علم البروتينات الكيميائية

أعقب اختتام مشروع الجينوم البشري أملٌ في نموذج جديد لعلاج الأمراض. فقد أمكن تحديد مواقع العديد من الأمراض الفتاكة والمستعصية على جينات محددة ، مما وفر نقطة انطلاق لفهم أدوار منتجاتها البروتينية في المرض بشكل أفضل. وقد استُخدمت نماذج الحيوانات المعدلة وراثيًا (التي تُعرف باسم "الحذف الجيني ") في اكتشاف الأدوية، والتي تُبرز تأثير غياب بروتين معين ، لا سيما في تطور المرض. كما وظّف الكيميائيون الطبيون الكيمياء الحاسوبية لإنتاج مركبات ذات ألفة عالية ضد البروتينات المسببة للأمراض. ^{[ 3 ]} ومع ذلك، فقد انخفضت معدلات موافقة إدارة الغذاء والدواء الأمريكية على الأدوية خلال العقد الماضي. ^{[ 4 ]} أحد الأسباب المحتملة لفشل الأدوية هو الانفصال بين مراحل اكتشاف الأدوية المبكرة والمتأخرة . ^{[ 3 ]} يركز اكتشاف الأدوية المبكر على التحقق الجيني من الهدف، وهو مؤشر قوي على النجاح، لكن أنظمة الحذف الجيني والتعبير المفرط تُعدّ أنظمة مبسطة. لقد حسّنت أنظمة تعطيل / إدخال الجينات المشروطة مكانيًا وزمنيًا مستوى الدقة في تحليل وظائف البروتينات داخل الجسم الحي ، لكنها لا تزال قاصرة عن محاكاة النطاق الجهازي الكامل للتأثير الدوائي. ^{[ 3 ]} فعلى سبيل المثال، غالبًا ما تعمل الأدوية عبر آليات متعددة، وتكون أكثر فعالية عند استهدافها جزئيًا . ^{[ 3 ]} توفر أدوات الكيمياء البروتينية حلًا لسد الفجوة بين الفهم الجيني للأمراض والفهم الدوائي لتأثير الأدوية، وذلك من خلال تحديد العديد من البروتينات المشاركة في نجاح العلاج.

تعتمد أدوات الكيمياء البروتينية على تقنية البروتينات الكمية القائمة على كروماتوغرافيا السائل - مطياف الكتلة الترادفي (LC-MS/MS أو LC-MS)، مما يتيح تحديدًا شبه كامل وقياسًا كميًا نسبيًا للبروتينات المعقدة في العينات البيولوجية. ^{[ 5 ]} بالإضافة إلى تحليل البروتينات ، يُمكن أيضًا الكشف عن التعديلات ما بعد الترجمة ، مثل الفسفرة ، والغليكوزيل ، والأسيتلة ، ومؤخرًا اليوبيكويتين ، والتي تُعطي نظرة ثاقبة على الحالة الوظيفية للخلية. ^{[ 5 ]} تُحلل الغالبية العظمى من دراسات البروتينات باستخدام مطياف الكتلة عالي الدقة من نوع أوربيتراب ، وتُعالج العينات باستخدام منهجية عمل عامة. تبدأ الإجراءات القياسية بتحليل العينة ، حيث تُستخلص البروتينات في محلول مُحَوِّل يحتوي على أملاح ، وعامل يُختزل روابط ثنائي الكبريتيد ، مثل ثنائي ثيوتريتول ، وعامل مُؤلكل يُغطي مجموعات الثيول ، مثل يودوأسيتاميد . تُحلل البروتينات المُحَوِّلة إنزيميًا ، غالبًا باستخدام التربسين ، ثم تُفصل عن مكونات الخليط الأخرى قبل تحليلها باستخدام تقنية LC-MS/MS . وللحصول على قياس كمي أكثر دقة، يمكن تفاعل عينات مختلفة مع علامات الكتلة الترادفية متساوية الوزن (TMTs)، وهي شكل من أشكال الباركود الكيميائي الذي يسمح بتحليل عينات متعددة ، ثم تُجمع. ^{[ 5 ]}

