصية أو تسلسل الحمض النووي للجينوم الفيروسي. تسمح الحساسية العالية لتفاعل البوليميراز المتسلسل بالكشف عن الفيروس بعد الإصابة بفترة وجيزة، وحتى قبل ظهور أعراض المرض. [ 45 ] قد يمنح هذا الكشف المبكر الأطباء وقتًا كافيًا لبدء العلاج. كما يمكن تحديد كمية الفيروس (" الحمل الفيروسي ") لدى المريض باستخدام تقنيات تحديد كمية الحمض النووي القائمة على تفاعل البوليميراز المتسلسل (انظر أدناه). يُستخدم نوع من تفاعل البوليميراز المتسلسل ( RT-PCR ) للكشف عن الحمض النووي الريبي الفيروسي (RNA) بدلاً من الحمض النووي (DNA): في هذا الاختبار، يُستخدم إنزيم النسخ العكسي لتوليد تسلسل DNA مطابق للحمض النووي الريبي الفيروسي؛ ثم يتم تضخيم هذا الحمض النووي وفقًا لطريقة تفاعل البوليميراز المتسلسل المعتادة. يُستخدم تفاعل البوليميراز المتسلسل العكسي على نطاق واسع للكشف عن جينوم فيروس SARS-CoV-2. [ 48 ]
  • تُسبب بكتيريا البورديتيلا الشاهوقية أمراضًا مثل السعال الديكي . تُعرف هذه البكتيريا بإصابتها بعدوى تنفسية حادة وخطيرة تُصيب العديد من الحيوانات والبشر، وقد أدت إلى وفاة العديد من الأطفال الصغار. يُعد سم السعال الديكي بروتينًا خارجيًا يرتبط بمستقبلات الخلايا عبر وحدتين ثنائيتين ، ويتفاعل مع أنواع مختلفة من الخلايا، مثل الخلايا اللمفاوية التائية التي تلعب دورًا في المناعة الخلوية. [ 49 ] يُعد تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR) أداة تشخيصية مهمة للكشف عن التسلسلات الجينية لسم السعال الديكي. ونظرًا لحساسية PCR العالية للسم وسرعة نتائجه، فهو فعال للغاية في تشخيص السعال الديكي مقارنةً بالزراعة. [ 50 ]

التطبيقات الجنائية

شهد تطوير بروتوكولات البصمة الوراثية (أو بصمة الحمض النووي ) القائمة على تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR) تطبيقًا واسع النطاق في الطب الشرعي :

  • غالباً ما يتم أخذ عينات الحمض النووي في مسرح الجريمة وتحليلها بواسطة تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR).
    في أكثر صورها دقة، تُمكّن البصمة الوراثية من التمييز بدقة بين أي شخص وسكان العالم أجمع . إذ يُمكن عزل عينات دقيقة من الحمض النووي من مسرح الجريمة ، ومقارنتها بحمض نووي للمشتبه بهم، أو بقاعدة بيانات الحمض النووي لأدلة سابقة أو مدانين. وغالبًا ما تُستخدم نسخ أبسط من هذه الاختبارات لاستبعاد المشتبه بهم بسرعة أثناء التحقيقات الجنائية. كما يُمكن فحص أدلة من جرائم تعود لعقود مضت، لتأكيد أو تبرئة الأشخاص الذين أُدينوا في الأصل.
  • يُعدّ تحليل الحمض النووي الجنائي وسيلة فعّالة لتحديد هوية المشتبه بهم أو تبرئتهم، وذلك بفضل تحليل الأدلة المكتشفة في مسرح الجريمة. يحتوي الجينوم البشري على العديد من المناطق المتكررة التي يمكن العثور عليها ضمن تسلسلات الجينات أو في المناطق غير المشفرة من الجينوم. تحديدًا، تصل نسبة الحمض النووي البشري المتكرر إلى 40%. [ 6 ] توجد فئتان متميزتان لهذه المناطق المتكررة غير المشفرة في الجينوم. تُسمى الفئة الأولى التكرارات الترادفية ذات العدد المتغير (VNTR)، ويتراوح طولها بين 10 و100 زوج قاعدي، بينما تُسمى الفئة الثانية التكرارات الترادفية القصيرة (STR)، وتتكون من مقاطع متكررة يتراوح طولها بين 2 و10 أزواج قاعدية. يُستخدم تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR) لتضخيم العديد من التكرارات الترادفية ذات العدد المتغير (VNTR) والتكرارات الترادفية القصيرة (STR) المعروفة، وذلك باستخدام بادئات تُحيط بكل منطقة من المناطق المتكررة. تُشير أحجام القطع المُستخلصة من أي فرد لكل تكرار من التكرارات الترادفية القصيرة (STR) إلى الأليلات الموجودة. من خلال تحليل عدة مواقع تكرارية قصيرة (STRs) لفرد ما، يتم تحديد مجموعة من الأليلات لكل شخص، والتي يُرجح إحصائيًا أن تكون فريدة. [ 6 ] وقد حدد الباحثون التسلسل الكامل للجينوم البشري. يمكن الوصول إلى هذا التسلسل بسهولة عبر موقع المركز الوطني لمعلومات التقانة الحيوية (NCBI)، ويُستخدم في العديد من التطبيقات العملية. على سبيل المثال، جمع مكتب التحقيقات الفيدرالي (FBI) مجموعة من مواقع علامات الحمض النووي المستخدمة في تحديد الهوية، وتُعرف هذه المواقع باسم قاعدة بيانات نظام فهرسة الحمض النووي المُدمج (CODIS). [ 6 ] يُمكّن استخدام قاعدة البيانات هذه من إجراء تحليل إحصائي لتحديد احتمالية تطابق عينة الحمض النووي. يُعد تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR) أداة تحليلية قوية وهامة للغاية في تحديد النمط الجيني للحمض النووي في الطب الشرعي، لأن الباحثين لا يحتاجون إلا إلى كمية ضئيلة جدًا من الحمض النووي المستهدف للتحليل. على سبيل المثال، تحتوي شعرة بشرية واحدة مع بصيلة الشعر المتصلة بها على كمية كافية من الحمض النووي لإجراء التحليل. وبالمثل، يمكن لعدد قليل من الحيوانات المنوية، أو عينات الجلد من تحت الأظافر، أو كمية صغيرة من الدم أن توفر كمية كافية من الحمض النووي لإجراء تحليل قاطع. [ 6 ]
  • يمكن أن تساعد أشكال أقل دقة من بصمة الحمض النووي في اختبارات إثبات النسب ، حيث تتم مطابقة الفرد مع أقاربه المقربين. ويمكن فحص الحمض النووي من رفات بشرية مجهولة الهوية ومقارنته بالحمض النووي لوالدين أو أشقاء أو أبناء محتملين. ويمكن استخدام اختبارات مماثلة لتأكيد الوالدين البيولوجيين لطفل متبنى (أو مختطف). كما يمكن تأكيد هوية الأب البيولوجي الحقيقي للمولود الجديد (أو استبعادها) .
  • لقد أثبت تصميم تفاعل البوليميراز المتسلسل AMGX/AMGY فعاليته ليس فقط في تضخيم تسلسلات الحمض النووي من كمية ضئيلة جدًا من الجينوم، بل يمكن استخدامه أيضًا لتحديد الجنس في الوقت الفعلي من عينات العظام في الطب الشرعي. وهذا يوفر طريقة قوية وفعالة لتحديد الجنس في القضايا الجنائية والعينات القديمة. [ 51 ]

تطبيقات البحث

تم تطبيق تقنية تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR) في العديد من مجالات البحث في علم الوراثة الجزيئية :

  • تتيح تقنية تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR) إنتاج قطع قصيرة من الحمض النووي بسرعة، حتى عند معرفة تسلسل البادئين فقط. تُعزز هذه الميزة العديد من الطرق، مثل توليد مجسات التهجين لتقنيات التهجين الجنوبي والشمالي . توفر تقنية PCR لهذه التقنيات كميات كبيرة من الحمض النووي النقي، أحيانًا على شكل شريط مفرد، مما يُمكّن من التحليل حتى من كميات ضئيلة جدًا من المادة الأولية.
  • يمكن الاستعانة بتقنية تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR) في عملية تسلسل الحمض النووي . إذ يُمكن استخلاص أجزاء معروفة من الحمض النووي بسهولة من مريض مصاب بطفرة جينية . كما يُمكن تعديل تقنية التضخيم لاستخلاص أجزاء من جينوم غير معروف تمامًا، أو لتوليد شريط واحد فقط من منطقة محددة.
  • تُستخدم تقنية تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR) على نطاق واسع في عملية استنساخ الحمض النووي التقليدية . فهي تُمكّن من استخلاص أجزاء من جينوم أكبر، قد لا يتوفر بكميات كبيرة، لإدخالها في ناقل. وباستخدام مجموعة واحدة من "بادئات الناقل"، يُمكنها أيضًا تحليل أو استخلاص أجزاء سبق إدخالها في النواقل. وقد تُؤدي بعض التعديلات على بروتوكول تفاعل البوليميراز المتسلسل إلى حدوث طفرات (عامة أو موجهة) في الجزء المُدخل.
  • تُعدّ مواقع التسلسل الموسومة عمليةً يُستخدم فيها تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR) كمؤشر على وجود جزء معين من الجينوم في مستنسخ معين. وقد وجد مشروع الجينوم البشري أن هذا التطبيق بالغ الأهمية لرسم خرائط مستنسخات الكوزميد التي كانوا يقومون بتسلسلها، ولتنسيق النتائج من مختلف المختبرات.
  • من تطبيقات تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR) التحليل الجيني للحمض النووي المستخلص من مصادر قديمة ، مثل ذلك الموجود في عظام إنسان نياندرتال المستخرجة، أو من أنسجة الماموث المجمدة ، أو من دماغ المومياوات المصرية. [ 23 ] في بعض الحالات، قد يُعاد تجميع الحمض النووي المتدهور بشدة من هذه المصادر خلال المراحل المبكرة من التضخيم.
  • يُعدّ دراسة أنماط التعبير الجيني أحد التطبيقات الشائعة لتقنية تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR ). إذ يُمكن تحليل الأنسجة (أو حتى الخلايا الفردية) في مراحل مختلفة لمعرفة الجينات التي أصبحت نشطة، أو تلك التي توقفت عن العمل. كما يُمكن استخدام تقنية تفاعل البوليميراز المتسلسل الكمي (qPCR) في هذا التطبيق لتحديد مستويات التعبير الجيني الفعلية.
  • لقد حسّنت قدرة تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR) على تضخيم عدة مواقع جينية في وقت واحد من الحيوانات المنوية الفردية [ 52 ] بشكل كبير من مهمة رسم الخرائط الجينية التقليدية، وذلك من خلال دراسة عمليات العبور الكروموسومي بعد الانقسام الاختزالي . وقد تم رصد أحداث العبور النادرة بين مواقع جينية متقاربة جدًا بشكل مباشر من خلال تحليل آلاف الحيوانات المنوية الفردية. وبالمثل، يمكن تحليل عمليات الحذف والإدخال والانتقال والانقلاب غير المعتادة، كل ذلك دون الحاجة إلى انتظار (أو دفع تكاليف) العمليات الطويلة والشاقة للإخصاب وتكوين الجنين، وما إلى ذلك.
  • الطفرات الموجهة للموقع : يمكن استخدام تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR) لإنشاء جينات طافرة بطفرات يختارها العلماء حسب رغبتهم. يمكن اختيار هذه الطفرات لفهم كيفية قيام البروتينات بوظائفها، ولتغيير وظيفة البروتين أو تحسينها.

