النيتروجين القابل للاستيعاب بواسطة الخميرة

من بين النيتروجين الأميني الحر (FAN) الذي يُكوّن النيتروجين الأميني المتاح للخميرة (YAN)، تُعدّ الأحماض الأمينية الأرجينين والبرولين والجلوتامين الأكثر وفرة، تليها الألانين والثريونين والسيرين وحمض الأسبارتيك بتراكيز أقل بكثير [ 1 ] ، ^{على الرغم من} إمكانية العثور على كميات ضئيلة من معظم الأحماض الأمينية المعروفة في عصير العنب. ^{[ 2 ]} عادةً ما يكون البرولين هو الأكثر تركيزًا، وقد يُمثّل ما يصل إلى 30% من إجمالي كمية الأحماض الأمينية. ^{[ 4 ]} تختلف الكمية الدقيقة للنيتروجين الأميني الحر، وقد تتراوح بين 22 و1242 ملغ من النيتروجين/لتر من النيتروجين الأميني المتاح للخميرة، والمُستمدة من الأحماض الأمينية الحرة. ^{[ 5 ]} 

بينما تُستهلك الأرجينين والجلوتامين والأحماض الأمينية الأخرى بسرعة، غالبًا في المراحل المبكرة من التخمر، لا تستهلك الخميرة البرولين إطلاقًا خلال الظروف اللاهوائية الطبيعية للتخمر. ويعود ذلك إلى أن أحد الإنزيمات اللازمة لاستخدامه هو الأكسيداز ( الذي يتطلب الأكسجين الجزيئي)، بينما يُثبط الإنزيم الآخر بوجود الأمونيوم (مصدر آخر للنيتروجين القابل للاستيعاب الذي تحتاجه الخميرة) في العصير. مع ذلك، فإن بادئات التخمر جيدة التهوية التي تحتوي على عصير لم يُضَف إليه فوسفات ثنائي الأمونيوم، عادةً ما تشهد استهلاكًا للبرولين قبل بدء الظروف اللاهوائية للتخمر. ^{[ 1 ]} عند قياس نيتروجين الأمونيوم الحر (FAN)، يجب على صانعي النبيذ الانتباه إلى ما إذا كان تحليلهم يشمل البرولين، لأن ذلك سيرفع قياس نيتروجين الأمونيوم القابل للاستيعاب (YAN). يُعرف عن عنب شاردونيه وكابيرنيه ساوفيجنون، وهما نوعان من العنب الأوروبي (Vitis vinifera) ، احتوائهما على مستويات عالية جدًا من البرولين، بينما يحتوي عنب ريسلينج وسوفيجنون بلان عادةً على مستويات منخفضة جدًا. ^{[ 4 ]}

تنقل الخميرة الأحماض الأمينية والببتيدات الصغيرة (أقل من 5 أحماض أمينية ) إلى داخل الخلية عبر عملية نقل نشطة تستخدم بروتينات غشائية متخصصة ، وتستفيد من فرق درجة الحموضة بين محلول النبيذ الحمضي (درجة حموضة تتراوح بين 3 و4) ودرجة الحموضة شبه المتعادلة للسيتوبلازم داخل خلايا الخميرة. تستقبل بروتينات النقل المتزامن للبروتونات في الغشاء الحمض الأميني مصحوبًا بأيون هيدروجين، والذي يُطرد لاحقًا من الخلية عبر مضخة أيونات الهيدروجين . هذه العملية تعتمد على الطاقة، وتصبح أكثر استهلاكًا للطاقة بالنسبة لخلية الخميرة مع تقدم التخمر وارتفاع مستويات الإيثانول، مما يؤدي إلى "تسرب سلبي" لأيونات الهيدروجين الزائدة إلى داخل الخلية. تضطر مضخات أيونات الهيدروجين في الخلية إلى العمل بجهد أكبر للحفاظ على درجة الحموضة الداخلية، فترسل إشارة إلى بروتينات النقل المتزامن للتوقف عن جلب الأيونات الأخرى. هذا أحد أسباب قلة فعالية إضافة النيتروجين في المراحل المتأخرة من التخمر، أو انعدامها، حيث تتوقف آليات نقل النيتروجين إلى داخل الخلية. ^{[ 4 ]}