يُعدّ تحليل البروتينات القائم على النشاط ( ABPP ، أو علم البروتينات القائم على النشاط ) تقنية طُوّرت لرصد مدى توافر المواقع النشطة للإنزيمات لروابطها الداخلية . ^{[ 5 ]} تستخدم تقنية ABPP مجسات مصممة خصيصًا تدخل الموقع النشط للإنزيم وتُشكّل رابطة تساهمية معه، مما يؤكد أن الإنزيم في حالة نشطة. ^{[ 7 ]} عادةً ما يكون المجس نظيرًا للدواء الذي تُدرس آلية عمله، لذا فإن الوسم التساهمي للإنزيم يُشير إلى ارتباط الدواء. تُصمّم مجسات ABPP بثلاث وحدات وظيفية رئيسية: (1) رأس تفاعلي تساهمي مُوجّه للموقع ؛ (2) علامة مُبلِّغة، مثل البيوتين أو الرودامين ؛ و(3) مجموعة رابطة. ^{[ ٨ ]} يُعدّ الرأس الحربي التساهمي الموجه للموقع، والذي يُسمى أيضًا بالمعدِّل التساهمي، مُحِبّاً للإلكترونات يُعدِّل تساهميًا بقايا السيرين أو السيستين أو الليسين في الموقع النشط للإنزيم، ويمنع التفاعلات المستقبلية مع الروابط الأخرى. ^{[ ٧ ]} تُصمَّم مجسات ABPP عمومًا ضد فئات إنزيمية، وبالتالي يمكنها توفير معلومات على مستوى الأنظمة حول تأثير حالة الخلية على الشبكات الإنزيمية. تُستخدم علامة الإبلاغ لتأكيد وسم الإنزيم بالمجموعة التفاعلية، ويمكن أن تختلف باختلاف القراءة اللاحقة. أكثر علامات الإبلاغ استخدامًا هي الأجزاء الفلورية التي تُمكِّن التصوير، وعلامات التقارب ، مثل البيوتين، التي تسمح بسحب الإنزيمات الموسومة وتحليلها عبر مطياف الكتلة . توجد عيوب لكل استراتيجية، وهي أن علامات الإبلاغ الفلورية لا تسمح بالإثراء لتحليل البروتينات، بينما تُنقى علامات التقارب القائمة على البيوتين مع البروتينات المُبيوتينية داخليًا . ^{[ ٨ ]} تُستخدم مجموعة رابطة لربط المجموعة التفاعلية بالمؤشر، ويفضل أن يكون ذلك بطريقة لا تُغير من نشاط المجس. ومن أكثر المجموعات الرابطة شيوعًا سلاسل الألكيل الطويلة ، ومشتقات البولي إيثيلين جلايكول، والببتيدات المعدلة . ^{[ ٥ ]}

انطلاقًا من فرضية أن الإنزيمات تختلف في بنيتها ووظائفها وارتباطاتها تبعًا للحالة الفيزيولوجية أو التطورية للنظام، يُمكن استنتاج أن إمكانية الوصول إلى الموقع النشط للإنزيم ستختلف أيضًا. ^{[ 6 ]} وبالتالي، فإن قدرة مسبار ABPP على وسم الإنزيم ستختلف باختلاف الظروف. ومن ثم، يُمكن أن يكشف ارتباط المسبار معلومات حول الخصائص الوظيفية للإنزيم في سياقات مختلفة. وقد استفادت عمليات الفحص عالية الإنتاجية من تقنية ABPP، لا سيما في مجال فحوصات التثبيط التنافسي ، حيث تُحضن العينات البيولوجية مسبقًا مع المرشحين الدوائيين، ثم تُجعل تتنافس مع مسابير ABPP للارتباط بالإنزيمات المستهدفة. ستمنع المركبات ذات الألفة العالية لأهدافها ارتباط المسبار، ويمكن استخدام درجة ارتباط المسبار كمؤشر على ألفة المركب. ولأن مسابير ABPP تُوسم فئات من الإنزيمات، يُمكن أيضًا استخدام هذا النهج لتحديد انتقائية الدواء، حيث من الناحية المثالية، ستتفوق المركبات الانتقائية للغاية على المسابير في عدد قليل فقط من البروتينات. ^{[ 8 ]}