المزايا

يتميز تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR) بعدة مزايا، فهو سهل الفهم والاستخدام، ويُنتج نتائج سريعة. كما أنه شديد الحساسية، إذ يُمكنه إنتاج ملايين إلى مليارات النسخ من منتج محدد لأغراض التسلسل والاستنساخ والتحليل. ويشترك تفاعل البوليميراز المتسلسل الكمي في الوقت الحقيقي (qRT-PCR) مع تفاعل البوليميراز المتسلسل في المزايا نفسها، مع ميزة إضافية تتمثل في إمكانية قياس كمية المنتج المُصنّع. ولذلك، يُستخدم لتحليل تغيرات مستويات التعبير الجيني في الأورام والميكروبات وغيرها من الحالات المرضية. [ 36 ]

يُعد تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR) أداة بحثية فعّالة وعملية للغاية. ويُستخدم حاليًا في تحديد تسلسل مسببات العديد من الأمراض غير المعروفة. تُساعد هذه التقنية في تحديد تسلسل الفيروسات غير المعروفة سابقًا والمرتبطة بالفيروسات المعروفة، مما يُتيح لنا فهمًا أفضل للمرض نفسه. إذا أمكن تبسيط الإجراء وتطوير أنظمة كشف حساسة غير إشعاعية، فسيحتل تفاعل البوليميراز المتسلسل مكانة بارزة في المختبرات السريرية لسنوات قادمة. [ 23 ]

القيود

من أبرز عيوب تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR) ضرورة توفر معلومات مسبقة عن التسلسل المستهدف لتوليد البادئات التي تسمح بتضخيمه الانتقائي. [ 36 ] وهذا يعني أنه عادةً ما يتعين على مستخدمي تفاعل البوليميراز المتسلسل معرفة التسلسل (التسلسلات) الدقيق (التسلسلات) الواقعة قبل المنطقة المستهدفة على كل من القالبين أحاديي السلسلة لضمان ارتباط بوليميراز الحمض النووي بشكل صحيح بالهجائن بين البادئ والقالب، وبالتالي توليد المنطقة المستهدفة كاملةً أثناء تخليق الحمض النووي. [ 53 ] [ 54 ] ويمكن التغلب على هذا القيد باستخدام تقنيات تضخيم الحمض النووي العشوائي، مثل بصمة تضخيم الحمض النووي (DAF) [ 55 ] أو التضخيم العشوائي للحمض النووي متعدد الأشكال (RAPD). [ 56 ] تستخدم هذه الطرق لتحليل الحمض النووي بادئات عشوائية في تفاعلات البوليميراز المتسلسل، ولا تتطلب معرفة التسلسل.

ومثل جميع الإنزيمات، فإن بوليميرازات الحمض النووي معرضة للخطأ، مما يؤدي بدوره إلى حدوث طفرات في قطع الحمض النووي الناتجة عن تفاعل البوليميراز المتسلسل. [ 57 ]

من عيوب تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR) إمكانية تضخيم حتى أصغر كمية من الحمض النووي الملوث، مما يؤدي إلى نتائج مضللة أو غامضة. ولتقليل احتمالية التلوث، ينبغي على الباحثين تخصيص غرف منفصلة لتحضير الكواشف ، وإجراء تفاعل البوليميراز المتسلسل، وتحليل المنتج. كما يجب توزيع الكواشف في حصص للاستخدام لمرة واحدة . وينبغي استخدام ماصات ذات مكابس قابلة للاستبدال ورؤوس ماصة طويلة جدًا بشكل روتيني. [ 23 ] علاوة على ذلك، يُوصى بضمان اتباع نظام عمل أحادي الاتجاه في المختبر. فلا يجوز إدخال أي مواد أو كواشف مستخدمة في غرف تفاعل البوليميراز المتسلسل والتحليل إلى غرفة تحضير تفاعل البوليميراز المتسلسل دون تعقيمها جيدًا. [ 58 ]

قد تؤدي العينات البيئية التي تحتوي على أحماض الهيوميك إلى تثبيط تضخيم تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR) وتؤدي إلى نتائج غير دقيقة. [ 59 ]

