تاريخ البنسلين

يتتبع تاريخ البنسلين كيف أدت ملاحظات النشاط المضاد للميكروبات في العفن البنسيليوم إلى تطوير البنسلينات ، وهي عائلة من المضادات الحيوية واسعة الاستخدام.

استخدمت المجتمعات القديمة العفن لعلاج العدوى، ولاحظ كثيرون تثبيط نمو البكتيريا بواسطة العفن. أثناء عمله في مستشفى سانت ماري بلندن عام ١٩٢٨، كان الطبيب الاسكتلندي ألكسندر فليمنج أول من أثبت تجريبياً أن فطر البنسيليوم يفرز مادة مضادة للبكتيريا، أطلق عليها اسم "البنسلين". وقد تبين أن هذا العفن هو نوع متحور من فطر البنسيليوم كريسوجينوم (المعروف الآن باسم البنسيليوم روبنز )، وهو ملوث لمزرعة بكتيرية في مختبره. انتهى العمل على البنسلين في سانت ماري عام ١٩٢٩.

في عام ١٩٣٩، بدأ فريق من العلماء في كلية السير ويليام دان لعلم الأمراض بجامعة أكسفورد ، بقيادة هوارد فلوري ، وضمّ إدوارد أبراهام ، وإرنست تشين ، وماري إيثيل فلوري ، ونورمان هيتلي ، ومارجريت جينينغز ، أبحاثًا حول البنسلين. طوّروا طريقةً لزراعة العفن واستخلاص البنسلين منه وتنقيته وتخزينه، بالإضافة إلى اختبار لقياس نقائه. وأصبح "البنسلين" اسم المكوّن الفعّال في عصارة العفن. أجروا تجارب على الحيوانات لتحديد سلامة البنسلين وفعاليته قبل إجراء التجارب السريرية والميدانية. استنتجوا الصيغة الكيميائية للبنسلين وحدّدوا آلية عمله. قام القطاع الخاص ووزارة الزراعة الأمريكية بتحديد وإنتاج سلالات جديدة، وطوّروا تقنيات الإنتاج الضخم. خلال الحرب العالمية الثانية، أصبح البنسلين جزءًا مهمًا من المجهود الحربي للحلفاء ، وأنقذ آلاف الأرواح. تقاسم ألكسندر فليمنج وهوارد فلوري وإرنست تشين جائزة نوبل في الطب أو علم وظائف الأعضاء لعام 1945 لاكتشافهم وتطويرهم البنسلين.

بعد انتهاء الحرب عام ١٩٤٥، أصبح البنسلين متوفرًا على نطاق واسع. وقد حددت دوروثي هودجكين تركيبه الكيميائي، وهو أحد الإنجازات التي نالت عنها جائزة نوبل في الكيمياء عام ١٩٦٤. أدى ذلك إلى تطوير أنواع من البنسلين شبه الاصطناعي ، والتي كانت أكثر فعالية ضد نطاق أوسع من البكتيريا. تم تصنيع الدواء عام ١٩٥٧، لكن زراعة العفن لا تزال الوسيلة الأساسية لإنتاجه. اكتُشف أن إضافة البنسلين إلى علف الحيوانات يزيد من زيادة الوزن، ويحسن كفاءة تحويل العلف ، ويعزز نموًا أكثر تجانسًا، ويسهل مكافحة الأمراض. أصبحت الزراعة من أكبر مستهلكي البنسلين. بعد فترة وجيزة من اكتشاف البنسلين، أبلغ فريق أكسفورد عن مقاومة العديد من البكتيريا له. ولا تزال الأبحاث مستمرة بهدف فهم آليات مقاومة المضادات الحيوية والتغلب عليها .

اكتشفت العديد من الحضارات القديمة، بما فيها حضارات أستراليا والصين ومصر واليونان والهند، بشكل مستقل، الخصائص المفيدة للفطريات والنباتات في علاج العدوى . وقد نجحت هذه العلاجات في كثير من الأحيان لأن العديد من الكائنات الحية، بما فيها أنواع عديدة من العفن ، تنتج مضادات حيوية بشكل طبيعي . ومع ذلك، لم يتمكن المعالجون القدماء من تحديد أو عزل المكونات الفعالة في هذه الكائنات. ^{[ 1 ] [ 2 ]}

في عام ١٨٩٥، نشر الطبيب الإيطالي فينتشنزو تيبيريو ، من جامعة نابولي ، بحثًا حول العفن الذي عُثر عليه في بئر ماء في أرزانو ؛ واستنتج من ملاحظاته أن هذا العفن يحتوي على مواد قابلة للذوبان ذات تأثير مضاد للبكتيريا. ^{[ ٣ ]} وبالمثل ، سجّل العالم الكوستاريكي كلودوميرو بيكادو تويت ، من معهد باستور ، التأثير المضاد للبكتيريا لفطر البنسيليوم في عام ١٩٢٣. في هذه المراحل المبكرة من أبحاث البنسلين، كان يُشار إلى معظم أنواع البنسيليوم بشكل غير محدد باسم P. glaucum ، مما يجعل من المستحيل معرفة النوع الدقيق والتأكد من أن البنسلين هو الذي منع نمو البكتيريا. ^{[ ٤ ]}

درس أندريه غراتيا وسارة داث، في الجامعة الحرة ببروكسل، تأثير عينات بكتيرية على أنواع أخرى من البكتيريا. في عام ١٩٢٤، وجدا أن مزارع بكتيريا المكورات العنقودية الذهبية الميتة ملوثة بنوع من الستربتوميسيتات . وبمزيد من التجارب، أظهرا أن مستخلص الستربتوميسيتات قادر على قتل ليس فقط المكورات العنقودية الذهبية ، بل أيضًا الزائفة الزنجارية ، والمتفطرة السلية ، والإشريكية القولونية . أطلق غراتيا على هذا العامل المضاد للبكتيريا اسم "الميكوليسات". في العام التالي ، اكتشفا فطرًا قاتلًا قادرًا على تثبيط نمو الجمرة الخبيثة . وفي تقرير نُشر في مجلة "Comptes rendus des séances de la Société de Biologie et de ses filiales" ، حددا الفطر على أنه بنسيليوم غلوكوم . مع ذلك، لم تحظَ هذه النتائج باهتمام يُذكر، إذ لم يكن العامل المضاد للبكتيريا وقيمته الطبية مفهومين تمامًا، كما فُقدت عينات غراتيا. ^{[ 5 ] [ 6 ]}