على عكس تقنية ABPP، التي تُؤدي إلى وسم البروتين عند ارتباط المجس، تتطلب مجسات الوسم الضوئي تنشيطًا بالتحلل الضوئي قبل حدوث الارتباط التساهمي بالبروتين. ^{[ 7 ]} وجود مجموعة حساسة للضوء يُتيح ذلك. ^{[ 7 ]} تتكون هذه المجسات من ثلاثة أجزاء متصلة : (1) هيكل دوائي؛ (2) مجموعة حساسة للضوء ، مثل فينيل أزيد ، أو فينيل ديازيرين، أو بنزوفينون ؛ و(3) علامة تعريف، مثل البيوتين، أو صبغة فلورية ، أو مُساعد تفاعل كيميائي . ^{[ 9 ]} عادةً ما يكون الهيكل الدوائي نظيرًا لدواء قيد الدراسة، والأهم من ذلك، أنه يرتبط بالهدف بشكل عكسي ، مما يُحاكي بشكل أفضل التفاعل بين معظم الأدوية وأهدافها. ^{[ 9 ]} توجد أنواع عديدة من المجموعات الحساسة للضوء، لكنها تختلف اختلافًا جوهريًا عن مجسات ABPP: فبينما تُوسم ABPP تحديدًا الأحماض الأمينية المحبة للنواة في الموقع النشط للهدف، فإن الوسم بالتقارب الضوئي غير محدد، وبالتالي يُمكن تطبيقه على وسم نطاق أوسع من الأهداف. ^{[ 7 ]} يختلف وسم التعريف باختلاف نوع التحليل المُجرى: فالبيوتين ومجموعات الكيمياء النقرية مناسبة لإثراء البروتينات الموسومة قبل تحديدها باستخدام مطياف الكتلة ، بينما تُستخدم الأصباغ الفلورية عند استخدام طريقة تصوير تعتمد على الهلام ، مثل SDS-PAGE ، للتحقق من التفاعل مع الهدف. ^{[ 7 ] [ 9 ]}

نظرًا لتعدد وظائف مجسات التقارب الضوئي، يصعب تصميمها. يدمج الكيميائيون نفس مبادئ نمذجة العلاقة بين التركيب والنشاط المستخدمة في الأدوية في مجسات التقارب الضوئي، ولكن دون المساس بنشاط البنية الدوائية أو قدرة المجموعة الحساسة للضوء على الارتباط. ^{[ 9 ]} ولأن المجموعات الحساسة للضوء ترتبط بشكل عشوائي، فإن التصميم غير السليم قد يتسبب في وسم المجس لنفسه أو لبروتينات غير مستهدفة. يجب أن يظل المجس مستقرًا أثناء التخزين، وفي مختلف المحاليل المنظمة ، وعند مستويات حموضة مختلفة ، وفي الأنظمة الحية لضمان حدوث الوسم فقط عند التعرض للضوء. كما يجب ضبط التنشيط الضوئي بدقة، لأن الإشعاع قد يُلحق الضرر بالخلايا. ^{[ 9 ]}

يُعدّ التثبيت باستخدام الخرزات الدقيقة تقنيةً مرنةً تُمكّن الباحث من تحديد ما إذا كان يرغب في استهداف البروتينات من البروتينات الكلية أو المركبات الشبيهة بالأدوية من المكتبات الكيميائية . وتجعل الخصائص المجهرية للخرزات الدقيقة منها مناسبةً لتطبيقات التخصيب التي تتطلب جهدًا أقل نسبيًا، نظرًا لسهولة رؤيتها وسهولة إزالة كتلتها من محاليل البروتين. ^{[ 11 ]} تاريخيًا ، كانت الخرزات الدقيقة تُصنع من بوليمرات خاملة ، مثل الأغاروز والدكستران ، تُعدّل وظيفيًا لربط طُعم مُختار. وفي حالة استخدام البروتينات كطُعم، تُعدّ مجموعات الأمين الوظيفية روابط شائعة لتسهيل عملية الربط. وقد استفادت الأساليب الحديثة من انتشار الخرزات المغناطيسية الدقيقة ، والتي تُمكّن من الفصل المغناطيسي للمواد المُثبّتة على الخرزات من العينات المُعالجة. وتُظهر الخرزات المغناطيسية خصائص فائقة المغناطيسية ، مما يجعل إزالتها من المحلول باستخدام مغناطيس خارجي أمرًا في غاية السهولة . ^{[ 12 ]} في سير عمل مبسط، تُستخدم حبيبات مغناطيسية لتثبيت بروتين مستهدف، ثم تُخلط هذه الحبيبات مع مكتبة كيميائية لفحص الروابط المحتملة . ترتبط الروابط ذات الألفة العالية بالبروتين المستهدف المثبت وتقاوم الإزالة بالغسل، مما يؤدي إلى زيادة تركيزها في العينة. في المقابل، يمكن تثبيت رابط معين وفحصه ضد بروتينات البروتيوم عن طريق حضنه مع مستخلص خلوي . ^{[ 12 ]}