الاختلافات

  • تفاعل البوليميراز المتسلسل النوعي للأليل أو نظام الطفرات المقاومة للتضخيم (ARMS) : تقنية تشخيصية أو استنساخية تعتمد على اختلافات النوكليوتيدات المفردة (SNVs، لا يجب الخلط بينها وبين تعدد أشكال النوكليوتيدات المفردة SNPs ) (اختلافات قاعدة واحدة لدى المريض). يمكن لهذا النظام الكشف عن أي طفرة تتضمن تغيير قاعدة واحدة. يتطلب ذلك معرفة مسبقة بتسلسل الحمض النووي، بما في ذلك الاختلافات بين الأليلات ، ويستخدم بادئات تغطي نهاياتها 3' موقع SNV (عادةً ما يتم تضمين منطقة عازلة من أزواج القواعد حول SNV). [ 60 ] يكون تضخيم تفاعل البوليميراز المتسلسل في ظل ظروف صارمة أقل كفاءة بكثير في حالة عدم تطابق القالب مع البادئ، لذا فإن التضخيم الناجح باستخدام بادئ نوعي لـ SNP يشير إلى وجود SNP المحدد أو حذف أجزاء صغيرة في التسلسل. [ 61 ] انظر التنميط الجيني لـ SNP لمزيد من المعلومات.
  • يُعدّ تضخيم الحمض النووي العشوائي مجموعة من طرق تحليل الحمض النووي التي تستخدم بادئات عشوائية لتضخيم الحمض النووي ذي التسلسل غير المعروف باستخدام تفاعل البلمرة المتسلسل (PCR). وتشمل هذه الطرق: تضخيم   الحمض النووي متعدد الأشكال العشوائي (RAPD)، وتفاعل البلمرة المتسلسل باستخدام بادئات عشوائية (AP-PCR)، وبصمة الحمض النووي المُضخّم (DAF). تستهدف البادئات المستخدمة في هذه الطرق مناطق غير معروفة في الجينوم أو التركيب المُهندس، مما يُنتج بصمات وراثية فريدة. وهذا ما يُميّز هذه التقنيات عن منهجيات تفاعل البلمرة المتسلسل التقليدية التي تتطلب معرفة التسلسل المستهدف.
  • تجميع تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR) أو تجميع دورات البوليميراز (PCA) : هو توليف اصطناعي لتسلسلات الحمض النووي الطويلة عن طريق إجراء تفاعل البوليميراز المتسلسل على مجموعة من النيوكليوتيدات الطويلة ذات الأجزاء المتداخلة القصيرة. تتناوب النيوكليوتيدات بين الاتجاهين الموجب والسالب، وتحدد الأجزاء المتداخلة ترتيب قطع تفاعل البوليميراز المتسلسل، مما ينتج عنه بشكل انتقائي منتج الحمض النووي الطويل النهائي. [ 62 ]
  • تفاعل البوليميراز المتسلسل غير المتماثل : يُضخّم بشكل تفضيلي أحد شريطي الحمض النووي في قالب الحمض النووي المزدوج. يُستخدم في التسلسل والتهجين حيث يكون تضخيم أحد الشريطين المتكاملين فقط مطلوبًا. يُجرى تفاعل البوليميراز المتسلسل كالمعتاد، ولكن مع فائض كبير من البادئ الخاص بالشريط المستهدف للتضخيم. نظرًا لبطء التضخيم ( الحسابي ) في المراحل اللاحقة من التفاعل بعد استهلاك البادئ المحدد، يلزم إجراء دورات إضافية من تفاعل البوليميراز المتسلسل. [ 63 ] يستخدم تعديل حديث لهذه العملية، يُعرف باسمتفاعل البوليميراز المتسلسل الخطي بعد الأسي (LATE-PCR)، بادئًا محددًا بدرجة انصهار ( Tm ) أعلى من البادئ الفائض للحفاظ على كفاءة التفاعل مع انخفاض تركيز البادئ المحدد في منتصف التفاعل . [ 64 ]
  • تفاعل البلمرة المتسلسل بالحمل الحراري : طريقة شبه متساوية الحرارة لإجراء تفاعل البلمرة المتسلسل. فبدلاً من تسخين وتبريد خليط التفاعل بشكل متكرر، يُعرَّض المحلول لتدرج حراري. ويؤدي عدم الاستقرار الحراري الناتج إلى تدفق حراري يُعيد توزيع كواشف التفاعل تلقائيًا بين المناطق الساخنة والباردة بشكل متكرر، مما يُتيح استمرار التفاعل. [ 65 ] ويمكن تحسين معايير مثل الشروط الحرارية الحدية وهندسة حاوية التفاعل للحصول على تفاعل قوي وسريع من خلال الاستفادة من ظهور حقول التدفق الفوضوية. [ 66 ] ويُقلل هذا الإعداد لتفاعل البلمرة المتسلسل بالحمل الحراري بشكل كبير من متطلبات الطاقة للجهاز ووقت التشغيل.
  • تفاعل البوليميراز المتسلسل الموجه بالتسلسل : طريقة متوازية للغاية لاستخلاص جزيئات الحمض النووي الدقيقة لتخليق الجينات. يتم تعديل مكتبة معقدة من جزيئات الحمض النووي بعلامات جانبية فريدة قبل التسلسل المتوازي المكثف. ثم تُمكّن البادئات الموجهة بالعلامات من استخلاص الجزيئات ذات التسلسلات المطلوبة بواسطة تفاعل البوليميراز المتسلسل. [ 67 ]
  • تفاعل البوليميراز الرقمي (dPCR) : يُستخدم لقياس كمية تسلسل الحمض النووي المستهدف في عينة الحمض النووي. تُخفف عينة الحمض النووي بشكل كبير، بحيث لا تحصل بعض تفاعلات البوليميراز المتعددة المتوازية على أي جزيء من الحمض النووي المستهدف. يُحسب تركيز الحمض النووي المستهدف باستخدام نسبة النتائج السلبية، ومن هنا جاءت تسمية "تفاعل البوليميراز الرقمي".
  • التضخيم المعتمد على الهيليكاز : يشبه تفاعل البوليميراز المتسلسل التقليدي، ولكنه يستخدم درجة حرارة ثابتة بدلاً من التناوب بين دورات التمسخ والتهجين/الاستطالة. يُستخدم إنزيم هيليكاز الحمض النووي ، وهو إنزيم يفك لولب الحمض النووي، بدلاً من التمسخ الحراري. [ 68 ]
  • تفاعل البوليميراز المتسلسل ذو البداية الساخنة : تقنية تقلل من التضخيم غير النوعي خلال المراحل الأولية لتحضير تفاعل البوليميراز المتسلسل. يمكن إجراؤها يدويًا بتسخين مكونات التفاعل إلى درجة حرارة التمسخ (مثل 95 درجة مئوية) قبل إضافة البوليميراز. [ 69 ] طُوّرت أنظمة إنزيمية متخصصة تثبط نشاط البوليميراز في درجة حرارة الغرفة، إما عن طريق ارتباط جسم مضاد [ 17 ] [ 70 ] أو بوجود مثبطات مرتبطة تساهميًا لا تنفصل إلا بعد خطوة تنشيط بدرجة حرارة عالية. يُحقق تفاعل البوليميراز المتسلسل ذو البداية الساخنة/النهاية الباردة باستخدام بوليميرازات هجينة جديدة غير نشطة في درجة حرارة الغرفة وتُنشط فورًا عند درجة حرارة الاستطالة.
  • يشير مصطلح تفاعل البوليميراز المتسلسل الحاسوبي (In silico PCR) (أو تفاعل البوليميراز المتسلسل الرقمي، أو تفاعل البوليميراز المتسلسل الافتراضي، أو تفاعل البوليميراز المتسلسل الإلكتروني، أو e-PCR) إلى الأدوات الحاسوبية المستخدمة لحساب نتائج تفاعل البوليميراز المتسلسل النظرية باستخدام مجموعة معينة من البادئات ( المجسات ) لتضخيم تسلسلات الحمض النووي من جينوم أو ترانسكريبتوم متسلسل . وقد طُرح تفاعل البوليميراز المتسلسل الحاسوبي كأداة تعليمية في علم الأحياء الجزيئي. [ 71 ]
  • تفاعل البوليميراز المتسلسل الخاص بالتسلسلات المتداخلة (ISSR): طريقة تفاعل البوليميراز المتسلسل لبصمة الحمض النووي التي تعمل على تضخيم المناطق الواقعة بين تكرارات التسلسلات البسيطة لإنتاج بصمة فريدة لأطوال القطع المضخمة. [ 72 ]
  • تفاعل البوليميراز المتسلسل العكسي : يُستخدم عادةً لتحديد التسلسلات المحيطة بالقطع الجينية المُدخلة. ويتضمن سلسلة من عمليات هضم الحمض النووي وربطه ذاتيًا ، مما ينتج عنه تسلسلات معروفة عند طرفي التسلسل غير المعروف. [ 73 ]
  • تفاعل البوليميراز المتسلسل المعتمد على الربط : يستخدم روابط DNA صغيرة مرتبطة بالحمض النووي المراد دراسته، بالإضافة إلى العديد من البادئات التي ترتبط بروابط DNA؛ وقد تم استخدامه في تسلسل الحمض النووي ، وتتبع الجينوم ، وبصمة الحمض النووي . [ 74 ]
  • تفاعل البوليميراز المتسلسل الخاص بالمثيلة (MSP): طُوِّرَ هذا التفاعل بواسطة ستيفن بايلين وجيمس جي. هيرمان في كلية الطب بجامعة جونز هوبكنز، [ 75 ] ويُستخدم للكشف عن مثيلة جزر CpG في الحمض النووي الجينومي. يُعالَج الحمض النووي أولًا ببيسلفيت الصوديوم، الذي يحوّل قواعد السيتوزين غير المثيلة إلى يوراسيل، والذي تتعرف عليه بادئات تفاعل البوليميراز المتسلسل على أنه ثايمين. ثم يُجرى تفاعلا بوليميراز متسلسل على الحمض النووي المُعدَّل، باستخدام مجموعات بادئات متطابقة باستثناء أي جزر CpG ضمن تسلسلات البادئات. عند هذه النقاط، تتعرف إحدى مجموعات البادئات على الحمض النووي الذي يحتوي على السيتوزين لتضخيم الحمض النووي المثيل، بينما تتعرف المجموعة الأخرى على الحمض النووي الذي يحتوي على اليوراسيل أو الثايمين لتضخيم الحمض النووي غير المثيل. يمكن أيضًا إجراء تفاعل البوليميراز المتسلسل الخاص بالمثيلة باستخدام تفاعل البوليميراز المتسلسل الكمي (qPCR) للحصول على معلومات كمية بدلًا من المعلومات النوعية حول المثيلة.
  • تفاعل البوليميراز المتسلسل باستخدام البادئات المصغرة : يستخدم بوليميرازًا مقاومًا للحرارة (S-Tbr) قادرًا على التمديد من بادئات قصيرة ("smalligos") لا يتجاوز طولها 9 أو 10 نيوكليوتيدات. تسمح هذه الطريقة باستهداف تفاعل البوليميراز المتسلسل لمناطق ارتباط البادئات الأصغر، وتُستخدم لتضخيم تسلسلات الحمض النووي المحفوظة، مثل جين 16S (أو 18S في حقيقيات النوى) rRNA. [ 76 ]
  • تضخيم المجسات المعتمد على الربط المتعدد ( MLPA ): يسمح بتضخيم أهداف متعددة باستخدام زوج واحد من البادئات، وبالتالي تجنب قيود الدقة لتفاعل البوليميراز المتعدد (انظر أدناه).
  • تفاعل البوليميراز المتعدد (Multiplex-PCR) : يتكون من مجموعات متعددة من البادئات ضمن مزيج تفاعل واحد لإنتاج قطع DNA مضخمة بأحجام مختلفة، خاصة بتسلسلات DNA مختلفة. من خلال استهداف جينات متعددة في آن واحد، يمكن الحصول على معلومات إضافية من تجربة واحدة، والتي تتطلب في الأحوال العادية كميات أكبر من الكواشف ووقتًا أطول. يجب ضبط درجات حرارة التلدين لكل مجموعة من البادئات بدقة لضمان عملها بشكل صحيح ضمن التفاعل الواحد، وكذلك أحجام القطع المضخمة. أي أن طول أزواج القواعد فيها يجب أن يكون مختلفًا بما يكفي لتكوين حزم مميزة عند تصويرها بالهجرة الكهربائية الهلامية .
  • تفاعل البوليميراز المتسلسل بمساعدة الجسيمات النانوية (nanoPCR) : يمكن لبعض الجسيمات النانوية (NPs) تعزيز كفاءة تفاعل البوليميراز المتسلسل (ومن هنا جاءت تسميته nanoPCR)، بل إن بعضها يتفوق على مُحسِّنات تفاعل البوليميراز المتسلسل الأصلية. وقد أشارت التقارير إلى أن النقاط الكمومية (QDs) تُحسِّن خصوصية وكفاءة تفاعل البوليميراز المتسلسل. وتُعد أنابيب الكربون النانوية أحادية الجدار (SWCNTs) وأنابيب الكربون النانوية متعددة الجدران (MWCNTs) فعالة في تعزيز تضخيم تفاعل البوليميراز المتسلسل الطويل. كما يُمكن لمسحوق الكربون النانوي (CNP) تحسين كفاءة تفاعل البوليميراز المتسلسل المتكرر وتفاعل البوليميراز المتسلسل الطويل، بينما وُجد أن أكسيد الزنك وثاني أكسيد التيتانيوم وجسيمات الفضة النانوية تزيد من ناتج تفاعل البوليميراز المتسلسل. وأشارت بيانات سابقة إلى أن الجسيمات النانوية غير المعدنية حافظت على دقة تضخيم مقبولة. ونظرًا لقدرة العديد من الجسيمات النانوية على تعزيز كفاءة تفاعل البوليميراز المتسلسل، فمن الواضح أن هناك إمكانات كبيرة لتحسين تقنية nanoPCR وتطوير المنتجات. [ 77 ] [ 78 ]
  • تفاعل البوليميراز المتسلسل المتداخل : يزيد من دقة تضخيم الحمض النووي، بتقليل التشويش الناتج عن التضخيم غير النوعي للحمض النووي. يُستخدم مجموعتان من البادئات في تفاعلي بوليميراز متتاليين. في التفاعل الأول، يُستخدم زوج واحد من البادئات لإنتاج نواتج الحمض النووي، والتي قد تحتوي، بالإضافة إلى الهدف المقصود، على أجزاء من الحمض النووي مُضخّمة بشكل غير نوعي. ثم تُستخدم هذه النواتج في تفاعل بوليميراز ثانٍ مع مجموعة من البادئات التي تختلف مواقع ارتباطها كليًا أو جزئيًا عن مواقع ارتباط البادئات المستخدمة في التفاعل الأول، وتقع في الطرف 3' منها. غالبًا ما يكون تفاعل البوليميراز المتسلسل المتداخل أكثر نجاحًا في تضخيم أجزاء الحمض النووي الطويلة بشكل نوعي مقارنةً بتفاعل البوليميراز المتسلسل التقليدي، ولكنه يتطلب معرفة أكثر تفصيلًا بتسلسلات الهدف.
  • تقنية تفاعل البوليميراز المتسلسل لتمديد التداخل (Overlap-extension PCR) أو الربط بتمديد التداخل (SOEing) : هي تقنية هندسة وراثية تُستخدم لربط قطعتين أو أكثر من الحمض النووي (DNA) التي تحتوي على تسلسلات متكاملة. تُستخدم هذه التقنية لربط قطع الحمض النووي التي تحتوي على جينات أو تسلسلات تنظيمية أو طفرات؛ وتُمكّن من إنشاء تركيبات حمض نووي محددة وطويلة. كما يمكنها إدخال حذف أو إدخال أو طفرات نقطية في تسلسل الحمض النووي. [ 79 ] [ 80 ]
  • تقنية PAN-AC : تستخدم ظروفًا متساوية الحرارة للتضخيم، ويمكن استخدامها في الخلايا الحية. [ 81 ] [ 82 ]
  • PAN-PCR : طريقة حسابية لتصميم فحوصات تصنيف البكتيريا بناءً على بيانات تسلسل الجينوم الكامل. [ 83 ]
  • تفاعل البوليميراز المتسلسل الكمي (qPCR): يُستخدم لقياس كمية تسلسل مستهدف (عادةً في الوقت الحقيقي). يقيس هذا التفاعل الكمي كميات الحمض النووي DNA أو cDNA أو RNA الأولية. يُستخدم تفاعل البوليميراز المتسلسل الكمي بشكل شائع لتحديد ما إذا كان تسلسل الحمض النووي موجودًا في عينة وعدد نسخه فيها. يتميز تفاعل البوليميراز المتسلسل الكمي بدقة عالية جدًا. تستخدم طرق تفاعل البوليميراز المتسلسل الكمي أصباغًا فلورية، مثل Sybr Green أو EvaGreen، أو مجسات DNA تحتوي على فلوروفور ، مثل TaqMan ، لقياس كمية المنتج المُضخّم في الوقت الحقيقي. يُختصر أحيانًا إلى RT-PCR ( تفاعل البوليميراز المتسلسل في الوقت الحقيقي )، ولكن يجب استخدام هذا الاختصار فقط لتفاعل البوليميراز المتسلسل للنسخ العكسي . يُعد qPCR الاختصار الصحيح لتفاعل البوليميراز المتسلسل الكمي (تفاعل البوليميراز المتسلسل في الوقت الحقيقي).
  • تفاعل البوليميراز المتسلسل العكسي التكميلي (RC-PCR): يسمح بإضافة نطاقات أو تسلسلات وظيفية مختارة بشكل مستقل إلى أي من طرفي ناتج التضخيم في تفاعل أنبوب مغلق واحد. تُنتج هذه الطريقة بادئات خاصة بالهدف داخل التفاعل من خلال تفاعل البادئات العامة (التي تحتوي على التسلسلات أو النطاقات المطلوبة للإضافة) مع مجسات RC.
  • تفاعل البوليميراز المتسلسل للنسخ العكسي (RT-PCR) : يُستخدم لتضخيم الحمض النووي من الحمض النووي الريبوزي (RNA).يقومالعكسي بنسخ الحمض النووي الريبوزي (RNA) إلى الحمض النووي التكميلي (cDNA) ، والذي يُضخّم بعد ذلك بواسطة تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR). يُستخدم RT-PCR على نطاق واسع في تحليل التعبير الجيني، لتحديد مستوى التعبير عن جين معين أو لتحديد تسلسل نسخة الحمض النووي الريبوزي (RNA)، بما في ذلك مواقع بدء وانتهاء النسخ. إذا كان تسلسل الحمض النووي الجينومي لجين ما معروفًا، فيمكن استخدام RT-PCR لتحديد مواقع الإكسونات والإنترونات في الجين. عادةً ما يتم تحديد الطرف 5' للجين (الموافق لموقع بدء النسخ) بواسطة تفاعل البوليميراز المتسلسل السريع لنهايات الحمض النووي التكميلي ( RACE-PCR ).
  • تفاعل البوليميراز المتسلسل المعتمد على إنزيم RNase H (rhPCR): هو تعديل لتفاعل البوليميراز المتسلسل يستخدم بادئات ذات امتداد 3' يمكن إزالته بواسطة إنزيم RNase HII المقاوم للحرارة. يقلل هذا النظام من ثنائيات البادئات ويسمح بإجراء تفاعلات متعددة باستخدام عدد أكبر من البادئات. [ 84 ]
  • تفاعل البوليميراز المتسلسل باستخدام بادئ واحد محدد (SSP-PCR): يسمح بتضخيم الحمض النووي المزدوج حتى عندما تكون معلومات التسلسل متاحة من أحد طرفيه فقط. تتيح هذه الطريقة تضخيم الجينات التي لا تتوفر عنها سوى معلومات تسلسل جزئية، كما تسمح بتتبع الجينوم في اتجاه واحد من المناطق المعروفة إلى المناطق غير المعروفة على الكروموسوم. [ 85 ]
  • PCR ذو الطور الصلب : يشمل معاني متعددة، بما في ذلك تضخيم البولوني (حيث يتم اشتقاق مستعمرات PCR في مصفوفة هلامية، على سبيل المثال)، وPCR الجسري [ 86 ] (حيث يتم ربط البادئات تساهميًا بسطح دعم صلب)، وPCR التقليدي ذو الطور الصلب (حيث يتم تطبيق PCR غير المتماثل في وجود دعم صلب يحمل بادئًا بتسلسل مطابق لأحد البادئات المائية) وPCR المحسن ذو الطور الصلب [ 87 ] (حيث يمكن تحسين PCR التقليدي ذو الطور الصلب عن طريق استخدام Tm عالي وبادئ دعم صلب متداخل مع تطبيق اختياري لـ "خطوة" حرارية لتفضيل بادئ الدعم الصلب).
  • تفاعل البوليميراز المتسلسل الانتحاري : يُستخدم عادةً في علم الوراثة القديمة أو غيرها من الدراسات التي يكون فيها تجنب النتائج الإيجابية الكاذبة وضمان خصوصية الجزء المُضخّم أولوية قصوى. وُصِفَ هذا التفاعل لأول مرة في دراسة للتحقق من وجود ميكروب يرسينيا الطاعونية في عينات أسنان مأخوذة من قبور تعود إلى القرن الرابع عشر لأشخاص يُفترض أنهم لقوا حتفهم بسبب الطاعون خلال وباء الموت الأسود في العصور الوسطى . [ 88 ] تنص هذه الطريقة على استخدام أي مجموعة من البادئات مرة واحدة فقط في تفاعل البوليميراز المتسلسل (ومن هنا جاء مصطلح "الانتحاري")، والتي لا ينبغي استخدامها مطلقًا في أي تفاعل تحكم إيجابي، ويجب أن تستهدف البادئات دائمًا منطقة جينومية لم تُضخّم من قبل في المختبر باستخدام هذه المجموعة أو أي مجموعة أخرى من البادئات. يضمن هذا عدم وجود حمض نووي ملوث من تفاعلات البوليميراز المتسلسل السابقة في المختبر، والذي قد يُؤدي إلى نتائج إيجابية كاذبة.
  • تفاعل البوليميراز المتسلسل المتداخل غير المتماثل الحراري (TAIL-PCR) : يُستخدم لعزل تسلسل غير معروف يحيط بتسلسل معروف. ضمن التسلسل المعروف، يستخدم تفاعل TAIL-PCR زوجًا متداخلًا من البادئات ذات درجات حرارة تلدين مختلفة؛ ويُستخدم بادئ متدهور للتضخيم في الاتجاه المعاكس من التسلسل غير المعروف. [ 89 ]
  • تفاعل البوليميراز المتسلسل التدريجي ( Touchdown PCR ): هو نوع من تفاعل البوليميراز المتسلسل يهدف إلى تقليل التشويش غير النوعي عن طريق خفض درجة حرارة التلدين تدريجيًا مع تقدم دورات التفاعل. عادةً ما تكون درجة حرارة التلدين في الدورات الأولى أعلى ببضع درجات (3-5 درجات مئوية) من درجة انصهار البادئات المستخدمة، بينما تكون في الدورات اللاحقة أقل ببضع درجات (3-5 درجات مئوية) من درجة  انصهار البادئات. تمنح درجات الحرارة المرتفعة خصوصية أكبر لارتباط البادئات، بينما تسمح درجات الحرارة المنخفضة بتضخيم أكثر كفاءة للمنتجات النوعية المتكونة خلال الدورات الأولى. [ 90 ]
  • تقنية تفاعل البوليميراز المتسلسل ثنائي الذيل هي تقنية طورها البروفيسور ميكائيل كوبيستا لتضخيم جزيئات القالب القصيرة مثل الحمض النووي الريبي الميكروي ، وحتى الأقصر منها، باستخدام بادئ دبوس الشعر الذي يتهجن مع الهدف من طرفيه 3' و 5'. [ 91 ]
  • تقنية المشي السريع الشامل (UFW ): تُستخدم هذه التقنية في تتبع الجينوم والبصمة الوراثية باستخدام تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR) ثنائي الاتجاه، وهو أكثر دقة من الطرق التقليدية أحادية الاتجاه (التي تستخدم بادئًا واحدًا خاصًا بالجين وبادئًا عامًا واحدًا، مما قد يؤدي إلى تشويش غير مرغوب فيه) [ 92 ]، وذلك بفضل آلية تتضمن تكوين بنية حلقية. ومن بين المشتقات المُحسّنة لتقنية UFW: LaNe RAGE (تفاعل البوليميراز المتسلسل المتداخل المعتمد على البنية الحلقية للتضخيم السريع لنهايات الحمض النووي الجينومي) [ 93 ] ، و 5'RACE LaNe [ 94 ] ، و3'RACE LaNe [ 95 ] .