خلال عملية التخمير، يُعدّ الأمونيوم الشكل الأساسي للنيتروجين القابل للاستيعاب والمتاح للخميرة. ^{[ 1 ]} ومع ذلك، قد يحتوي العصير عند عصره على ما بين 0 و150  ملغم/لتر من أملاح الأمونيوم، وذلك تبعًا لكمية النيتروجين التي تلقتها الكرمة في الكرم. ^{[ 4 ]}

في الخلية، يتم تثبيت الأمونيا غير العضوية وأيونات الأمونيوم من خلال سلسلة من التفاعلات الكيميائية التي تُنتج في النهاية مصدر النيتروجين العضوي، وهو الغلوتامات. ^{[ 2 ]} كما يعمل أيون الأمونيوم كمنظم ألوستيري لأحد الإنزيمات المستخدمة في عملية تحلل الجلوكوز ، وقد يؤثر أيضًا على كيفية نقل خلية الخميرة للجلوكوز والفركتوز إلى داخلها. ^{[ 4 ]} وقد تبين أن البروتينات المستخدمة في نظام نقل الجلوكوز الرئيسي لها عمر نصف يبلغ 12 ساعة. في الدراسات التي عرّضت خلايا الخميرة لـ"نقص الأمونيا"، توقف النظام بأكمله بعد 50 ساعة، مما يُقدم دليلًا قويًا على أن نقص الأمونيا/الأمونيوم قد يزيد من خطر توقف عملية التخمر. ^{[ 3 ]}

يوجد الجلوتاثيون (GSH: L-gamma-glutamyl-L-cysteinylglycine) بتراكيز عالية تصل إلى 10 ملي مولار في خلايا الخميرة. ويلعب دورًا محوريًا في الاستجابة لنقص الكبريت والنيتروجين. ^{[ 6 ]}

لا تستخدم البكتيريا مثل أسيتوباكتر وبكتيريا حمض اللاكتيك المستخدمة في التخمر المالولاكتيكي الأمونيا . ^{[ 2 ]}

تعتمد كمية النيتروجين المتاح للخميرة (YAN) المطلوبة على أهداف صانع النبيذ من التخمير، وخاصةً ما إذا كان التخمير الطبيعي مرغوبًا فيه أم أن النبيذ سيخضع للتخمير الكامل حتى الجفاف. تؤثر حالة العنب وظروف التخمير على كمية النيتروجين المطلوبة. عادةً ما تكون الثمار التالفة أو المتعفنة أو المصابة بالعفن الرمادي (البوتريتيس) أقل غنىً بالنيتروجين (وكذلك الفيتامينات الأخرى) عند وصولها من الكرم مقارنةً بالعنب السليم. يمكن أن يتفاقم هذا النقص بسبب التصفية المفرطة للعصير وارتفاع نسبة السكر فيه. تميل أنواع النبيذ المخمرة في درجات حرارة أعلى إلى التقدم بمعدل أسرع، مما يتطلب كمية أكبر من النيتروجين مقارنةً بالتخمير الأطول والأكثر برودة. كما تؤثر كمية الأكسجين المُعرَّض له على معدل امتصاص الخميرة للنيتروجين، حيث يتطلب النبيذ المخمر في ظروف لاهوائية كاملة (مثل العديد من أنواع النبيذ الأبيض في خزانات الفولاذ المقاوم للصدأ) كمية أقل من النيتروجين مقارنةً بالنبيذ المخمر في البراميل أو خزانات التخمير المفتوحة. ^{[ 7 ]}

يتراوح النطاق المقترح من قبل خبراء صناعة النبيذ بين 150  ملغم/لتر من النيتروجين المتاح للخميرة ^{[ 8 ]} و400  ملغم من النيتروجين لكل لتر. ^{[ 9 ]} وقد أظهرت بعض الدراسات أن أقصى معدلات التخمر يمكن تحقيقها باستخدام النيتروجين المتاح للخميرة في  نطاق 400 إلى 500 ملغم نيتروجين/لتر. ^{[ 10 ]} ومع ذلك، لا يرغب جميع صانعي النبيذ في أن يكون التخمر بأقصى سرعة (من حيث كتلة الخميرة الحيوية ودرجة الحرارة والسرعة) نظرًا لتأثير ذلك على الجوانب الحسية الأخرى للنبيذ، مثل تطور الرائحة واحتفاظه بنكهة الفاكهة. ^{[ 3 ]}