تم تطبيق استراتيجيات هجينة تعتمد على المحلول والتثبيت، حيث تُترك الروابط المُعدّلة بعلامة إثراء، مثل البيوتين، تطفو بحرية في المحلول لتجد بروتيناتها المستهدفة. بعد فترة حضانة، يمكن تفاعل معقدات الرابط-البروتين مع خرزات مغلفة بالستربتافيدين ، والتي ترتبط بعلامة البيوتين، مما يسمح بسحب البروتينات وتحديد شركاء التفاعل. يمكن توسيع نطاق هذه التقنية للمساعدة في تحضير العينات لتقنية ABPP ووسم التقارب الضوئي . على الرغم من أن أساليب التثبيت قابلة للتكرار وناجحة، إلا أنه من المستحيل تجنب محدودية الإعاقة الفراغية الناتجة عن التثبيت ، والتي تتداخل مع التوافق المُستحث . من العيوب الأخرى الامتزاز غير النوعي لكل من البروتينات والجزيئات الصغيرة على سطح الخرزة، مما قد يؤدي إلى نتائج إيجابية خاطئة. ^{[ 10 ]}

ظهرت تقنية كروماتوغرافيا التقارب في خمسينيات القرن الماضي كطريقة نادرة الاستخدام لتنقية الإنزيمات؛ ومنذ ذلك الحين، أصبحت شائعة الاستخدام، وهي أقدم طرق الكيمياء البروتينية. ^{[ 13 ]} تُجرى كروماتوغرافيا التقارب وفقًا لأحد نمطين أساسيين: تثبيت الليجاند أو تثبيت الهدف. في نمط تثبيت الليجاند، يُثبَّت الليجاند المطلوب - غالبًا ما يكون دواءً رائدًا - داخل عمود كروماتوغرافي، ويعمل كطور ثابت . تُمرَّر عينة معقدة تتكون من العديد من البروتينات، مثل مستخلص خلوي ، عبر العمود، ويرتبط الهدف المطلوب بالليجاند المُثبَّت، بينما تمر مكونات العينة الأخرى عبر العمود دون احتجاز. أما في نمط تثبيت الهدف، فيُثبَّت الهدف المطلوب - غالبًا ما يكون بروتينًا ذا صلة بمرض معين - داخل عمود كروماتوغرافي، ويعمل كطور ثابت . تُمرر مكتبات المركبات المجمعة عبر العمود باستخدام محلول التطبيق ، حيث تُحتجز الروابط الكيميائية من خلال تفاعلات الارتباط مع الطور الثابت ، بينما تمر المركبات الأخرى عبر العمود دون احتجاز. ^{[ 14 ]} في كلتا الحالتين، يمكن فصل المواد التحليلية المحتجزة من العمود وتحديدها باستخدام مطياف الكتلة. يرد أدناه جدول باستراتيجيات الفصل.

يُعدّ تحليل البروتينات الحراري (أو ما يُعرف أيضًا بتحليل الإزاحة الحرارية الخلوية ) استراتيجية شائعة الاستخدام مؤخرًا لاستنتاج تفاعلات البروتين مع الليجاند من خلال رصد تغيرات استقرار البروتين الحراري الناتجة عن ارتباط الليجاند. في إعداد نموذجي للتحليل، تُعرَّض عينات البروتين لليجاند المُختار، ثم تُقسَّم هذه العينات إلى أجزاء صغيرة وتُسخَّن لفصل نقاط درجة الحرارة الفردية. عند ارتباط الليجاند، يُتوقع أن يزداد استقرار البروتين الحراري ، وبالتالي ستكون البروتينات المرتبطة بالليجاند أكثر مقاومة للتفكك الحراري. بعد التسخين، تُحلَّل كمية البروتين غير المتفكك المتبقية باستخدام علم البروتينات الكمي ، وتُنشأ منحنيات الاستقرار. عند مقارنة منحنى الاستقرار بمنحنى استقرار البروتين غير المُعالَج، يُتوقع أن ينزاح المنحنى المُعالَج إلى اليمين، مما يُشير إلى حدوث استقرار ناتج عن ارتباط الليجاند. تاريخيًا، كان يُقيَّم تحليل البروتينات الحراري باستخدام تقنية ويسترن بلوت ضد هدف معروف. مع ظهور مطياف الكتلة عالي الدقة من نوع أوربيتراب ، أصبح بالإمكان إجراء هذا النوع من التجارب على نطاق واسع يشمل جميع البروتينات ، كما يُمكن توليد منحنيات استقرار لآلاف البروتينات دفعة واحدة. وقد أُجريت بنجاح دراسات تحليل البروتينات الحرارية في المختبر ، وفي الموقع ، وفي الجسم الحي . وعند دمج هذه التقنية مع مطياف الكتلة ، يُشار إليها باسم "تحليل الإزاحة الحرارية الخلوية باستخدام مطياف الكتلة" (MS- CETSA ). ^{[ 17 ]}