أثناء عمله في مستشفى سانت ماري بلندن عام ١٩٢٨، كان الطبيب الاسكتلندي ألكسندر فليمنج يُجري أبحاثًا حول تباين نمو مزارع بكتيريا المكورات العنقودية الذهبية ، محاولًا تكرار نتائج بحثٍ أُجري في كلية ترينيتي بدبلن . ^{[ ٧ ]} قضى فليمنج عطلة الصيف مع عائلته في منزله الريفي "ذا دون" في بارتون ميلز ، سوفولك. ^{[ ٨ ]} قبل مغادرته مختبره في نهاية يوليو، قام بتلقيح عدة أطباق زراعة ببكتيريا المكورات العنقودية الذهبية. وضع الأطباق جانبًا في إحدى زوايا الطاولة بعيدًا عن أشعة الشمس المباشرة، ليُفسح المجال لطالبه الباحث، ستيوارت كرادوك، للعمل في غيابه. عاد فليمنج إلى مختبره في ٣ سبتمبر. ^{[ ٩ ]} وبينما كان هو ودانيال ميرلين برايس، طالبه الباحث السابق، يفحصان أطباق الزراعة، وجدا طبقًا بغطاء مفتوح ومزرعة ملوثة بعفن أزرق مخضر. في الطبق الملوث، لم تنمو البكتيريا المحيطة بالعفن، بينما نمت البكتيريا الأبعد بشكل طبيعي، مما يعني أن العفن قضى على البكتيريا. ^{[ 10 ]} قام فليمنج بتصوير المزرعة وأخذ عينة من العفن لتحديد هويته. ^{[ 11 ]}

استأنف فليمنج إجازته وعاد إلى سانت ماري في ذلك الشهر. جمع العفن الأصلي وزرعه في أطباق بتري. بعد أربعة أيام، وجد أن الأطباق قد نمت عليها مستعمرات كبيرة من العفن. كرر التجربة وحصل على نفس النتائج في قتل البكتيريا. ^{[ 11 ] [ 12 ]} استنتج أن العفن كان يفرز مادة تثبط نمو البكتيريا. ^{[ 13 ]} عند اختباره على أنواع مختلفة من البكتيريا، وجد أن العفن لا يستطيع قتل سوى أنواع معينة من البكتيريا موجبة الجرام . ^{[ 14 ]} تم قتل المكورات العنقودية ، والمكورات العقدية ، وعصية الخناق ( Corynebacterium diphtheriae ) بسهولة، ولكن لم يكن له أي تأثير على بكتيريا التيفوئيد ( Salmonella typhimurium ) والبكتيريا التي كان يُعتقد سابقًا أنها تسبب الإنفلونزا ( Haemophilus influenzae ). أعدّ طريقةً لزراعة البكتيريا تمكنه من الحصول على عصارة العفن، التي أطلق عليها اسم "البنسلين" في 7 مارس 1929، "لتجنب تكرار عبارة "مُرشّح مرق العفن" المطوّلة نوعًا ما". ^{[ 15 ]} وفي محاضرته عند استلام جائزة نوبل عام 1945، قدّم شرحًا إضافيًا، قائلًا:

كثيراً ما يُسألني الناس عن سبب ابتكاري لاسم "البنسلين". ببساطة، اتبعتُ المنهج التقليدي تماماً، وابتكرتُ كلمةً تُفسّر أن مادة البنسلين مُستخلصة من نبات من جنس البنسيليوم، تماماً كما تم ابتكار كلمة " الديجيتالين " قبل سنوات عديدة لمادة مُستخلصة من نبات الديجيتاليس . ^{[ 16 ]}

بعد إجراء مقارنة بنيوية مع أنواع مختلفة من فطر البنسيليوم ، اعتقد فليمنج أن عينته هي بنسيليوم كريسوجينوم ، وهو نوع وصفه عالم الأحياء الدقيقة الأمريكي تشارلز ثوم عام 1910. وكان تشارلز جون باتريك لا توش، عالم النباتات الأيرلندي، قد انضم مؤخرًا إلى جامعة سانت ماري كعالم فطريات ، وقد حدد العينة على أنها بنسيليوم روبروم ، وهو التصنيف الذي استخدمه فليمنج في منشوره. ^{[ 17 ] [ 18 ]} في عام 1931، أعاد ثوم فحص أنواع مختلفة من البنسيليوم ، بما في ذلك عينة فليمنج، وخلص إلى أن عينة فليمنج هي بنسيليوم نوتاتوم ، وهو أحد أنواع سلسلة بنسيليوم كريسوجينوم . ^{[ 19 ]} ومنذ ذلك الحين، أصبح يُشار إلى عفن فليمنج بشكل مترادف باسمي بنسيليوم نوتاتوم وبنسيليوم كريسوجينوم . ^{[ 20 ] [ 21 ]} ولحل هذا الالتباس، اعتمد المؤتمر الدولي السابع عشر لعلم النبات، الذي عُقد في فيينا، النمسا، عام 2005، رسميًا اسم P. chrysogenum . ^{[ 22 ]} وكشف تحليل تسلسل الجينوم الكامل والتحليل الوراثي في ​​عام 2011 أن عفن فليمنج ينتمي إلى P. rubens ، وهو نوع وصفه عالم الأحياء الدقيقة البلجيكي فيليبير بيورج عام 1923. ^{[ 20 ] [ 23 ]}

ظل مصدر التلوث الفطري في تجربة فليمنج موضع تكهنات لعقود عديدة. اقترح فليمنج في عام 1945 أن جراثيم الفطريات دخلت عبر النافذة المطلة على شارع برايد ، ^{[ 24 ]} لكن زملاءه نفوا ذلك، وشهدوا لاحقًا بأن نافذة مختبر فليمنج كانت مغلقة، ^{[ 25 ]} وأن فليمنج لم يتمكن من الوصول إليها لفتحها. ^{[ 26 ]} وتوصلوا إلى إجماع على أن العفن جاء من مختبر لا توش، الواقع في الطابق السفلي من مختبر فليمنج، وأن الجراثيم تسللت عبر الأبواب المفتوحة. ^{[ 27 ]}

لتحقيق التأثير المضاد للبكتيريا على مزارع المكورات العنقودية الذي لاحظه فليمنج، كان لا بد أن ينتج العفن كميات كافية من البنسلين في موعد لا يتجاوز بدء نمو البكتيريا وتكوين مستعمرات مرئية، لأن البنسلين لا يكون فعالاً ضد البكتيريا إلا عندما تتكاثر. ومن حسن الحظ، كانت درجة الحرارة في المختبر خلال شهر أغسطس مثالية أولاً لنمو العفن، حيث كانت أقل من 20  درجة مئوية، ثم مثالية لاحقاً في الشهر لنمو البكتيريا، عندما وصلت إلى 25  درجة مئوية. ^{[ 28 ]}

كان فليمنج عالم بكتيريا، وليس كيميائيًا، لذا ترك معظم العمل الكيميائي لكرادوك. في يناير 1929، استعان فليمنج بفريدريك ريدلي، وهو طالب بحث سابق لديه متخصص في الكيمياء الحيوية، لدراسة الخصائص الكيميائية للعفن. لم يتمكن كرادوك وريدلي من عزل البنسلين، وقبل انتهاء التجارب، غادر كلاهما للعمل في وظائف أخرى. ^{[ 10 ] [ 29 ]}