تاريخ

رسم تخطيطي يوضح مثالاً على زوج من البادئات. كان استخدام البادئات في اختبار المختبر للسماح بتخليق الحمض النووي ابتكارًا رئيسيًا سمح بتطوير تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR).

تم اكتشاف الإنزيمات المقاومة للحرارة، والتي تعد مكونًا رئيسيًا في تفاعل البوليميراز المتسلسل، في الستينيات من القرن الماضي كمنتج لشكل من أشكال الحياة الميكروبية التي عاشت في المياه شديدة السخونة لنبع الفطر في يلوستون . [ 96 ]

في عام 1971، نشرت مجلة البيولوجيا الجزيئية بحثًا من تأليف كيل كليبي وزملاؤه في مختبر هـ. غوبيند خورانا، وصفوا لأول مرة طريقة استخدام فحص إنزيمي لنسخ قالب DNA قصير باستخدام بادئات في المختبر . [ 97 ] ومع ذلك، لم يحظَ هذا الظهور المبكر لمبدأ تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR) الأساسي باهتمام كبير في ذلك الوقت، ويُنسب اختراع تفاعل البوليميراز المتسلسل في عام 1983 عمومًا إلى كاري موليس . [ 98 ]

"بيبي بلو"، جهاز نموذجي من عام 1986 لإجراء تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR).

عندما طوّر موليس تقنية تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR) عام 1983، كان يعمل في إيمريڤيل ، كاليفورنيا، لدى شركة سيتوس ، إحدى أوائل شركات التكنولوجيا الحيوية ، حيث كان مسؤولاً عن تركيب سلاسل قصيرة من الحمض النووي (DNA). وقد ذكر موليس أنه استلهم فكرة تقنية PCR أثناء قيادته سيارته على طول طريق ساحل المحيط الهادئ ليلةً ما. [ 99 ] كان يفكر في طريقة جديدة لتحليل التغيرات (الطفرات) في الحمض النووي عندما أدرك أنه في الواقع ابتكر طريقة لتضخيم أي منطقة من الحمض النووي من خلال دورات متكررة من التضاعف مدفوعة بإنزيم بوليميراز الحمض النووي. وفي مجلة ساينتفك أمريكان ، لخص موليس الإجراء قائلاً: "بدءًا من جزيء واحد من المادة الوراثية DNA، يمكن لتقنية PCR توليد 100 مليار جزيء مماثل في فترة ما بعد الظهر. التفاعل سهل التنفيذ، ولا يتطلب سوى أنبوب اختبار، وبعض الكواشف البسيطة، ومصدر حرارة." [ 100 ] استُخدمت بصمة الحمض النووي لأول مرة في اختبارات إثبات النسب عام 1988. [ 101 ]

أرجع موليس الفضل في تطويره لتقنية تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR) إلى استخدامه لمادة LSD : "هل كنت سأخترع تقنية PCR لو لم أتناول LSD؟ أشك في ذلك بشدة. لقد تعلمت ذلك جزئيًا من خلال العقاقير المهلوسة." [ 102 ]

حصل موليس وعالم الكيمياء الحيوية مايكل سميث ، اللذان طورا طرقًا أساسية أخرى لمعالجة الحمض النووي، [ 1 ] على جائزة نوبل في الكيمياء عام 1993، بعد سبع سنوات من تطبيق موليس وزملاؤه في شركة سيتوس لاقتراحه عمليًا. [ 103 ] وقد حظيت ورقة موليس البحثية التي نُشرت عام 1985 بالاشتراك مع آر كي سايكي وإتش إيه إيرليخ، بعنوان "التضخيم الإنزيمي لتسلسلات جينوم بيتا غلوبين وتحليل مواقع التقييد لتشخيص فقر الدم المنجلي" - وهو اختراع تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR) - بتكريم من قسم تاريخ الكيمياء في الجمعية الكيميائية الأمريكية عام 2017، حيث نال جائزة تقديرية للإنجاز الكيميائي. [ 104 ] [ 2 ]

يكمن جوهر تقنية تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR) في استخدام بوليميراز DNA مناسب قادر على تحمل درجات الحرارة العالية التي تتجاوز 90 درجة مئوية (194 درجة فهرنهايت)، واللازمة لفصل سلسلتي DNA في اللولب المزدوج بعد كل دورة تضاعف . لم تكن بوليميرازات DNA المستخدمة في التجارب المخبرية التي سبقت تقنية PCR قادرة على تحمل هذه الدرجات العالية. [ 2 ] لذا، كانت الإجراءات المبكرة لتضاعف DNA غير فعالة وتستغرق وقتًا طويلاً، وتتطلب كميات كبيرة من بوليميراز DNA ومعالجة مستمرة طوال العملية.  