يعتمد اختبار استقرار الهدف المستجيب لتقارب الدواء ( DARTS) على فرضية أساسية مشابهة لاختبار استقرار البروتين المستهدف (TPP)، وهي أن استقرار البروتين يزداد بارتباط الليجاند. مع ذلك، في اختبار DARTS، يُقيّم استقرار البروتين استجابةً للهضم بواسطة إنزيم البروتياز . باختصار، تُحضن عينة من مستخلص الخلية مع جزيء صغير مُستهدف، ثم تُقسم العينة إلى أجزاء، ويخضع كل جزء منها لتحلل بروتيني محدود بعد إضافة إنزيم البروتياز . يُعد التحلل البروتيني المحدود بالغ الأهمية، لأن التحلل البروتيني الكامل سيؤدي إلى هضم كامل حتى البروتين المرتبط بالليجاند . بعد ذلك، تُحلل العينات باستخدام تقنية SDS-PAGE لتقييم الاختلافات في مدى الهضم، ثم تُستأصل الحزم البروتينية وتُحلل باستخدام مطياف الكتلة لتأكيد هوية البروتينات المقاومة للتحلل البروتيني . بدلاً من ذلك، إذا كان الهدف مُشتبهًا به بالفعل ويجري اختباره للتحقق من صحته، فيمكن استخدام بروتوكول لطخة ويسترن لتحديد البروتين مباشرةً. ^{[ 18 ]}

يعتمد استقرار البروتينات من خلال معدلات الأكسدة أيضًا على افتراض أن ارتباط الليجاند يوفر حماية للبروتينات من طرق التحلل، وهذه المرة من أكسدة بقايا الميثيونين . في تقنية SPROX، يُقسّم مستخلص البروتين ويُعالج بالدواء أو بمحلول DMSO كعينة ضابطة، ثم تُقسّم كل مجموعة إلى عينات منفصلة بتراكيز متزايدة من مادة غوانيدينيوم هيدروكلوريد (GuHCl) المُسببة لتفكك البروتينات . اعتمادًا على تركيز GuHCl ، تتفكك البروتينات بدرجات متفاوتة. بعد ذلك، تُفاعل كل عينة مع بيروكسيد الهيدروجين ، الذي يؤكسد بقايا الميثيونين . البروتينات التي يُثبّتها الدواء تبقى مطوية عند تراكيز أعلى من GuHCl وتتعرض لأكسدة أقل للميثيونين. يمكن قياس كمية بقايا الميثيونين المؤكسدة باستخدام تقنية LC-MS/MS واستخدامها لإنشاء منحنيات استقرار الميثيونين، والتي تُعد مؤشرًا على ارتباط الدواء. يُعاني اختبار SPROX من بعض العيوب، أبرزها أن الببتيدات الوحيدة ذات الصلة من عينات SPROX هي تلك التي تحتوي على بقايا الميثيونين، والتي تُمثل حوالي ثلث الببتيدات ، والتي لا توجد حاليًا تقنيات فعّالة لتخصيبها. ولا تُقدم سوى بقايا الميثيونين المُعرّضة للأكسدة معلومات ذات مغزى، وليست كل الاختلافات في أكسدة الميثيونين مُتوافقة مع استقرار البروتين. وبدون التخصيب، يُصبح تحليل هذه الببتيدات باستخدام تقنية LC-MS/MS صعبًا، حيث يُمكن أن تُطغى مساهمة مُكونات العينة الأخرى في ضوضاء مطياف الكتلة على الإشارة ذات الصلة. لذلك، تتطلب عينات SPROX تجزئة لتركيز الببتيدات المطلوبة قبل تحليلها بتقنية LC-MS/MS . ^{[ 16 ]}