أظهرت دراسة أجرتها كلية زراعة العنب وصناعة النبيذ بجامعة كاليفورنيا في ديفيس أنه يمكن وضع توصيات بشأن مستويات النيتروجين المثلى لإتمام عملية تخمير ناجحة بناءً على مستوى بريكس عند الحصاد ، وهو المستوى الذي اعتمده العديد من مصنعي الخميرة والمغذيات. ^{[ 11 ] [ 12 ]}

• 21°Bx = 200  ملغ نيتروجين/لتر
• 23°Bx = 250  ملغم نيتروجين/لتر
• 25°Bx = 300  ملغم نيتروجين/لتر
• 27°Bx = 350  ملغم نيتروجين/لتر

ومع ذلك، أظهرت دراسات أخرى إمكانية إجراء عملية التخمير بنجاح مع مستويات النيتروجين المتاح للخميرة (YAN) أقل من هذه التوصيات، فضلاً عن حدوث عمليات تخمير بطيئة/متوقفة حتى عندما تكون مستويات النيتروجين المتاح للخميرة متوافقة مع التوصيات. ^{[ 1 ]}

مثل الخميرة، تحتاج بكتيريا حمض اللاكتيك المستخدمة في التخمر المالولاكتيكي (عادةً Oenococcus oeni ) إلى النيتروجين. مع ذلك، وعلى عكس الخميرة S. cerevisiae، لا تستطيع بكتيريا حمض اللاكتيك استخدام الأمونيا، وبالتالي فإن إضافات مثل فوسفات ثنائي الأمونيوم (DAP) لا تُقدم أي فوائد غذائية. يُخاطر صانعو النبيذ الذين يستخدمون فوسفات ثنائي الأمونيوم عن غير قصد كمادة مغذية لتلقيح التخمر المالولاكتيكي بتوفير العناصر الغذائية للكائنات الحية المُفسدة مثل Brettanomyces . ^{[ 2 ]}

بينما يقوم بعض صانعي النبيذ بتلقيح بكتيريا حمض اللاكتيك لديهم بمغذيات تشمل النيتروجين، فإن معظم المغذيات اللازمة للتخمر المالولاكتيكي تأتي من تحلل (أو تحلل ذاتي ) خلايا الخميرة الميتة. إضافةً إلى ذلك، تتمتع معظم البكتيريا المستخدمة في التخمر المالولاكتيكي بالقدرة على إنتاج إنزيمات بروتياز خارج الخلية، والتي يمكنها أيضًا تحليل سلاسل الببتيدات الكبيرة إلى بقايا الأحماض الأمينية الأساسية التي يمكن استخدامها بعد ذلك في عمليات الأيض. ^{[ 4 ]}

تحفز مكملات النيتروجين، وخاصةً فوسفات ثنائي الأمونيوم (DAP)، تكاثر الخميرة، مما قد يزيد الكتلة الحيوية بشكل كبير. قد يؤدي ذلك إلى تسريع عملية التخمير أكثر مما يرغب فيه صانع النبيذ، كما سيرفع درجة حرارة التخمير نتيجةً للحرارة المتولدة من الخميرة. كذلك، قد تُسبب الكتلة الحيوية الزائدة نقصًا في العناصر الغذائية الأخرى للخميرة، مثل الفيتامينات والستيرولات، نتيجةً لزيادة التنافس، مما قد يؤدي إلى ظهور روائح كريهة (مثل كبريتيد الهيدروجين) وحتى توقف عملية التخمير. ^{[ 1 ]}

قد تؤدي المستويات المرتفعة من حمض الأرجينين الأميني (أكثر من 400  ملغم/لتر)، خاصةً قرب نهاية عملية التخمر، إلى زيادة إنتاج إيثيل كاربامات. ويعود ذلك إلى تحلل الأرجينين إلى يوريا، التي يمكن إعادة امتصاصها واستخدامها بواسطة الخميرة أو استقلابها إلى أمونيا. مع ذلك، تتفاعل اليوريا أيضًا مع الإيثانول إذا لم يتم استقلابها بالكامل، وهو ما قد يؤدي، مع التعرض طويل الأمد (وكذلك درجات الحرارة المرتفعة)، إلى إنتاج إستر إيثيل كاربامات. ^{[ 1 ]}