أدى اكتشاف بوليميراز Taq عام 1976 - وهو بوليميراز DNA مُستخلص من بكتيريا Thermus aquaticus المحبة للحرارة ، في دراسة شاركت في تأليفها أليس تشين تشانغ - والتي تعيش طبيعيًا في بيئات حارة ( من 50 إلى 80 درجة مئوية (122 إلى 176 درجة فهرنهايت) ) [ 20 ] مثل الينابيع الحارة - إلى تحسينات جذرية في طريقة تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR). يتميز بوليميراز DNA المعزول من T. aquaticus بثباته في درجات الحرارة العالية، حيث يبقى نشطًا حتى بعد تمسخ DNA، [ 21 ] مما يُغني عن إضافة بوليميراز DNA جديد بعد كل دورة. [ 3 ] وقد أتاح ذلك عملية تضخيم DNA آلية تعتمد على جهاز التدوير الحراري.  

النزاعات المتعلقة ببراءات الاختراع

حصل كاري موليس على براءة اختراع تقنية تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR) ونُقلت ملكيتها إلى شركة سيتوس ، حيث كان موليس يعمل عندما اخترع التقنية عام 1983. كما شمل الاختراع إنزيم بوليميراز Taq . وقد رُفعت عدة دعاوى قضائية متعلقة بهذه التقنية من قِبل شركة دوبونت . [ 105 ] اشترت شركة هوفمان-لا روش السويسرية للأدوية حقوق براءات الاختراع عام 1992. وانتهت صلاحية آخر براءات اختراع تقنية PCR التجارية عام 2017. [ 106 ]

لا تزال معركة براءات الاختراع المتعلقة بإنزيم بوليميراز Taq مستمرة في عدة ولايات قضائية حول العالم بين شركتي روش وبروميج . وقد امتدت المرافعات القانونية إلى ما بعد انتهاء صلاحية براءات اختراع تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR) وبوليميراز Taq الأصلية ، والتي انتهت في 28 مارس 2005. [ 107 ]