على الرغم من أن اعتماد تقنية قياس الطيف الكتلي بالانتقاء التقاربي (AS-MS) قد أدى إلى توسيع نطاق أساليب التحليل، ^{[ 19 ]} إلا أن هذه التقنية العامة تتبع مخططًا بسيطًا. تُحضن البروتينات المستهدفة مع جزيئات صغيرة للسماح بتكوين معقدات مستقرة من الربيطة والبروتين ، ثم تُزال الجزيئات الصغيرة غير المرتبطة من الخليط، وتُحلل مكونات معقدات الربيطة والبروتين المتبقية باستخدام قياس الطيف الكتلي . ^{[ 19 ]} تُصنف الربائط المرتبطة التي تم تحديدها على أنها مركبات فعالة ، ويمكن استخدامها كنقطة انطلاق لتوليد المركبات الرائدة . ولأن تقنية AS-MS تقيس الارتباط بطريقة غير متحيزة، فلا حاجة لربط المركب الفعال بقراءة وظيفية، مما يتيح إمكانية تحديد الأدوية التي تعمل خارج المواقع النشطة، مثل المعدلات التغايرية والمرافقات الكيميائية ، كل ذلك في تحليل واحد. ^{[ 20 ]} ولأنه يمكن تحديد الجزيئات الصغيرة مباشرةً من خلال كتلتها الدقيقة ، فلا حاجة إلى اشتقاقها لتأكيد صحة المركب الفعال. ^{[ 20 ]} من بين طرق الاشتقاق والطرق الخالية من الوسم، تتميز تقنية AS-MS بميزة فريدة تتمثل في إمكانية تقييم العديد من المركبات الاختبارية في التجربة الواحدة - حيث تم الإبلاغ عن ما يصل إلى 20,000 مركب في التجربة الواحدة في الأدبيات العلمية، وقد أبلغت إحدى المجموعات عن تحليل مكتبات كيميائية مقابل مجموعات بروتينية غير متجانسة . ^{[ 20 ]} ترد أدناه الخطوات الأساسية لتقنية AS-MS بمزيد من التفصيل.

تحليل الروابط المرتبطة

تتطلب الخطوة الأخيرة فصلًا حيويًا تحليليًا للروابط المرتبطة عن أهدافها، ثم تحديد هذه الروابط باستخدام كروماتوغرافيا السائل-مطياف الكتلة . ^{[ 20 ]} يوفر مطياف الكتلة ذو الطور المتغير (AS-MS) وسيلة لتحديد تفاعلات الجزيئات الصغيرة مع البروتينات إما مباشرةً - من خلال الكشف البروتيني من أعلى إلى أسفل عن المركبات السليمة - أو بشكل غير مباشر - من خلال تمسخ مركبات الجزيئات الصغيرة مع البروتينات متبوعًا بتحديد الجزيئات الصغيرة باستخدام مطياف الكتلة . ^{[ 19 ]} يتطلب النهج من أعلى إلى أسفل حقن المركب مباشرةً في مصدر مطياف الكتلة ذي التأين بالرذاذ الإلكتروني في ظروف لطيفة بما يكفي للحفاظ على التفاعل وسلامته أثناء الانتقال من الحالة السائلة إلى الغازية . ^{[ 19 ]} على الرغم من أن غانم وهينيون أثبتا إمكانية ذلك في عام 1991، إلا أنه غير مناسب للإنتاجية العالية . ^{[ 19 ]} ومن المثير للاهتمام أن تفكك التقاط الإلكترون ، الذي يُستخدم عادةً في تحديد بنية الببتيدات ، قد استُخدم لتحديد مواقع ارتباط الليجاندات أثناء التحليل من الأعلى إلى الأسفل . ^{[ 19 ]} وهناك طريقة أبسط لتحليل الليجاندات المرتبطة ، تعتمد على استخلاص ترسيب البروتين لتفكيك البروتينات وإطلاق الليجاندات في محلول الترسيب، والذي يمكن بعد ذلك تخفيفه وتحديده باستخدام نظام LC-MS .

لا يعتمد تحديد الهدف عن طريق الفصل الكروماتوغرافي المشترك على اختلافات استقرار البروتين بعد المعالجة الدوائية. بل يعتمد على افتراض أن الأدوية تُشكّل مُركّبات مستقرة مع بروتيناتها المستهدفة ، وأن هذه المُركّبات قوية بما يكفي لتحمّل الفصل الكروماتوغرافي . في سير العمل النموذجي، يُحضن مُستخلص خلوي مع دواء، ثم يُحقن المُستخلص في نظام كروماتوغرافيا التبادل الأيوني ويُجزّأ . تُفصل بروتينات المُستخلص وفقًا لتدرج القوة الأيونية ، وتُجمع الأجزاء على فترات زمنية قصيرة. يُحلل كل جزء بواسطة LC-MS/MS لتحديد محتواه من البروتين والدواء . تخرج البروتينات الفردية بملامح مميزة، وينبغي أن تُحاكي الأدوية المُحضنة مُسبقًا ملامح فصل الأهداف التي تُشكّل معها مُركّبات. يسمح ربط ملامح فصل الدواء والبروتين بتضييق نطاق الأهداف واستنتاجها. ^{[ 22 ]}