نشر فليمنج نتائج بحثه في المجلة البريطانية لعلم الأمراض التجريبي في 10 مايو 1929، ونُشرت في عدد الشهر التالي، ^{[ 30 ] [ 31 ]} إلا أن المقال لم يحظَ باهتمام يُذكر. كان فليمنج متشككًا في جدوى عمله طبيًا، وكان أكثر اهتمامًا بتطبيقه في عزل البكتيريا. ^{[ 30 ]} كما احتوى المقال على أخطاء جسيمة. فعلى الرغم من أن ريدلي وكرادوك أثبتا أن البنسلين قابل للذوبان في الإيثر والأسيتون والكحول ، بالإضافة إلى الماء - وهي معلومات بالغة الأهمية لعزله - إلا أن فليمنج ادعى خطأً أنه قابل للذوبان في الكحول وغير قابل للذوبان في الإيثر والكلوروفورم ، وهو ما لم يُختبر. ^{[ 32 ]} في الواقع، البنسلين قابل للذوبان في الإيثانول والإيثر والكلوروفورم. ^{[ 33 ]} أُجريت أبحاث إضافية في أوائل ثلاثينيات القرن العشرين من قِبل آخرين، بمن فيهم هارولد رايستريك الذي أكد عدم استقرار البنسلين كيميائيًا في عام 1932. ^{[ 34 ] [ 35 ]} وبينما استمر فليمنج في إرسال عينات من العفن إلى الباحثين، تضاءلت طلبات الحصول على العينات تدريجيًا. ^{[ 36 ]}

في عام ١٩٣٩، في كلية السير ويليام دان لعلم الأمراض بجامعة أكسفورد ، لفت إرنست بوريس تشين انتباه الأستاذ المسؤول عن الكلية، العالم الأسترالي هوارد فلوري ، إلى ورقة فليمنج البحثية التي نُشرت عام ١٩٢٩ والتي طواها النسيان. وقررا أن دراسة المواد المضادة للبكتيريا التي تنتجها الكائنات الدقيقة قد تكون مجالًا بحثيًا واعدًا. ^{[ ٣٧ ] [ ٣٨ ]} قاد فلوري فريقًا بحثيًا متعدد التخصصات ضم إدوارد أبراهام ، وماري إيثيل فلوري ، وآرثر دنكان غاردنر ، ونورمان هيتلي ، ومارغريت جينينغز ، وجين أور-إيوينغ ، وغوردون ساندرز. ^{[ ٣٩ ] [ ٤٠ ]} تناول كل عضو من أعضاء الفريق جانبًا محددًا من المشكلة في مجال تخصصه، حيث ساهمت الأبحاث المتزامنة في مختلف المجالات في بناء صورة شاملة. كان هذا النوع من التعاون غير معروف عمليًا في المملكة المتحدة آنذاك. ^{[ 41 ]} تم اختيار ثلاثة مصادر مبدئيًا للدراسة: بكتيريا العصوية الرقيقة (Bacillus subtilis) ، وبكتيريا تروبريللا المقيحة (Trueperella pyogenes) ، والبنسلين . ^{[ 42 ]} يتذكر تشين لاحقًا: "لم يخطر ببالنا، عندما بدأنا العمل على البنسلين، أن يكون للبنسلين استخدام عملي في الطب السريري." ^{[ 43 ] [ 44 ]}

تم اختيار مجال البحث الواسع عمدًا لكونه يتطلب تمويلًا طويل الأجل. ^{[ 37 ] [ 38 ]} تقدم فلوري بطلب الدعم إلى مجلس البحوث الطبية (MRC) في سبتمبر 1939. وقد وافق سكرتير المجلس، إدوارد ميلانبي، على المشروع، وخصص 250 جنيهًا إسترلينيًا ( ما يعادل 14000 جنيه إسترليني في عام 2025 ) لإطلاقه، منها 300 جنيه إسترليني للرواتب ( ما يعادل 17000 جنيه إسترليني في عام 2025 ) و100 جنيه إسترليني للنفقات ( ما يعادل 6000 جنيه إسترليني في عام 2025 ) سنويًا لمدة ثلاث سنوات. ^{[ 45 ]} وكتب ميلانبي إلى فلوري: "يبدو لي أن مجال العمل الذي تقترحه سيكون مثيرًا للاهتمام وقد يثبت أهميته العملية." ^{[ 45 ]}

شعر فلوري أن الأمر يتطلب أكثر من ذلك بكثير. في الأول من نوفمبر عام ١٩٣٩، زار هنري إم. "داستي" ميلر الابن، من قسم العلوم الطبيعية في مؤسسة روكفلر، فلوري. شجع ميلر فلوري على التقدم بطلب للحصول على تمويل من المؤسسة ودعم طلبه. ^{[ ٤٦ ] [ ٤٧ ]} كتب فلوري في رسالة الطلب: "إن العمل المقترح، بالإضافة إلى أهميته النظرية، قد يكون له قيمة عملية لأغراض علاجية." ^{[ ٤٨ ]} تمت الموافقة على طلبه، وخصصت المؤسسة ٥٠٠٠ دولار أمريكي (١٢٥٠ جنيهًا إسترلينيًا) سنويًا لمدة خمس سنوات. ^{[ ٤٩ ] [ ٤٧ ]}

كانت المهمة الأولى لفريق أكسفورد هي الحصول على عينة من عفن البنسلين. وقد تبين أن هذه المهمة سهلة. كان جورج دراير ، سلف فلوري، قد حصل على عينة من هذا العفن عام 1930 لأبحاثه حول العاثيات ، وهي فيروسات تصيب البكتيريا. فقد دراير اهتمامه بالبنسلين عندما اكتشف أنه ليس عاثية، لكنه استمر في زراعته. ^{[ 50 ] [ 51 ]} توفي دراير عام 1934، لكن كامبل-رينتون واصل زراعة العفن وتمكن من تزويد فريق أكسفورد به. ^{[ 52 ] [ 53 ]} تمثلت المهمة التالية في تنمية كمية كافية من العفن لاستخلاص كمية كافية من البنسلين لإجراء التجارب المخبرية. زُرع العفن على سطح وسط تشابك-دوكس السائل . وعلى مدار بضعة أيام، شكّل طبقة هلامية صفراء مغطاة بأبواغ خضراء. تحت هذه الطبقة، أصبح السائل أصفر اللون ويحتوي على البنسلين. توصل الفريق إلى أن أقصى إنتاجية يمكن تحقيقها في غضون عشرة إلى عشرين يومًا. ^{[ 54 ]}