انظر أيضاً

مراجع

  1. 1 2 "جائزة نوبل في الكيمياء 1993" . NobelPrize.org .
  2. 1 2 3 4 سايكي آر كيه، شارف إس، فالونا إف، موليس كيه بي، هورن جي تي، إيرليش إتش إيه، وآخرون . (ديسمبر 1985). "التضخيم الإنزيمي لتسلسلات جينوم بيتا غلوبين وتحليل مواقع التقييد لتشخيص فقر الدم المنجلي". مجلة ساينس . 230 (4732): 1350-1354 . Bibcode : 1985Sci...230.1350S . doi : 10.1126/science.2999980 . PMID 2999980 .  
  3. 1 2 سايكي آر كيه، جيلفاند دي إتش، ستوفيل إس، شارف إس جيه، هيغوتشي آر، هورن جي تي، وآخرون . (يناير 1988). "التضخيم الإنزيمي الموجه بالبادئ للحمض النووي باستخدام بوليميراز الحمض النووي المقاوم للحرارة". مجلة ساينس . 239 (4839): 487-491 . Bibcode : 1988Sci...239..487S . doi : 10.1126/science.239.4839.487 . PMID 2448875 .  
  4. 1 2 خيهرا ن، بادا آي إس، سويفت سي جيه (2025)، "تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR)" ، ستات بيرلز ، تريجر آيلاند (فلوريدا): ستات بيرلز للنشر، PMID 36943981 ، تم استرجاعه في 28 يونيو 2025 
  5. ↑ إينرز إي، بورتا إيه آر (2012). "تحديد درجات حرارة التلدين لتفاعل البوليميراز المتسلسل". معلم الأحياء الأمريكي . 74 (4): 256-260 . doi : 10.1525/abt.2012.74.4.9 . S2CID 86708426 . 
  6. 1 2 3 4 5 6 نينفا أ، بالو د، بينور م (2009). مناهج المختبر الأساسية للكيمياء الحيوية والتكنولوجيا الحيوية . الولايات المتحدة: وايلي. ص 408-410 . ISBN  978-0-470-08766-4.
  7. ↑ تشنغ إس، فوكلر سي، بارنز دبليو إم، هيغوتشي آر (يونيو 1994). "التضخيم الفعال للأهداف الطويلة من الإدخالات المستنسخة والحمض النووي الجينومي البشري" . وقائع الأكاديمية الوطنية للعلوم في الولايات المتحدة الأمريكية . 91 (12): 5695-99 . Bibcode : 1994PNAS...91.5695C . doi : 10.1073/pnas.91.12.5695 . PMC 44063. PMID 8202550 .  
  8. ↑ كار إيه سي، مور إس دي (2012). لوسيا إيه (محرر). "القياس الكمي الدقيق لتفاعلات البوليميراز المتسلسل باستخدام المطابقة الشاملة" . PLOS ONE . 7 (5) e37640. Bibcode : 2012PLoSO...737640C . doi : 10.1371/journal.pone.0037640 . PMC 3365123. PMID 22701526 .  
  9. 1 2 جوزيف سامبروك، ديفيد دبليو راسل (2001). الاستنساخ الجزيئي: دليل المختبر ( الطبعة الثالثة). كولد سبرينغ هاربور، نيويورك: مطبعة مختبر كولد سبرينغ هاربور. ISBN  978-0-87969-576-7.الفصل الثامن: تضخيم الحمض النووي في المختبر بواسطة تفاعل البوليميراز المتسلسل
  10. ↑ "تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR)" . المركز الوطني لمعلومات التكنولوجيا الحيوية، المكتبة الوطنية الأمريكية للطب.
  11. ↑ فان بيلت-فيركويل إي، فان بيلكوم أ، هايز جيه بي (2008). "إنزيم Taq وبوليميرازات الحمض النووي الأخرى المقاومة للحرارة". مبادئ وجوانب تقنية لتضخيم تفاعل البوليميراز المتسلسل . الصفحات 103-118 . doi : 10.1007/978-1-4020-6241-4_7 . ISBN  978-1-4020-6240-7.
  12. ↑ "PCR" . مركز تعليم العلوم الوراثية، جامعة يوتا .
  13. ↑ بافلوف إيه آر، بافلوفا إن في، كوزيافكين إس إيه، سليساريف إيه آي (مايو 2004). "التطورات الحديثة في تحسين بوليميرازات الحمض النووي المقاومة للحرارة لتطبيقات فعالة". اتجاهات في التكنولوجيا الحيوية . 22 (5): 253-260 . doi : 10.1016/j.tibtech.2004.02.011 . PMID 15109812 . 
  14. ↑ ويجز، ج. م. (1 يناير 2005)، "تفاعل البوليميراز المتسلسل"، في وورسفولد، ب.، تاونشيند، أ.، بول، س. (محررون)، موسوعة العلوم التحليلية (الطبعة الثانية) ، أكسفورد: إلسيفير، ص 243-250 ، doi : 10.1016/b0-12-369397-7/00475-1 ، ISBN  978-0-12-369397-6PMC 7173440​ 
  15. ↑ شركة Thermo Fisher Scientific . "تعليم حول أجهزة التدوير الحراري لتفاعل البوليميراز المتسلسل" . تم الاطلاع عليه بتاريخ 3 أغسطس 2025 .
  16. ↑ ريتشليك دبليو، سبنسر دبليو جيه، رودز آر إي (نوفمبر 1990). "تحسين درجة حرارة التلدين لتضخيم الحمض النووي في المختبر" . مجلة أبحاث الأحماض النووية . 18 (21): 6409-12 . doi : 10.1093/nar/18.21.6409 . PMC 332522. PMID 2243783 .  
  17. 1 2 شاركي دي جيه، سكايليس إي آر، كريستي كي جي، أتوود إس إم، دايس جيه إل (مايو 1994) . "الأجسام المضادة كمفاتيح حساسة للحرارة: التحفيز بدرجة حرارة عالية لتفاعل البوليميراز المتسلسل". التكنولوجيا الحيوية . 12 (5): 506-509 . doi : 10.1038/nbt0594-506 . PMID 7764710. S2CID 2885453 .  
  18. ↑ " تفاعل البوليميراز المتسلسل على بريتانيكا" .
  19. ↑ " تفاعل البوليميراز المتسلسل على بريتانيكا" .
  20. 1 2 تشين أ، إدغار د.ب، تريلا ج.م (سبتمبر 1976). "بوليميراز الحمض النووي الريبوزي منقوص الأكسجين من البكتيريا المحبة للحرارة الشديدة ثيرموس أكواتيكوس" . مجلة علم البكتيريا . 127 (3): 1550-1557 . doi : 10.1128/jb.127.3.1550-1557.1976 . PMC 232952. PMID 8432 .  
  21. 1 2 Lawyer FC, Stoffel S, Saiki RK, Chang SY, Landre PA, Abramson RD, et al. (مايو 1993). "التعبير عالي المستوى، والتنقية، والخصائص الإنزيمية لبوليميراز الحمض النووي الكامل الطول من Thermus aquaticus وشكل مبتور يفتقر إلى نشاط الإكسونوكلياز من 5' إلى 3'" . طرق وتطبيقات تفاعل البوليميراز المتسلسل . 2 (4): 275-87 . doi : 10.1101/gr.2.4.275 . PMID 8324500 .  
  22. ↑ " تفاعل البوليميراز المتسلسل على بريتانيكا" .
  23. 1 2 3 4 شوختمان جي، أو سي واي، جونز دبليو كيه (ديسمبر 1988). "تفاعل البوليميراز المتسلسل". مجلة الأمراض المعدية . 158 (6): 1154-1157 . doi : 10.1093/infdis/158.6.1154 . JSTOR 30137034. PMID 2461996 .  
  24. ↑ بورمان، جون، شوستر، ديفيد، لي، وو-بو، جيسي، جويل، راشتشيان، أيوب (2000). "تفاعل البوليميراز المتسلسل من قوالب إشكالية" (ملف PDF) . فوكس . 22 (1): 10. مؤرشف من الأصل (ملف PDF) في 7 مارس 2017.
  25. ↑ بوغيتو ب، وايدن ل، أندرسون هـ (2000). "نصائح مفيدة لتفاعل البوليميراز المتسلسل" (ملف PDF) . فوكس . 22 (1): 12. مؤرشف من الأصل (ملف PDF) في 7 مارس 2017.
  26. ↑ بيولابس إن إي. "بوليميراز الحمض النووي عالي الدقة Q5® | إن إي بي" . www.neb.com . تم الاطلاع عليه بتاريخ 4 ديسمبر 2021 .
  27. ↑ Sze MA, Schloss PD (2019). "تأثير بوليميراز الحمض النووي وعدد دورات التضخيم في تفاعل البوليميراز المتسلسل على بيانات تسلسل جين 16S rRNA" . mSphere . 4 ( 3): e00163–19. doi : 10.1128/mSphere.00163-19 . PMC 6531881. PMID 31118299 .  
  28. ↑ ساركار ج، كابيلنر س، سومر س س (ديسمبر 1990). "يمكن للفورماميد أن يحسن بشكل كبير من خصوصية تفاعل البوليميراز المتسلسل" . أبحاث الأحماض النووية . 18 (24): 7465. doi : 10.1093/nar/18.24.7465 . PMC 332902. PMID 2259646 .  
  29. ↑ "التفاعل المتسلسل الإلكتروني للبوليميراز" . المركز الوطني لمعلومات التكنولوجيا الحيوية (NCBI) . تم الاطلاع عليه بتاريخ 13 مارس 2012 .
  30. ↑ ألبرتس ب، جونسون أ، لويس ج، راف م، روبرتس ك، والتر ب (2002)، "عزل واستنساخ وتسلسل الحمض النووي" ، علم الأحياء الجزيئي للخلية. الطبعة الرابعة ، جارلاند ساينس ، تم الاطلاع عليه في 28 يونيو 2025
  31. ↑ بافلوف إيه آر، بافلوفا إن في، كوزيافكين إس إيه، سليساريف إيه آي (2006). "بوليميرازات الحمض النووي المقاومة للحرارة لمجموعة واسعة من التطبيقات: مقارنة بين إنزيم توبوتاك الهجين القوي وإنزيمات أخرى". في كيليتشاوا جيه (محرر). تسلسل الحمض النووي II: تحسين التحضير والتنظيف . جونز وبارتليت. ص 241-257 . ISBN  978-0-7637-3383-4.
  32. ↑ فان بيلكوم أ (أبريل 1994). "البصمة الوراثية للكائنات الدقيقة ذات الأهمية الطبية باستخدام تفاعل البوليميراز المتسلسل" . مراجعات علم الأحياء الدقيقة السريرية . 7 (2): 174-184 . doi : 10.1128/CMR.7.2.174 . ISSN 0893-8512 . PMC 358316. PMID 8055466 .   
  33. ↑ بومبيرت جيه إف، سيستيك في، بويسينو إم، فرينيت إم (أكتوبر 2009). "العلاقات التطورية بين المكورات العقدية اللعابية كما استُنتجت من علم الوراثة متعدد المواقع بناءً على تسلسلات جينات 16S rRNA، وrecA، وsecA، وsecY" . مجلة BMC لعلم الأحياء الدقيقة . 9 232. doi : 10.1186/1471-2180-9-232 . PMC 2777182. PMID 19878555 .  
  34. ↑ "التخليق الكيميائي، والتسلسل، وتضخيم الحمض النووي (ملاحظات صفية حول مقرر MBB/BIO 343)" . جامعة ولاية أريزونا. مؤرشف من الأصل في 9 أكتوبر 1997. تم الاطلاع عليه في 29 أكتوبر 2007 .
  35. ↑ بوستين إس إيه، بينيس في، غارسون جيه إيه، هيلمانز جيه، هوجيت جيه، كوبيستا إم، وآخرون (أبريل 2009). "إرشادات MIQE: الحد الأدنى من المعلومات اللازمة لنشر تجارب تفاعل البوليميراز المتسلسل الكمي في الوقت الحقيقي" (ملف PDF) . الكيمياء السريرية . 55 (4): 611-622 . doi : 10.1373/clinchem.2008.112797 . PMID 19246619 .  
  36. 1 2 3 4 غاريبان إل ، أفاشيا ن (مارس 2013). "تفاعل البوليميراز المتسلسل" . مجلة الأمراض الجلدية الاستقصائية . 133 (3): 1-4 . doi : 10.1038/jid.2013.1 . PMC 4102308. PMID 23399825 .  
  37. ↑ شنيل إس، ميندوزا سي (أكتوبر 1997). "الوصف النظري لتفاعل البوليميراز المتسلسل" . مجلة البيولوجيا النظرية . 188 (3): 313-318 . Bibcode : 1997JThBi.188..313S . doi : 10.1006/jtbi.1997.0473 . PMID 9344735 . 
  38. ↑ شنيل إس، ميندوزا سي (21 فبراير 1997). "اعتبارات إنزيمية للوصف النظري لتفاعل البوليميراز المتسلسل التنافسي الكمي (QC-PCR)" . مجلة البيولوجيا النظرية . 184 (4): 433-440 . Bibcode : 1997JThBi.184..433S . doi : 10.1006/jtbi.1996.0283 . ISSN 0022-5193 . PMID 9082073 .  
  39. ↑ بيكر إس، بوغر بي، أوهلمان آر، إرنست إيه (1 نوفمبر 2000). "انحياز تفاعل البوليميراز المتسلسل في التحليل البيئي: دراسة حالة لتحليلات نوكلياز Taq الكمية في تحليلات المجتمعات الميكروبية" . علم الأحياء الدقيقة التطبيقي والبيئي . 66 (11): 4945-53 . Bibcode : 2000ApEnM..66.4945B . doi : 10.1128/AEM.66.11.4945-4953.2000 . ISSN 1098-5336 . PMC 92404. PMID 11055948 .   