غالبًا ما يكون تطوير وتطبيق فحوصات الكيمياء البروتينية المخبرية عمليةً تستغرق وقتًا طويلًا ومكلفة للغاية. وقد برزت محاكاة الالتحام الجزيئي كوسيلة منخفضة التكلفة نسبيًا وعالية الإنتاجية لتصنيف قوة تفاعلات الجزيئات الصغيرة مع البروتينات. يتطلب الالتحام الجزيئي نمذجة دقيقة لكل من بنية الربيطة والبروتين بدقة ذرية، ولذلك يُستعان بالتحديد التجريبي لبنية البروتين، غالبًا من خلال طرق تكميلية مثل علم البلورات بالأشعة السينية والمجهر الإلكتروني فائق البرودة . تُصنف استراتيجيات الالتحام الجزيئي حسب نوع المعلومات المعروفة مسبقًا عن الربيطة والبروتين محل الاهتمام. ^{[ 23 ]}

الطرق القائمة على الربيطة

عند فحص ربيطة نشطة بيولوجيًا ذات بنية معروفة مقابل بروتين ذي معلومات بنيوية محدودة، يتم إجراء النمذجة مع مراعاة بنية الربيطة. تحدد نمذجة الفارماكوفور السمات الإلكترونية والبنيوية الرئيسية المرتبطة بالنشاط العلاجي عبر نظائر بنيوية نشطة بيولوجيًا مماثلة ، وبالتالي تتطلب مكتبات كبيرة تحتوي على بيانات تجريبية مقابلة لتعزيز القدرة التنبؤية. يتم تراكب هياكل المركبات افتراضيًا، ويتم تقييم العناصر المشتركة بناءً على ميلها نحو النشاط البيولوجي. ^{[ 24 ]} لقد أدى التحول من النمذجة القائمة على مبدأ القفل والمفتاح إلى النمذجة القائمة على مبدأ التوافق المستحث إلى تحسين تنبؤات الارتباط، ولكنه أدى أيضًا إلى ظهور تحدي نمذجة مرونة الربيطة، الأمر الذي يتطلب بناء قاعدة بيانات للنماذج التوافقية ويستهلك مساحات تخزين بيانات كبيرة. هناك نهج آخر يُعرف باسم طريقة "التشغيل الفوري"، حيث يتم اختبار النماذج التوافقية أثناء عملية نمذجة الفارماكوفور ، دون الحاجة إلى قاعدة بيانات؛ تتطلب هذه الطريقة مساحة تخزين أقل بكثير على حساب وقت حسابي طويل. ^{[ 24 ]} ينشأ تحدٍ ثانٍ من قرار كيفية تطبيق التراكيب التناظرية. يتمثل أحد الأساليب الشائعة في استخدام انحدار المربعات الصغرى للتطبيق، لكن هذا يتطلب نقاط ارتكاز يحددها المستخدم، وبالتالي يُدخل تحيزًا بشريًا في العملية. تتطلب نماذج الفارماكوفور مجموعات بيانات تدريبية، مما يُثير تحديًا آخر يتمثل في اختيار مكتبة المركبات المناسبة لتدريب النماذج بشكل كافٍ. يؤثر حجم مجموعة البيانات والتنوع الكيميائي بشكل كبير على أداء المنتج النهائي. ^{[ 25 ]}