يحتاج العفن إلى الهواء لينمو، لذا تطلّب استزراعه وعاءً ذا مساحة سطحية كبيرة. في البداية، استُخدمت زجاجات موضوعة على جوانبها. لم تُوفّر معظم أوعية المختبر مساحةً كبيرةً ومسطحةً، ما جعلها استخدامًا غير اقتصادي لمساحة الحاضنة . ^{[ 54 ]} وُجد أن النونية عملية ، وشكّلت أساسًا لأوعية خزفية مُصمّمة خصيصًا من قِبل شركة جيه. ماكنتاير في بورسلِم . كانت هذه الأوعية مستطيلة الشكل، ويمكن تكديسها لتوفير المساحة. ^{[ 55 ]} وافق مجلس البحوث الطبية على طلب فلوري بمنح 300 جنيه إسترليني ( ما يُعادل 15000 جنيه إسترليني في عام 2025 ) وجنيهين إسترلينيين لكل عاملة في المصنع أسبوعيًا ( ما يُعادل 97 جنيهًا إسترلينيًا في عام 2025 ). في عام 1943، طلب فلوري زيادة أجورهما إلى جنيهين و10 شلنات لكل عاملة أسبوعيًا ( ما يُعادل 99 جنيهًا إسترلينيًا في عام 2025 ). ^{[ 56 ]} جمع هيتلي أول 174 وعاءً من أصل 500 وعاء في 22 ديسمبر 1940، وتم زرعها بالجراثيم بعد ثلاثة أيام. ^{[ 57 ]}

بُذلت جهودٌ لحثّ العفن على إنتاج المزيد من البنسلين. حاول هيتلي إضافة مواد مختلفة إلى الوسط، بما في ذلك السكريات والأملاح والشعير والكحول وحتى المارميت ، دون جدوى. ^{[ 58 ]} وبناءً على اقتراح بول فيلدز ، جرّب إضافة خميرة التخمير . لم يُحسّن هذا من الإنتاج أيضًا، ولكنه قلّل من وقت الحضانة بمقدار الثلث. ^{[ 54 ]} اكتشف الفريق أيضًا أنه إذا أُزيل السائل الحامل للبنسلين واستُبدل بسائل جديد، يُمكن تحضير دفعة ثانية من البنسلين، ^{[ 54 ]} ولكن تم التوقف عن هذه الممارسة بعد ثمانية عشر شهرًا بسبب خطر التلوث. كان لا بد من زراعة العفن في ظروف معقمة. ^{[ 59 ]} اكتشف أبراهام وتشين أن بعض البكتيريا المحمولة جوًا تُنتج البنسليناز ، وهو إنزيم يُدمّر البنسلين. ^{[ 60 ]} لم يكن معروفًا سبب إنتاج العفن للبنسلين، لأن البكتيريا التي يقتلها البنسلين لا تُشكّل تهديدًا للعفن؛ وقد تم التكهن بأنه كان ناتجًا ثانويًا لعمليات التمثيل الغذائي لأغراض أخرى. ^{[ 59 ]}

كانت المرحلة التالية من العملية هي استخلاص البنسلين. رُشِّح السائل عبر حرير المظلات لإزالة الفطريات والجراثيم والشوائب الصلبة الأخرى. ^{[ 61 ]} حُمِّض المحلول بإضافة حمض الفوسفوريك لعملية التفكك . ^{[ 62 ]} حدد تشين أن البنسلين يكون مستقرًا فقط عند درجة حموضة تتراوح بين 5 و8، لكن العملية تتطلب درجة حموضة أقل من ذلك. وبحفظ الخليط عند درجة حرارة 0  مئوية، تمكن من إبطاء عملية التحلل. ^{[ 63 ]} في هذه الحالة، يمكن استخلاص البنسلين باستخدام مذيب. في البداية، استُخدم الإيثر، لأنه كان المذيب الوحيد المعروف بقدرته على إذابة البنسلين، ولكنه شديد الاشتعال وسام. بناءً على اقتراح تشين، جربوا استخدام أسيتات الأميل الأقل قابلية للاشتعال ، ووجدوا أنه فعال أيضًا. ^{[ 61 ] [ 64 ] [ 65 ] [ 66 ]}

تمكن هيتلي من تطوير عملية استخلاص مستمرة. كان من السهل فصل المذيب الحامل للبنسلين عن السائل، حيث كان يطفو على السطح، لكنهم واجهوا الآن المشكلة التي عجز عنها كرادوك وريدلي: استخلاص البنسلين من المذيب. استنتج هيتلي أنه إذا كان البنسلين ينتقل من الماء إلى المذيب عندما يكون المحلول حمضيًا ، فربما يعود مرة أخرى إذا كان المحلول قلويًا . نصحه فلوري بتجربة ذلك. أُضيف هيدروكسيد الصوديوم ، ووُجد أن هذه الطريقة، التي أطلق عليها هيتلي اسم "الاستخلاص العكسي"، ناجحة. ^{[ 61 ] [ 65 ]} كانت المشكلة التالية هي كيفية استخلاص البنسلين من الماء. كانت الطرق المعتادة لاستخلاص أي شيء من الماء هي التبخير أو الغليان، لكن هذا كان يُتلف البنسلين. خطرت لتشين فكرة التجفيف بالتجميد ، وهي تقنية طُوّرت حديثًا في السويد. مكّنت هذه التقنية من إزالة الماء، مما نتج عنه مسحوق جاف بني اللون. ^{[ 61 ] [ 63 ]}

طوّر هيتلي اختبارًا للبنسلين باستخدام أطباق أجار مغذية زُرعت فيها البكتيريا. ثم وُضعت أسطوانات زجاجية قصيرة تحتوي على السائل الحامل للبنسلين المراد اختباره على الأطباق المغذية، وحُضنت لمدة تتراوح بين 12 و16 ساعة عند درجة حرارة 37  درجة مئوية. عندئذٍ، يكون السائل قد اختفى، وتُحاط الأسطوانة بحلقة خالية من البكتيريا. يشير قطر هذه الحلقة إلى قوة البنسلين. ^{[ 62 ]} عُرّفت وحدة أكسفورد بأنها درجة النقاء المطلوبة لإنتاج  حلقة خالية من البكتيريا قطرها 25 مم. ^{[ 52 ]} كان هذا قياسًا اعتباطيًا، إذ لم تكن التركيبة الكيميائية معروفة آنذاك؛ أُجريت الأبحاث الأولى باستخدام محاليل تحتوي على أربع أو خمس وحدات أكسفورد لكل ملليغرام. لاحقًا، عندما أصبح البنسلين عالي النقاء متوفرًا، وُجد أنه يحتوي على 2000 وحدة أكسفورد لكل ملليغرام. ^{[ 67 ]} ومع ذلك، عند اختبار المادة غير النقية، وُجد أنها فعالة ضد البكتيريا حتى عند تركيزات جزء واحد في المليون. كان البنسلين أكثر فعالية بعشرين ضعفًا على الأقل من أقوى السلفوناميدات . ^{[ 63 ]} تبين أن وحدة أكسفورد صغيرة جدًا؛ إذ تطلب علاج حالة واحدة حوالي مليون وحدة. ^{[ 68 ]}