  40. ↑ سولومون، أ. و.، بيلينغ، ر. و.، فوستر، أ.، مابي، د. س . (1 أكتوبر 2004). "تشخيص وتقييم التراخوما" . مراجعات علم الأحياء الدقيقة السريرية . 17 (4): 982-1011 . doi : 10.1128/CMR.17.4.982-1011.2004 . ISSN 0893-8512 . PMC 523557. PMID 15489358 .   
  41. ↑ رمزي، ر.م. (أبريل 2002). "التطورات الحديثة في تقنيات التشخيص الجزيئي لداء الفيلاريات اللمفاوية لدى الإنسان واستخدامها في البحوث الوبائية" . معاملات الجمعية الملكية للطب الاستوائي والنظافة . 96 : ص 225-229. doi : 10.1016/S0035-9203(02)90080-5 . PMID 12055843 . 
  42. ↑ ساكس ك (2003). "خصوصية وأداء فحوصات تفاعل البوليميراز المتسلسل التشخيصية". في ساكس ك، فراي ج (محرران). الكشف عن مسببات الأمراض الميكروبية باستخدام تفاعل البوليميراز المتسلسل . طرق في البيولوجيا الجزيئية. المجلد 216. توتوا، نيو جيرسي: دار هومانا للنشر. الصفحات 3-29 . doi : 10.1385/1-59259-344-5:03 . ISBN   978-1-59259-344-6PMID 12512353​​ 
  43. ↑ كويل إي (مارس 2008). "الطب. مطابقة الدم تتجه نحو علم الوراثة". مجلة ساينس . 319 (5869): 1478-1479 . doi : 10.1126/science.319.5869.1478 . PMID 18339916. S2CID 36945291 .  
  44. ↑ تومار ر (2010). المؤشرات الجزيئية والتكنولوجيا الحيوية النباتية . بيتمان بورا، نيودلهي: وكالة النشر الهندية الجديدة. ص 188. ISBN  978-93-80235-25-7.
  45. 1 2 3 كاي إتش واي، كاسويل جيه إل، بريسكوت جيه إف (مارس 2014). "التقنيات الجزيئية غير القائمة على الاستنبات لتشخيص الأمراض البكتيرية في الحيوانات: منظور مختبري تشخيصي" . علم الأمراض البيطرية . 51 (2): 341-350 . doi : 10.1177/0300985813511132 . PMID 24569613 . 
  46. ↑ ساليس، أ. د. (2009). "التطبيقات في علم الأحياء الدقيقة السريري". تفاعل البوليميراز المتسلسل في الوقت الحقيقي: التقنيات والتطبيقات الحالية . دار كايستر الأكاديمية للنشر. رقم ISBN 978-1-904455-39-4.
  47. ↑ كوك إس، ماك دي إتش، موليس كيه بي، بويز بي، إيرليخ جي، بلير دي، وآخرون . (مايو 1987). "تحديد تسلسلات فيروس نقص المناعة البشرية باستخدام التضخيم الإنزيمي في المختبر والكشف عن انقسام الأوليغومر" . مجلة علم الفيروسات . 61 (5): 1690-1694 . doi : 10.1128/jvi.61.5.1690-1694.1987 . PMC 254157. PMID 2437321 .   
  48. ↑ "فيروس كورونا: اختبار السفر" . المعهد العالي للصحة .
  49. ↑ فينغر إتش، فون كونيغ سي إتش (1996). بارون إس (محرر). علم الأحياء الدقيقة الطبية ( الطبعة الرابعة). غالفستون، تكساس: الفرع الطبي لجامعة تكساس في غالفستون. ISBN  978-0-9631172-1-2PMID 21413270​​ 
  50. ↑ يه إس إتش، مينك سي إم (2012). "بوردتيلا الشاهوقية والسعال الديكي". أمراض نيتير المعدية . ص 11-14 . doi : 10.1016/B978-1-4377-0126-5.00003-3 . ISBN  978-1-4377-0126-5.
  51. ↑ ألونسو أ، مارتن ب، ألبيران س، غارسيا ب، غارسيا أ، دي سيمون ل ف، وآخرون . (يناير 2004). "تصاميم تفاعل البوليميراز المتسلسل في الوقت الحقيقي لتقدير عدد نسخ الحمض النووي النووي والميتوكوندري في دراسات الطب الشرعي والحمض النووي القديم". مجلة العلوم الجنائية الدولية . 139 ( 2-3 ): 141-149 . doi : 10.1016/j.forsciint.2003.10.008 . PMID 15040907 .  
  52. ↑ بونكه م، أرنهايم ن، لي هـ، كولينز ف س (يوليو 1989). "الرسم الجيني الدقيق للكروموسومات البشرية باستخدام تفاعل البوليميراز المتسلسل على حيوان منوي واحد: اعتبارات التصميم التجريبي" . المجلة الأمريكية لعلم الوراثة البشرية . 45 (1): 21-32 . PMC 1683385. PMID 2568090 .  
  53. ↑ غاريبان إل، أفاشيا ن (2013). " تقنيات بحثية مبسطة: تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR)" . مجلة الأمراض الجلدية الاستقصائية . 133 (3): 1-4 . doi : 10.1038/jid.2013.1 . PMC 4102308. PMID 23399825 .  
  54. ↑ تشوانغ إل واي، تشنغ واي إتش، يانغ سي إتش (2013). "تصميم بادئات محددة لتفاعل البوليميراز المتسلسل". رسائل التكنولوجيا الحيوية . 35 (10): 1541-1549 . doi : 10.1007/s10529-013-1249-8 . PMID 23794048 . 
  55. ↑ كايتانو-أنوليس، جي، وبرانت، جيه بي، وبيتر، إم جي (1991). "بصمة تضخيم الحمض النووي باستخدام بادئات قليلة النوكليوتيدات قصيرة جدًا وعشوائية" . مجلة نيتشر للتكنولوجيا الحيوية . 9 (6): 553-557 . doi : 10.1038/nbt0691-553 . ISSN 1087-0156 . PMID 1367225 .  
  56. ↑ ويليامز، جي جي، كوبيليك، إيه آر، ليفاك، كيه جيه، رافالسكي، جيه، تينجي، إس في (1990). " تعدد أشكال الحمض النووي المُضخّم بواسطة بادئات عشوائية مفيد كعلامات وراثية" . مجلة أبحاث الأحماض النووية . 18 (22): 6531-6535 . doi : 10.1093/nar/18.22.6531 . ISSN 0305-1048 . PMC 332606. PMID 1979162 .   
  57. ↑ تشو واي إتش، تشانغ إكس بي، إبرايت آر إتش (نوفمبر 1991). "الطفرات العشوائية لجزيئات الحمض النووي بحجم الجين باستخدام تفاعل البوليميراز المتسلسل مع بوليميراز الحمض النووي Taq" . أبحاث الأحماض النووية . 19 (21): 6052. doi : 10.1093/nar/19.21.6052 . PMC 329070. PMID 1658751 .  
  58. ↑ ستورسبرغ إس (2021). "إنشاء مختبر تفاعل البوليميراز المتسلسل من الصفر" . إنتغرا للعلوم الحيوية .
  59. ↑ كريستيان نيروب ألبرز، أندرس جنسن، جاكوب بايلوم، كارستن سور جاكوبسن (20 نوفمبر 2012). "تثبيط بوليميرازات الحمض النووي المستخدمة في تفاعل البوليميراز المتسلسل الكمي بواسطة مواد دبالية مشتقة من التربة ذات بنية مختلفة". مجلة علم الأحياء الدقيقة الجينية . 30 (8): 675. doi : 10.1080/01490451.2012.758193 .
  60. ↑ بولدوك، بي كي، وآخرون (مارس 2020). "استراتيجية تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR) لنظام تضخيم الطفرات المقاومة للكشف عن المتغيرات المسببة للأمراض في جين MT-TL1 في مستودعات المرضى". الاختبارات الجينية والمؤشرات الحيوية الجزيئية . 24 (3): 165-170 . doi : 10.1089/gtmb.2019.0079 . PMID 32167396. S2CID 212693790 .   
  61. ↑ نيوتن سي آر، غراهام إيه، هيبتستال إل إي، باول إس جيه، سامرز سي، كالشيكر إن، وآخرون (أبريل 1989). "تحليل أي طفرة نقطية في الحمض النووي. نظام الطفرات المقاومة للتضخيم (ARMS)" . مجلة أبحاث الأحماض النووية . 17 (7): 2503-2516 . doi : 10.1093 / nar/17.7.2503 . PMC 317639. PMID 2785681 .   
  62. ↑ ستيمر دبليو بي، كراميري إيه، ها كيه دي، برينان تي إم، هاينيكر إتش إل (أكتوبر 1995). "تجميع جين وبلازميد كامل في خطوة واحدة من أعداد كبيرة من قليل النيوكليوتيدات منزوعة الأكسجين". جين . 164 (1): 49-53 . doi : 10.1016/0378-1119(95)00511-4 . PMID 7590320 . 
  63. ↑ إينيس، إم. أ.، ميامبو، ك. ب.، جيلفاند، د. هـ.، براو، إم. أ. (ديسمبر 1988). "تسلسل الحمض النووي باستخدام بوليميراز الحمض النووي من بكتيريا ثيرموس أكواتيكوس والتسلسل المباشر للحمض النووي المُضخّم بواسطة تفاعل البوليميراز المتسلسل" . وقائع الأكاديمية الوطنية للعلوم في الولايات المتحدة الأمريكية . 85 (24): 9436-40 . Bibcode : 1988PNAS...85.9436I . doi : 10.1073/pnas.85.24.9436 . PMC 282767. PMID 3200828 .  
  64. ↑ بيرس كي إي، وانغ إل جيه (2007). "تفاعل البوليميراز المتسلسل الخطي بعد الأسي والتقنيات ذات الصلة". تشخيص الخلايا المفردة . طرق في الطب الجزيئي. المجلد 132. الصفحات 65-85 . doi : 10.1007/978-1-59745-298-4_7 . ISBN   978-1-58829-578-1PMID 17876077​​ 
  65. ↑ كريشنان م ، أوجاز ف م، بيرنز م أ (أكتوبر 2002). "تفاعل البوليميراز المتسلسل في خلية رايلي-بينارد الحرارية". مجلة ساينس . 298 (5594): 793. رمز Bibcode : 2002Sci...298..793K . doi : 10.1126/science.298.5594.793 . PMID 12399582 . 
  66. ↑ بريي أ، حسن ي أ، أوجاز ف م (نوفمبر 2013). "الحمل الفوضوي على المستوى الميكروسكوبي يُمكّن من تضاعف الحمض النووي الريبوزي منقوص الأكسجين (DNA) بالحمل الحراري القوي". الكيمياء التحليلية . 85 (21): 10536-41 . Bibcode : 2013AnaCh..8510536P . doi : 10.1021/ac402611s . PMID 24083802 . 
  67. ↑ شوارتز جيه جيه، لي سي، شندور جيه (سبتمبر 2012). "تخليق الجينات بدقة باستخدام استرجاع جزيئات الحمض النووي المُتحقق من تسلسلها والموجه بالعلامات" . نيتشر ميثودز . 9 (9): 913-15 . doi : 10.1038/nmeth.2137 . PMC 3433648. PMID 22886093 .  
  68. ↑ فينسنت م، شو ي، كونغ هـ (أغسطس 2004). " تضخيم الحمض النووي متساوي الحرارة المعتمد على الهيليكاز" . تقارير EMBO . 5 (8): 795-800 . doi : 10.1038/sj.embor.7400200 . PMC 1249482. PMID 15247927 .  
  69. ↑ تشو كيو، راسل إم، بيرش دي إي، ريموند جيه، بلوخ دبليو (أبريل 1992). "تحسين تضخيم الحمض النووي ذي العدد المنخفض من النسخ عن طريق منع التضخيم الخاطئ قبل تفاعل البوليميراز المتسلسل وتكوين ثنائيات البادئات" . مجلة أبحاث الأحماض النووية . 20 (7): 1717-23 . doi : 10.1093/nar/20.7.1717 . PMC 312262. PMID 1579465 .  
  70. ↑ كيلوج دي إي، ريبالكين آي، تشين إس، موخاميدوفا إن، فلاسيك تي، سيبرت بي دي، وآخرون (يونيو 1994). "الأجسام المضادة لتقنية TaqStart: تفاعل البوليميراز المتسلسل "البدء الساخن" المُيسَّر بواسطة جسم مضاد أحادي النسيلة مُعادِل مُوجَّه ضد بوليميراز الحمض النووي Taq". BioTechniques . 16 (6): 1134–37 . PMID 8074881 .  
  71. ↑ سان ميلان، آر إم، مارتينيز-باليستيروس، آي، ريمينتيريا، إيه، غارايزار، جيه، بيكاندي، جيه (ديسمبر 2013). "تمرين عبر الإنترنت لتصميم ومحاكاة تجارب تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR) وتفاعل البوليميراز المتسلسل مع تحليل تعدد أطوال قطع التقييد (PCR-RFLP)" . مجلة BMC Research Notes ، 6، 513. doi : 10.1186/1756-0500-6-513 . PMC 4029544. PMID 24314313 .  