استُخدمت استراتيجيات الكيمياء البروتينية لتوسيع نطاق الأهداف الدوائية . ^{[ 26 ]} في حين أن الأدوية الناجحة تاريخيًا تستهدف جيوب ارتباط محددة جيدًا في البروتينات القابلة للاستهداف الدوائي، فإن هذه الجيوب لا تُغطي سوى 15% تقريبًا من البروتينات المُعَلَّمة . ^{[ 26 ]} لمواصلة تطوير مجموعتنا الدوائية ، يلزم اتباع مناهج جريئة لاكتشاف الروابط. وقد أدى استخدام تقنية ABPP، بشكل غير مقصود، إلى إعادة تنشيط البحث عن مواقع جديدة قابلة للاستهداف الدوائي. فقد وُجد أن مجسات ABPP، المستخدمة عمدًا لوسم المواقع النشطة للإنزيمات، تُوسم العديد من المناطق المحبة للنواة على العديد من البروتينات المختلفة بشكل غير مقصود. وعلى الرغم من الاعتقاد السائد في البداية بأنها مجرد ضوضاء تجريبية، إلا أن هذه التفاعلات غير المقصودة قد لفتت انتباه الباحثين إلى وجود مواقع يُمكن استهدافها بأدوية تساهمية جديدة . ويبرز هذا الأمر بشكل خاص في حالة البروتينات التي لا تمتلك نشاطًا إنزيميًا للتثبيط، أو البروتينات المقاومة للأدوية والمتحولة. في أي من هذه الحالات، يمكن استهداف البروتينات لتحللها باستخدام أسلوب دوائي جديد يُعرف باسم " البروتينات الهجينة المُستهدفة للتحلل البروتيني" (PROTACs) . ^{[ 26 ]} تُعدّ PROTACs جزيئات صغيرة غير متجانسة ثنائية الوظيفة، مصممة للتفاعل مع بروتين مستهدف وإنزيم E3 يوبيكويتين ليغاز . يُقرّب هذا التفاعل إنزيم E3 يوبيكويتين ليغاز من البروتين المستهدف بدرجة كافية لتحفيز تحلله. يشير وجود مواقع ارتباط تساهمية محتملة عبر البروتينات إلى إمكانية استهداف العديد من الأدوية تساهميًا باستخدام هذا الأسلوب. ^{[ 26 ]}

يُعدّ علم البروتينات الكيميائية في طليعة إعادة استخدام الأدوية . ويكتسب هذا أهمية خاصة في عصر كوفيد-19 ، الذي شهد حاجة ماسة لتحديد الأدوية المعتمدة من إدارة الغذاء والدواء الأمريكية ذات النشاط المضاد للفيروسات بسرعة . ^{[ 27 ]} في هذا السياق، يُستخدم عادةً الفحص الظاهري لتحديد الأدوية ذات التأثير المطلوب في المختبر ، مثل تثبيط تكوين اللويحات الفيروسية . إذا أعطى دواء ما نتيجة إيجابية، فإن الخطوة التالية هي تحديد ما إذا كان يعمل على هدف معروف أو جديد. وبالتالي، يُعدّ علم البروتينات الكيميائية امتدادًا للفحص الظاهري. في حالة كوفيد-19 ، درس فريمان وزملاؤه التأثيرات الجانبية لدواء ريمديسيفير المضاد للفيروسات واسع الطيف ، والذي كان من أوائل الأدوية التي أُعيد استخدامها في الجائحة . ^{[ 27 ]} تم اختبار عقار ريمديسيفير من خلال تحليل البروتينات الحرارية في اختبار التحول الحراري الخلوي HepG2 ، إلى جانب عقار هيدروكسي كلوروكين المثير للجدل ، واكتشف الباحثون أن TRIP13 هو هدف جانبي محتمل لعقار ريمديسيفير. ^{[ 27 ]}

لا تُكتشف الأدوية المعتمدة كمركبات فعالة في عمليات الفحص عالية الإنتاجية، لأن المكتبات الكيميائية المستخدمة في الفحص لم تُحسّن بعدُ ضد أي أهداف دوائية. مع ذلك، تُعدّ طرق مثل كروماتوغرافيا التقارب وقياس الطيف الكتلي بالانتقاء التقاربي من الأدوات الأساسية في صناعة الأدوية ، وقد وُثّق على وجه الخصوص أن قياس الطيف الكتلي بالانتقاء التقاربي يُنتج عددًا كبيرًا من المركبات الفعالة عبر فئات عديدة من البروتينات التي يصعب استهدافها دوائيًا . ^{[ 20 ]} ويعود ذلك في جزء كبير منه إلى الحجم الهائل من الروابط التي يمكن فحصها في اختبار واحد. استخدم باحثون في معهد iHuman بجامعة شنغهاي للتكنولوجيا مخططًا تم فيه فحص 20,000 مركب لكل مجموعة ضد مستقبل _A2A1R ، وهو مستقبل بروتيني مقترن بـ G يصعب استهدافه دوائيًا، بنسبة فعالية بلغت 0.12%، مما أدى إلى اكتشاف العديد من الروابط ذات التقارب العالي. ^{[ 20 ]}