نشر فريق أكسفورد تفاصيل طريقة العزل في أغسطس 1941، مع مخطط للاستخلاص على نطاق واسع. ^{[ 62 ]} وفي مارس 1942، أفادوا بأنهم تمكنوا من تحضير مركب عالي النقاء. ^{[ 69 ] [ 70 ]} وفي عام 1943، اقترح إدوارد أبراهام بنية للبنسلين تحتوي على حلقة بيتا لاكتام . وقد أكدت دوروثي هودجكين هذه البنية في عام 1945 باستخدام تقنية حيود الأشعة السينية. ^{[ 71 ]}

أظهر فريق هوارد فلوري في أكسفورد أن مستخلص البنسيليوم يقضي على أنواع عديدة من البكتيريا. اختبره غاردنر وأور-إيوينغ ضد المكورات البنية (التي كان أكثر فعالية ضدها)، والمكورات السحائية ، والمكورات العقدية، والمكورات العنقودية، والجمرة الخبيثة ، والأكتينوميسيس ، وبكتيريا الكزاز ( المطثية الكزازية )، والبكتيريا المسببة للغرغرينا . لاحظوا محاولة البكتيريا النمو في وجود البنسلين، ولاحظوا أن البنسلين ليس إنزيمًا يُحلل البكتيريا، ولا مطهرًا يقتلها؛ بل هو مادة كيميائية تُعيق عملية انقسام الخلايا . ^{[ 72 ] [ 36 ]} لاحظ جينينغز أنه لا يؤثر على خلايا الدم البيضاء ، وبالتالي فإنه يُعزز دفاعات الجسم الطبيعية ضد البكتيريا بدلًا من إعاقتها. كما وجدت أنه على عكس السلفوناميدات، أول مضاد حيوي واسع الطيف فعال والوحيد المتاح في ذلك الوقت، فإنه لا يتأثر بالصديد . ووجدت ميداوار أنه لا يؤثر على نمو خلايا الأنسجة. ^{[ 73 ]}

بحلول مارس 1940، كان لدى فريق أكسفورد كمية كافية من البنسلين غير النقي لبدء اختبار سميته. على مدى الشهرين التاليين، أجرى فلوري وجينينغز سلسلة من التجارب على الفئران والجرذان والأرانب والقطط، حيث تم إعطاء البنسلين بطرق مختلفة. أظهرت نتائجهم أن البنسلين يتحلل في المعدة، لكن جميع طرق الحقن كانت فعالة، كما دلّ على ذلك تحليل الدم. ووجدوا أن البنسلين يُفرز بكميات كبيرة وبسرعة دون تغيير في البول. ^{[ 74 ]} لم يجدوا أي دليل على سمية البنسلين في أي من حيواناتهم. لو أجروا التجارب على خنازير غينيا، لربما توقف البحث عند هذه النقطة، لأن البنسلين سام لخنازير غينيا. ^{[ 75 ]}

في تمام الساعة الحادية عشرة صباحًا من يوم السبت الموافق 25 مايو 1940، حقن فلوري ثمانية فئران بسلالة شديدة العدوى من بكتيريا المكورات العقدية ، ثم حقن أربعة منها بمحلول البنسلين. قُسّمت هذه الفئران الأربعة إلى مجموعتين: تلقت اثنتان منها 10 ملليغرامات دفعة واحدة، بينما تلقت الاثنتان الأخريان 5 ملليغرامات على فترات منتظمة. بحلول الساعة الثالثة والنصف من صباح يوم الأحد، كانت جميع الفئران الأربعة غير المعالجة قد نفقت. أما الفئران المعالجة فكانت جميعها لا تزال على قيد الحياة، على الرغم من نفوق أحدها بعد يومين. ^{[ 76 ] [ 77 ]} وصف فلوري النتيجة لجينينغز بأنها "معجزة". ^{[ 78 ]}

أعاد جينينغز وفلوري التجربة يوم الاثنين على عشرة فئران؛ هذه المرة، نجت جميع الفئران الستة المعالجة، وكذلك واحد من الفئران الأربعة الضابطة. وفي يوم الثلاثاء، أعادا التجربة على ستة عشر فأراً، مع إعطائهم جرعات مختلفة من البنسلين. نفقت جميع الفئران الضابطة الستة في غضون 24 ساعة، بينما نجت الفئران المعالجة لعدة أيام، على الرغم من أنها نفقت جميعها في غضون 19 يوماً. ^{[ 77 ]} في 1 يوليو، أُجريت التجربة على خمسين فأراً، تلقى نصفها البنسلين. نفقت جميع الفئران الضابطة الخمسة والعشرون في غضون 16 ساعة، بينما بقيت جميع الفئران المعالجة على قيد الحياة باستثناء واحد بعد عشرة أيام. على مدار الأسابيع التالية، أجريا تجارب على مجموعات من 50 أو 75 فأراً، ولكن باستخدام أنواع مختلفة من البكتيريا. ووجدا أن البنسلين كان فعالاً أيضاً ضد المكورات العنقودية والغرغرينا الغازية . ^{[ 79 ]} ذكّر فلوري فريقه بأنه على الرغم من النتائج الواعدة، فإن وزن الإنسان يزيد 3000 مرة عن وزن الفأر. ^{[ 80 ]}

نشر فريق أكسفورد نتائجهم في عدد 24 أغسطس 1940 من مجلة "ذا لانسيت" ، وهي مجلة طبية مرموقة، تحت عنوان "البنسلين كعامل علاجي كيميائي"، مع ذكر أسماء المؤلفين السبعة المشاركين أبجديًا. ^{[ 76 ] [ 81 ]} وخلصوا إلى ما يلي:

النتائج واضحة تمامًا، وتُظهر أن البنسلين فعال في الجسم الحي ضد ثلاثة على الأقل من الكائنات الحية التي تم تثبيطها في المختبر. ويبدو من المعقول التوقع بأن يتم القضاء على جميع الكائنات الحية الموجودة بتراكيز عالية في المختبر في الجسم الحي. لا يبدو أن البنسلين مرتبط بأي مادة علاجية كيميائية مستخدمة حاليًا، وهو يتميز بشكل خاص بفعاليته ضد الكائنات اللاهوائية المرتبطة بالغرغرينا الغازية. ^{[ 76 ]}