  72. ↑ زيتكيفيتش إي، رافالسكي أ، لابودا د (مارس 1994). "بصمة الجينوم باستخدام تضخيم تفاعل البوليميراز المتسلسل المرتبط بتكرار التسلسل البسيط (SSR)". علم الجينوم . 20 (2): 176-183 . doi : 10.1006/geno.1994.1151 . PMID 8020964. S2CID 41802285 .  
  73. ↑ أوشمان هـ، جيربر أ.س ، هارتل د.ل (نوفمبر 1988). "التطبيقات الجينية لتفاعل البوليميراز المتسلسل العكسي" . علم الوراثة . 120 (3): 621-23 . doi : 10.1093/genetics/120.3.621 . PMC 1203539. PMID 2852134 .  
  74. ↑ مولر، بي آر، وولد، بي (نوفمبر 1989). "تحديد موقع مُحسِّن خاص بالعضلات في الجسم الحي باستخدام تفاعل البوليميراز المتسلسل المُعتمد على الربط". مجلة ساينس . 246 (4931): 780-86 . رمز Bibcode : 1989Sci...246..780M . doi : 10.1126/science.2814500 . PMID 2814500 . 
  75. ↑ هيرمان، جي جي ، غراف، جي آر، ميوهانين، إس، نيلكين، بي دي، بايلين، إس بي (سبتمبر 1996). "تفاعل البوليميراز المتسلسل الخاص بالمثيلة: فحص جديد لتفاعل البوليميراز المتسلسل لحالة مثيلة جزر CpG" . وقائع الأكاديمية الوطنية للعلوم في الولايات المتحدة الأمريكية . 93 (18): 9821-26 . Bibcode : 1996PNAS...93.9821H . doi : 10.1073/ pnas.93.18.9821 . PMC 38513. PMID 8790415 .  
  76. ↑ إيزنبارجر، تي. أ.، فيني، م.، ريوس-فيلازكيز، س.، هاندلسمان، ج.، روفكون، ج. (فبراير 2008). "تفاعل البوليميراز المتسلسل باستخدام البادئات المصغرة، عدسة جديدة لرؤية العالم الميكروبي" . علم الأحياء الدقيقة التطبيقي والبيئي . 74 (3): 840-849 . Bibcode : 2008ApEnM..74..840I . doi : 10.1128/AEM.01933-07 . PMC 2227730. PMID 18083877 .  
  77. ↑ شين سي، يانغ دبليو، جي كيو، ماكي إتش، دونغ إيه، تشانغ زد (نوفمبر 2009). "ملاحظة حول تفاعل البوليميراز المتسلسل النانوي: مستويات مختلفة من دقة تضاعف الحمض النووي في تفاعلات البوليميراز المتسلسل المعززة بالجسيمات النانوية". تقنية النانو . 20 (45) 455103. Bibcode : 2009Nanot..20S5103S . doi : 10.1088/0957-4484/20/45/455103 . PMID 19822925. S2CID 3393115 .  
  78. ↑ شين سي (2013). "نظرة عامة على تقنية تفاعل البوليميراز المتسلسل بمساعدة الجسيمات النانوية". التكنولوجيا الحيوية النانوية . الولايات المتحدة: وايلي-بلاك ويل للنشر المحدودة. ص 97-106 . doi : 10.1002/9781118451915.ch5 . ISBN  978-1-118-45191-5.
  79. ↑ هورتون آر إم، هانت إتش دي، هو إس إن، بولين جيه كيه، بيس إل آر (أبريل 1989). "هندسة الجينات الهجينة دون استخدام إنزيمات التقييد: وصل الجينات عن طريق تمديد التداخل". جين . 77 (1): 61-68 . doi : 10.1016/0378-1119(89)90359-4 . PMID 2744488 . 
  80. ↑ مولر، س. (2006). تفاعل البوليميراز المتسلسل: الأساسيات . الولايات المتحدة: مجموعة تايلور وفرانسيس. ص 144. ISBN  978-0-415-35547-6.
  81. ^ ديفيد إف، تورلوت إي (نوفمبر 1998). "[طريقة تضخيم الجينات متساوي الحرارة]" [ طريقة تضخيم متساوي الحرارة ] . Comptes Rendus de l'Académie des Sciences، Série III . 321 (11): 909– 14. بيب كود : 1998CRASG.321..909D . دوى : 10.1016/S0764-4469(99)80005-5 . بميد 9879470 . 
  82. ^ فابريس ديفيد (سبتمبر-أكتوبر 2002). "استخدام الخصائص الطوبولوجية لـ ADN: سلاح جديد لمكافحة العوامل المسببة للأمراض" (PDF) . الانصهار. مؤرشفة من الأصلي (PDF) في 28 نوفمبر 2007 . تم الاسترجاع في 12 أغسطس 2007 .(بالفرنسية)
  83. ↑ يانغ جيه واي، بروكس إس، ماير جيه إيه، بليكيسلي آر آر، زيلازني إيه إم، سيغري جيه إيه، وآخرون (2013). " Pan-PCR، طريقة حسابية لتصميم فحوصات تصنيف البكتيريا بناءً على بيانات تسلسل الجينوم الكامل" . مجلة علم الأحياء الدقيقة السريرية . 51 (3): 752-758 . doi : 10.1128/jcm.02671-12 . PMC 3592046. PMID 23254127 .   
  84. ↑ دوبوسي جيه آر، روز إس دي، بيلتز كيه آر، روب إس إم، باورز كيه إم، بهلكي إم إيه، وآخرون . (أغسطس 2011). "تفاعل البوليميراز المتسلسل المعتمد على إنزيم RNase H (rhPCR): تحسين الخصوصية والكشف عن تعدد أشكال النوكليوتيدات المفردة باستخدام بادئات قابلة للانقسام محجوبة" . مجلة BMC للتكنولوجيا الحيوية . 11 80. doi : 10.1186/1472-6750-11-80 . PMC 3224242. PMID 21831278 .   
  85. ↑ شيامالا، ف.، وفيرو-لوزي أميس، ج. (1993). "تفاعل البوليميراز المتسلسل باستخدام بادئ واحد محدد (SSP-PCR) وتتبع الجينوم". بروتوكولات تفاعل البوليميراز المتسلسل . طرق في البيولوجيا الجزيئية. المجلد 15. الصفحات 339-348 . doi : 10.1385/0-89603-244-2:339 . ISBN   978-0-89603-244-6PMID 21400290​​ 
  86. ↑ بينغ دي إتش، بولز سي، رحمان إف إن، عودة إم، بلمارش إم، كيلي بي، وآخرون (1996). "تضخيم الجسر: نظام تفاعل البوليميراز المتسلسل ذو الطور الصلب لتضخيم وكشف الاختلافات الأليلية في الجينات أحادية النسخة" . وقائع مؤتمر الهوية الجينية، الندوة الدولية السابعة حول تحديد الهوية البشرية . مؤرشف من الأصل في 7 مايو 2001. 
  87. ↑ خان ز، بوتر ك، بارك دي جيه (أبريل 2008). "تحسين تفاعل البوليميراز المتسلسل على الطور الصلب: آليات لزيادة التنشيط باستخدام بادئات الدعم الصلب". الكيمياء الحيوية التحليلية . 375 (2): 391-393 . doi : 10.1016/j.ab.2008.01.021 . PMID 18267099 . 
  88. ↑ راؤول د، عبودهارم ج، كروبيزي إ، لاروي ج، لوديس ب، درانكور م (نوفمبر 2000). "التعرف الجزيئي على يرسينيا الطاعونية كعامل مسبب للموت الأسود في العصور الوسطى باستخدام تفاعل البوليميراز المتسلسل الانتحاري" . وقائع الأكاديمية الوطنية للعلوم في الولايات المتحدة الأمريكية . 97 (23): 12800-12803 . Bibcode : 2000PNAS...9712800R . doi : 10.1073/ pnas.220225197 . PMC 18844. PMID 11058154 .  
  89. ↑ ليو واي جي، ويتير آر إف (فبراير 1995). "تفاعل البوليميراز المتسلسل المتداخل غير المتماثل الحراري: التضخيم والتسلسل الآلي لقطع نهاية الإدخال من مستنسخات P1 وYAC لتتبع الكروموسوم". علم الجينوم . 25 (3): 674-81 . doi : 10.1016/0888-7543(95)80010-J . PMID 7759102 . 
  90. ↑ دون آر إتش، كوكس بي تي، واينرايت بي جيه، بيكر كيه، ماتيك جيه إس (يوليو 1991). ""تقنية تفاعل البوليميراز المتسلسل 'Touchdown' لتجنب التنشيط غير المقصود أثناء تضخيم الجينات" . مجلة أبحاث الأحماض النووية . 19 (14): 4008. doi : 10.1093/nar/19.14.4008 . PMC 328507. PMID 1861999 .  
  91. ↑ أندروفيتش ب، فاليهراش ل، إيلينغ ج، سيوباك ر، كوبيستا م (6 سبتمبر 2017). "تقنية RT-qPCR ثنائية الذيل: طريقة جديدة لتحديد كمية miRNA بدقة عالية" . مجلة أبحاث الأحماض النووية . 45 (15): e144. doi : 10.1093/nar/gkx588 . ISSN 0305-1048 . PMC 5587787. PMID 28911110 .   
  92. ↑ مايريك كيه في، جيلبارت دبليو إم (فبراير 2002). "المشي السريع الشامل لتحديد التسلسل المجاور بشكل مباشر ومتعدد الاستخدامات". جين . 284 ( 1-2 ): 125-131 . doi : 10.1016/S0378-1119(02)00384-0 . PMID 11891053 . 
  93. ↑ "النص الكامل – LaNe RAGE: أداة جديدة لتحديد تسلسل الحمض النووي الجينومي المحيط" . www.ejbiotechnology.info . مؤرشف من الأصل بتاريخ 16 مايو 2008. تم الاطلاع عليه بتاريخ 24 أبريل 2008 .
  94. ↑ بارك دي جيه (يناير 2005). "تحديد إكسون جديد في الطرف 5' لجين GAPDH الفأري باستخدام تقنية 5'RACE LaNe". التكنولوجيا الحيوية الجزيئية . 29 (1): 39-46 . doi : 10.1385/MB:29:1: 39 . PMID 15668518. S2CID 45702164 .  
  95. ↑ بارك دي جيه (أبريل 2004). "3' RACE LaNe: طريقة تفاعل البوليميراز المتسلسل المتداخلة بالكامل، بسيطة وسريعة، لتحديد تسلسل الحمض النووي المكمل الطرفي 3'" . BioTechniques . 36 (4): 586-88 ، 590. doi : 10.2144/04364BM04 . PMID 15088375 . 
  96. ↑ «المكون الرئيسي في اختبارات فيروس كورونا يأتي من بحيرات يلوستون» . مجلة ساينس . 31 مارس 2020. مؤرشف من الأصل في 31 مارس 2020. تم الاطلاع عليه في 13 مايو 2020 .
  97. ↑ كليبي ك، أوتسوكا إي، كليبي ر، مولينو إي، خورانا إتش جي (مارس 1971). "دراسات على عديدات النوكليوتيدات. 96. تضاعفات إصلاح الحمض النووي الاصطناعي القصير المحفزة بواسطة بوليميرازات الحمض النووي". مجلة البيولوجيا الجزيئية . 56 (2): 341-361 . doi : 10.1016/0022-2836(71)90469-4 . PMID 4927950 . 
  98. ↑ رابينو، ب. (1996). صناعة تفاعل البوليميراز المتسلسل: قصة التكنولوجيا الحيوية . شيكاغو: مطبعة جامعة شيكاغو. رقم ISBN 978-0-226-70146-2.
  99. ↑ موليس ك (1998). الرقص عارياً في حقل العقل . نيويورك: بانثيون بوكس. ISBN 978-0-679-44255-4.
  100. ↑ موليس، ك.ب. (أبريل 1990). "الأصل غير المألوف لتفاعل البوليميراز المتسلسل". مجلة ساينتفك أمريكان . 262 (4): 56-61 ، 64-65 . Bibcode : 1990SciAm.262d..56M . doi : 10.1038/scientificamerican0490-56 . PMID 2315679 . 
  101. ↑ باتيدار م، أغراوال س، بارفين ف، خاري ب (2015). "رؤى جزيئية للعاب في حل نزاعات إثبات النسب" . مجلة علوم طب الأسنان الشرعي . 7 (1): 76-79 . doi : 10.4103/0975-1475.150325 . PMC 4330625. PMID 25709326 .  
  102. ↑ نيكولز د، باركر إي (2016). " المؤثرات العقلية" . مراجعات علم الأدوية . 68 (2): 264-355 . doi : 10.1124/pr.115.011478 . PMC 4813425. PMID 26841800 .  
  103. ↑ "جائزة نوبل في الكيمياء 1993" . NobelPrize.org .
  104. ↑ "شهادات تقدير للفائزين بجوائز الإنجازات الكيميائية لعام 2017" . قسم تاريخ الكيمياء . تم الاطلاع عليه بتاريخ 12 مارس 2018 .
  105. ↑ "مضاف حديثًا" .
  106. ↑ فور جيه جونيور، ويشرز آي آر، كوك-ديغان آر (3 يوليو 2006). "تأثيرات الممارسات التجارية والترخيص والملكية الفكرية على تطوير ونشر تفاعل البوليميراز المتسلسل: دراسة حالة" . مجلة الاكتشاف والتعاون الطبي الحيوي . 1 : 7. doi : 10.1186/1747-5333-1-7 . PMC 1523369. PMID 16817955 .  
  107. ↑ "نصائح حول كيفية النجاة من حروب Taq" . أخبار الهندسة الوراثية GEN - قناة الأعمال الحيوية . 26 (9). 1 مايو 2006. مؤرشف من الأصل في 26 مارس 2020. تم الاطلاع عليه في 24 أبريل 2019 .