مع ذلك، يكمن الخطر الأكبر للإفراط في إضافة العناصر الغذائية إلى العصير في بقاء كميات زائدة من النيتروجين والمغذيات الأخرى بعد اكتمال عملية التخمير. وهذا قد يُسبب عدم استقرار ميكروبي، إذ يمكن للكائنات الحية المُفسدة أن تستغل هذه المغذيات الزائدة. ^{[ 3 ]}

في الولايات المتحدة، يحدد مكتب الضرائب والتجارة للكحول والتبغ (TTB) استخدام فوسفات ثنائي الأمونيوم كمادة مضافة للنيتروجين بـ 968  ملغم/لتر (8  أرطال/1000 غالون)، مما يوفر 203  ملغم نيتروجين/لتر من النيتروجين المتاح للزراعة. أما في الاتحاد الأوروبي ، فتتبع معظم الدول إرشادات المنظمة الدولية للكرمة والنبيذ (OIV) التي تحدد حدًا أقصى قدره 300  ملغم/لتر. وفي أستراليا ، يعتمد الحد الأقصى على مستوى الفوسفات غير العضوي ، حيث يُسمح بحد أقصى قدره 400  ملغم/لتر من الفوسفات. ^{[ 2 ]}

بما أن معظم المكملات الغذائية تغذي جميع الكائنات الحية الدقيقة الموجودة في العصير (سواء كان ذلك مرغوبًا أم لا)، فإن صانعي النبيذ غالبًا ما ينتظرون قبل إضافة هذه العناصر الغذائية حتى يصبحوا مستعدين لتلقيح العصير بسلالة الخميرة Saccharomyces cerevisiae التي يرغبون بها . وقد ينتظر المنتجون الذين يستخدمون التخمير الطبيعي أيضًا حتى تقضي إضافة ثاني أكسيد الكبريت على الميكروبات غير المرغوب فيها، أو قد يطعمون العصير مبكرًا لأنهم يرغبون في التعقيد المحتمل الذي قد تضيفه الميكروبات الأخرى إلى النبيذ. وعند إضافته، يكون النيتروجين عادةً على شكل أحماض أمينية، ممزوجة بالفيتامينات والمعادن للمساعدة في بدء عملية التخمير. ^{[ 2 ]}

بعد التلقيح بفترة وجيزة، تبدأ الخميرة باستهلاك النيتروجين المتاح بسرعة، حيث يُستهلك ما يصل إلى 46% من النيتروجين المتاح للخميرة (YAN) بالكامل مع بداية التخمر الكامل. ^{[ 1 ]} ولأن النيتروجين غير العضوي، مثل أملاح الأمونيوم في فوسفات ثنائي الأمونيوم (DAP)، سام للخميرة عند تركيزات عالية، فإنه لا يُضاف أبدًا أثناء التلقيح عندما تكون الكتلة الحيوية للخميرة المُعاد ترطيبها حديثًا منخفضة. يقوم العديد من صانعي النبيذ بتقسيم جرعة فوسفات ثنائي الأمونيوم، حيث تُضاف الجرعة الأولى في نهاية مرحلة التباطؤ عندما تدخل الخميرة فترة نموها الأسي ويبدأ التخمر الكحولي. في معظم أنواع العصير، يكون ذلك بعد حوالي 48 إلى 72 ساعة من التلقيح. تُضاف جرعة ثانية عادةً عند بلوغ ثلث عملية تخمير السكر، وقبل أن تصل مستويات السكر إلى 12-10 بريكس (6.5 إلى 5.5 بوميه، 48.3 إلى 40.0 أوشلي)، وذلك لأن خلايا الخميرة، مع تقدم عملية التخمير، تعجز عن إدخال النيتروجين إلى الخلية بسبب ازدياد سمية الإيثانول المحيط بها. وهذا يُبقي النيتروجين غير مُستخدَم ومتاحًا للكائنات الحية المُسببة للتلف التي قد تظهر لاحقًا. ^{[ 2 ] [ 3 ]}