لم يحظَ المنشور باهتمام يُذكر؛ فقد أمضى فلوري معظم العامين التاليين محاولًا إقناع الناس بأهمية نتائجهم. وكان من بين القراء فليمنج، الذي زارهم في 2 سبتمبر 1940. اصطحبه فلوري وتشين في جولةٍ في مختبرات الإنتاج والاستخلاص والاختبار، لكنه لم يُدلِ بأي تعليق ولم يُهنئهم على العمل الذي أنجزوه. شكّ بعض أعضاء فريق أكسفورد في أنه كان يحاول نسب الفضل لنفسه. ^{[ 82 ] [ 83 ]}

دون علم فريق أكسفورد، قرأ مارتن هنري داوسون وجلاديس هوبي وكارل ماير من جامعة كولومبيا مقالتهم المنشورة في مجلة لانسيت ، واستلهموا منها فكرة تكرار نتائج فريق أكسفورد. حصلوا على مزرعة من فطر البنسيليوم من روجر ريد في مستشفى جونز هوبكنز ، والتي نمت من عينة كان قد استلمها من فليمنج عام ١٩٣٥. بدأوا زراعة الفطر في ٢٣ سبتمبر، وفي ٣٠ سبتمبر اختبروه ضد المكورات العقدية الخضراء ، وأكدوا نتائج فريق أكسفورد. قام ماير بتكرار عمليات تشين، وحصلوا على كمية صغيرة من البنسلين. في ١٥ أكتوبر ١٩٤٠، أُعطيت جرعات من البنسلين لمريضين مصابين بالتهاب الشغاف الجرثومي في مستشفى بريسبيتيريان بمدينة نيويورك، وهما آرون ألستون وتشارلز آرونسون. أصبحا أول شخصين يتلقيان علاج البنسلين في الولايات المتحدة. ^{[ 84 ] [ 85 ]} عرض فريق جامعة كولومبيا نتائج علاجهم لأربعة مرضى بالبنسلين في الاجتماع السنوي للجمعية الأمريكية للبحوث السريرية في أتلانتيك سيتي، نيو جيرسي ، في 5 مايو 1941. وقد نشر ويليام ل. لورانس تقريرًا عن بحثهم في صحيفة نيويورك تايمز، مما أثار اهتمامًا جماهيريًا واسعًا. ^{[ 85 ] [ 86 ] [ 87 ]}

في أكسفورد، تطوّع تشارلز فليتشر لإيجاد حالات تجريبية للتجارب السريرية على البشر. وافقت إلفا أكيرز، وهي امرأة من أكسفورد كانت تحتضر بسبب سرطان عضال، على أن تكون متطوعة لاختبار سمية البنسلين. في 17 يناير 1941، حقنها فليتشر وريديًا بـ 100  ملغ من البنسلين. ارتفعت حرارتها لفترة وجيزة، لكنها لم تُعانِ من أي آثار جانبية أخرى. رجّح فلوري أن الحمى كانت بسبب المواد المولدة للحمى الموجودة في البنسلين، والتي أُزيلت باستخدام تقنيات كروماتوغرافيا مُحسّنة . ^{[ 88 ]} بعد ذلك، حدّد فليتشر شرطيًا من أكسفورد، يُدعى ألبرت ألكسندر ، كان يُعاني من عدوى حادة في الوجه ناجمة عن بكتيريا المكورات العقدية والمكورات العنقودية، والتي تطورت من قرحة صغيرة في زاوية فمه. كان وجهه بالكامل وعيناه وفروة رأسه متورمة لدرجة استدعت استئصال إحدى عينيه لتخفيف الألم. ^{[ 88 ] [ 89 ]}

في 12 فبراير، أعطى فليتشر ألكسندر 200  ملغ من البنسلين، تلتها  جرعات 100 ملغ كل ثلاث ساعات. في غضون يوم من إعطائه البنسلين، بدأ ألكسندر بالتعافي؛ انخفضت حرارته وقلّت الإفرازات من جروحه المتقيحة . وبحلول 17 فبراير، عادت عينه اليمنى إلى طبيعتها. مع ذلك، لم يكن لدى الباحثين كمية كافية من البنسلين لمساعدته على الشفاء التام. تم استخلاص البنسلين من بوله، لكن الكمية لم تكن كافية. في أوائل مارس، انتكس، وتوفي في 15 مارس. بسبب هذه التجربة وصعوبة إنتاج البنسلين، حوّل فلوري تركيزه إلى علاج الأطفال، الذين يمكن علاجهم بكميات أقل من البنسلين. ^{[ 88 ] [ 89 ]}

بعد ذلك، تم علاج العديد من المرضى بنجاح. كان المريض الثاني آرثر جونز، وهو فتى يبلغ من العمر 15 عامًا مصاب بعدوى بكتيرية عقدية نتيجة جراحة في الورك. تم إعطاؤه 100  ملغ كل ثلاث ساعات لمدة خمسة أيام وتعافى. أما بيرسي هوكين، وهو عامل يبلغ من العمر 42 عامًا، فقد كان يعاني من دمل بحجم 100 مليمتر (4 بوصات) على ظهره. تم إعطاؤه جرعة أولية قدرها 200 ملغ في 3 مايو، تلتها جرعة 100 ملغ كل ساعة. اختفى الدمل تمامًا. جون كوكس، وهو فتى يبلغ من العمر 4 سنوات في غيبوبة جزئية، تم علاجه بدءًا من 16 مايو. توفي في 31 مايو، لكن تشريح الجثة أشار إلى أن سبب الوفاة هو تمزق شريان في الدماغ، ولم تكن هناك أي علامات على وجود عدوى. أما الحالة الخامسة، في 16 يونيو، فكانت لفتى يبلغ من العمر 14 عامًا مصاب بعدوى نتيجة جراحة في الورك، وقد تعافى تمامًا. ^{[ 90 ]}   

إضافةً إلى زيادة الإنتاج في مدرسة دان، أصبح الإنتاج التجاري متاحًا من مصنع تجريبي أنشأته شركة إمبريال للصناعات الكيميائية في يناير 1942، وقامت شركة كيمبل، بيشوب وشركاه بتسليم أول دفعة لها بكمية 910 لترات (200 جالون إمبراطوري ) في 11 سبتمبر. قرر فلوري أن الوقت قد حان لإجراء سلسلة ثانية من التجارب السريرية. تم تكليف إيثيل فلوري بالإشراف، ولكن على الرغم من أن هوارد فلوري كان استشاريًا في علم الأمراض في مستشفيات أكسفورد، وبالتالي يحق له استخدام أجنحتها وخدماتها، إلا أن إيثيل، مما أثار استياءه، تم اعتمادها كمساعدته فقط. كان الأطباء يميلون إلى إحالة المرضى الذين يعانون من ظروف صعبة إلى التجربة بدلاً من المرضى الأكثر ملاءمة، ولكن عندما نجح البنسلين، ارتفعت الثقة في فعاليته. ^{[ 91 ]}  

نشرت إيثيل وهوارد فلوري نتائج التجارب السريرية للبنسلين في مجلة "ذا لانسيت" بتاريخ 27 مارس 1943، حيث أبلغوا عن علاج 187 حالة من حالات الإنتان باستخدام البنسلين. ^{[ 92 ]} وبناءً على هذه الأدلة الطبية، شكّل مجلس الوزراء الحربي البريطاني لجنة البنسلين في 5 أبريل 1943. وتألفت اللجنة من سيسيل وير ، المدير العام للمعدات، رئيسًا؛ وألكسندر فليمنج؛ وهوارد فلوري؛ وفي دي أليسون، وهو أحد طلاب فليمنج السابقين في مجال البحث؛ والسير بيرسيفال هارتلي ، رئيس مجلس البحوث الطبية؛ وممثلين عن شركات الأدوية. ^{[ 93 ]} وأدى ذلك إلى الإنتاج الضخم للبنسلين في العام التالي. ^{[ 94 ]}

إدراكًا منهم أن الإنتاج واسع النطاق للاستخدام الطبي غير مجدٍ في المختبر، حاول فريق أكسفورد إقناع الحكومة البريطانية التي مزقتها الحرب والشركات الخاصة بالانخراط في الإنتاج الضخم، لكن الاستجابة الأولية كانت فاترة. كتب الدكتور بلونت، مدير الأبحاث في مختبرات جلاكسو ، إلى فلوري في أكسفورد في سبتمبر 1940، لكنه لم يتلقَّ أي رد. ويبدو أن فلوري كان قد طلب المساعدة بالفعل من شركتين بريطانيتين للأدوية، لكنهما رفضتا طلبه، ما أصابه بخيبة أمل تجاه صناعة الأدوية البريطانية. ^{[ 95 ]}

في أبريل 1941، التقى وارن ويفر بفلوري، وناقشا صعوبة إنتاج كميات كافية من البنسلين لإجراء التجارب السريرية. رتب ويفر مع مؤسسة روكفلر لتمويل زيارة لمدة ثلاثة أشهر إلى الولايات المتحدة لفلوري وزميل له لاستكشاف إمكانية إنتاج البنسلين هناك. ^{[ 96 ]} غادر فلوري وهيتلي إلى الولايات المتحدة جوًا في 27 يونيو 1941. ^{[ 97 ]} ولأنهم كانوا يعلمون أن عينات العفن المحفوظة في قوارير قد تُفقد بسهولة، قاموا بتلطيخ جيوب معاطفهم بالعفن. ^{[ 36 ]}

التقى فلوري بعالم وظائف الأعصاب جون فولتون ، الذي عرّفه على روس هاريسون ، رئيس المجلس الوطني للبحوث . أحال هاريسون فلوري إلى ثوم، كبير علماء الفطريات في مكتب الصناعات النباتية التابع لوزارة الزراعة الأمريكية في بيلتسفيل، ميريلاند ، وهو الشخص الذي حدد العفن الذي أبلغ عنه فليمنج. في 9 يوليو، اصطحب ثوم فلوري وهيتلي إلى واشنطن العاصمة للقاء بيرسي ويلز، القائم بأعمال مساعد رئيس مكتب الكيمياء الزراعية والصناعية التابع لوزارة الزراعة الأمريكية، والذي يرأس بالتالي مختبرات الوزارة الأربعة. أرسل ويلز برقية تعريفية إلى أورفيل ماي، مدير مختبر الأبحاث الإقليمي الشمالي التابع لوزارة الزراعة الأمريكية في بيوريا، إلينوي . التقوا بماي في 14 يوليو، ورتب لهم لقاءً مع روبرت د. كوجيل، رئيس قسم التخمير في مختبر أبحاث الطاقة المتجددة (NRRL )، الذي طرح احتمال أن يكون التخمير في أوعية كبيرة هو مفتاح الإنتاج على نطاق واسع. ^{[ 98 ] [ 99 ] [ 100 ]}

في 17 أغسطس، التقى فلوري بألفريد نيوتن ريتشاردز ، رئيس لجنة البحوث الطبية التابعة لمكتب البحث والتطوير العلمي ، الذي وعده بتقديم دعمه. ^{[ 101 ]} وفي 8 أكتوبر، عقد ريتشاردز اجتماعًا مع ممثلين عن أربع شركات أدوية كبرى: سكويب ، وميرك ، وفايزر، وليدرلي . وحضر الاجتماع فانيفار بوش ، مدير مكتب البحث والتطوير العلمي، بالإضافة إلى ثوم، ممثل مختبر الأبحاث الوطني. وأبلغهم ريتشاردز بتعليق قوانين مكافحة الاحتكار ، مما يسمح لهم بتبادل المعلومات حول البنسلين. ولم يُشرّع هذا الأمر رسميًا إلا في 7 ديسمبر 1943، واقتصر على البنسلين فقط دون غيره من الأدوية. ^{[ 102 ] [ 103 ]} ورتب مكتب البحث والتطوير العلمي مع مجلس الإنتاج الحربي لمنحهم الأولوية في الحصول على معدات المختبرات والمصانع التجريبية. ^{[ 104 ]}

أتاح كوجيل لأندرو ج. موير العمل على البنسلين مع هيتلي، بينما غادر فلوري للبحث عن شركة أدوية لتصنيع البنسلين. وكخطوة أولى لزيادة الإنتاج، استبدل موير السكروز في وسط النمو باللاكتوز . وحدثت زيادة أكبر عندما أضاف موير سائل نقع الذرة ، وهو منتج ثانوي لصناعة الذرة كان مختبر أبحاث الموارد الطبيعية (NRRL) يجربه بشكل روتيني على أمل إيجاد استخدامات أخرى له. وكان تأثير ذلك على البنسلين مذهلاً؛ فقد وجد هيتلي وموير أنه زاد الإنتاج عشرة أضعاف. ^{[ 97 ]}

في مستشفى ييل نيو هيفن في مارس 1942، كانت آن شيف ميلر، زوجة مدير الألعاب الرياضية بجامعة ييل ، أوجدن د. ميلر، تُصارع الموت بسبب تسمم الدم العقدي الذي أصيبت به بعد إجهاض . وكان طبيبها، جون بامستيد، يُعالج جون فولتون أيضًا من عدوى في ذلك الوقت. كان يعلم أن فولتون يعرف فلوري، وأن أطفال فلوري يقيمون معه. فذهب إلى فولتون ليتوسل إليه أن يُحضر له بعض البنسلين. كان فلوري قد عاد إلى المملكة المتحدة، لكن هيتلي كان لا يزال في الولايات المتحدة، يعمل مع شركة ميرك. مكالمة هاتفية إلى ريتشاردز سمحت بوصول 5.5 غرامات من البنسلين مُخصصة لتجربة سريرية، والتي أُرسلت من واشنطن العاصمة جوًا. كان التأثير مذهلاً؛ ففي غضون 48 ساعة، انخفضت حرارتها من 41 درجة مئوية (106 درجة فهرنهايت) وعادت لتناول الطعام. انخفض عدد مستعمرات البكتيريا في مزرعة دمها من 100 إلى 150 مستعمرة لكل ملليلتر إلى مستعمرة واحدة فقط. اقترح بامستيد تخفيض جرعة البنسلين من 200 ملليغرام، لكن هيتلي حذّره من ذلك. ثمّ جاء هيتلي إلى نيو هيفن، حيث جمع عينة من بولها، واستُخلص منها حوالي 3 غرامات من البنسلين. تعافت ميلر تمامًا، وعاشت حتى عام 1999. ^{[ 105 ] [ 106 ] [ 107 ]}  

الغوص العميق

حتى مايو 1943، كان إنتاج البنسلين يتم بالكامل تقريبًا باستخدام طريقة الأحواض الضحلة التي ابتكرها فريق أكسفورد، ^{[ 108 ]} لكن عالم الفطريات في مختبر أبحاث الطحالب البحرية (NRRL)، كينيث برايان ريبر، جرب الإنتاج بالغمر العميق، حيث زُرع عفن البنسلين في حوض بدلًا من طبق ضحل. كانت النتائج الأولية مخيبة للآمال؛ إذ لم ينتج البنسلين المزروع بهذه الطريقة سوى ثلاث إلى أربع وحدات أكسفورد لكل سنتيمتر مكعب، مقارنةً بعشرين وحدة للزراعات السطحية. ^{[ 109 ]} استعان ريبر بقيادة النقل الجوي التابعة للجيش الأمريكي للبحث عن عفن مماثل في أنحاء مختلفة من العالم. وُجدت أنواع جيدة من العفن في عينات من تشونغتشينغ وبومباي وكيب تاون . مع ذلك، كانت أفضل عينة من شمام بيع في سوق فواكه في بيوريا عام 1943. تم تحديد نوع العفن على أنه Penicillium chrysogenum ، وسُمي "NRRL 1951" أو "سلالة الشمام". ^{[ 100 ] [ 110 ]} ربما تكون الأبواغ قد تسربت من مختبر أبحاث النباتات الوطني. ^{[ 111 ] [ أ ] [ ب ]}

بين عامي 1941 و1943، طوّر موير وكوجيل ورابر طرقًا لإنتاج البنسلين صناعيًا، وعزلوا سلالات من فطر البنسيليوم ذات إنتاجية أعلى . ولتحسين هذه السلالة، عرّض باحثون في مؤسسة كارنيجي بواشنطن سلالة NRRL 1951 للأشعة السينية، ما أدى إلى إنتاج سلالة متحولة سُميت X-1612، أنتجت 300 ملليغرام من البنسلين لكل لتر من مزرعة العفن، أي ضعف إنتاج سلالة NRRL 1951. وبدورهم، استخدم باحثون في جامعة ويسكونسن الأشعة فوق البنفسجية على سلالة X-1612 لإنتاج سلالة سُميت Q-176. أنتجت هذه السلالة أكثر من ضعف كمية البنسلين التي أنتجتها سلالة X-1612، ولكن على شكل البنسلين K الأقل فعالية. ^{[ ج ]} أُضيف حمض فينيل أسيتيك لتحويلها إلى إنتاج البنسلين G عالي الفعالية. ويمكن لهذه السلالة إنتاج ما يصل إلى 550 ملليغرامًا من البنسلين لكل لتر. ^{[ 116 ] [ 110 ]}

كانت شركة فايزر شركة صغيرة في نيويورك متخصصة في إنتاج حمض الستريك ، وقد طورت تقنيات الغمر العميق لهذا الغرض . تضمنت هذه التقنيات تحويل دبس السكر إلى حمض الستريك عن طريق تخميره في خزان كبير مع التقليب المستمر والتحكم الدقيق في درجة الحموضة. ^{[ 117 ]} خصص نائب رئيس شركة فايزر، جون إل. سميث ، الذي توفيت ابنته بسبب عدوى، جميع موارد الشركة لتطوير تقنية عملية للغمر العميق. ^{[ 118 ]} استثمرت الشركة 2.98 مليون دولار في البنسلين عامي 1943 و1944 (ما يعادل 55 مليون دولار في عام 2025 ). عمل علماء فايزر، جاسبر إتش. كين ، وجي إم شول، وإي إم ويبر، وإيه سي فينلي، وإي جيه راتاجاك، على عملية التخمير، بينما طور كل من آر. باستيرناك، ودبليو جيه سميث، وفي. بوغرت، وبي. ريغنا تقنيات الاستخلاص. ^{[ 119 ]}

بعد أن تمكنوا من الحصول على فطر ينمو جيدًا في الماء وينتج كمية مقبولة من البنسلين، كان التحدي التالي هو توفير الهواء اللازم لنموه. تم حل هذه المشكلة باستخدام جهاز تهوية ، لكن التهوية تسببت في رغوة كثيفة في منقوع الذرة. تم حل مشكلة الرغوة بإضافة عامل مضاد للرغوة، وهو غليسيريل مونوريسينوليات. تضمنت هذه التقنية أيضًا التبريد والخلط. ^{[ 120 ]}

افتتحت شركة فايزر مصنعًا تجريبيًا مزودًا بمُخمِّر سعة 7600 لتر (2000 جالون أمريكي ) في أغسطس 1943، وقام راتاجاك بتسليم أول محلول بنسلين منه في 27 أغسطس. وسرعان ما أصبح الخزان الواحد يُنتج نصف إنتاج الشركة. عندها قرر سميث إنشاء مصنع إنتاج متكامل. وفي 20 سبتمبر 1943، تم الاستحواذ على مصنع روبيل للثلج المجاور وتحويله إلى أول مصنع إنتاج بالغمر العميق، مزودًا بأربعة عشر خزانًا سعة كل منها 130000 لتر (34000 جالون أمريكي ) . أُنجز العمل في غضون خمسة أشهر تحت إشراف جون إي. ماكين وإدوارد جيه. جوت، وافتُتح المصنع في 1 مارس 1944. ^{[ 118 ] [ 119 ] [ 121 ]}    

في عام ١٩٤٣، قرر مجلس البحوث الطبية أن الوقت قد حان لإجراء تجارب ميدانية على البنسلين. وتم إبقاء مواقع المراكز التي ستتلقى الدواء سريةً حتى لا تُثير الطلب عليه في ظلّ نقص المعروض منه. ^{[ ١٥٥ ]} أُرسل هوارد فلوري إلى شمال أفريقيا، حيث كانت الحملة العسكرية جارية. وفي ٢٩ يونيو، انضم إليه هيو كيرنز ، وهو باحث آخر منحة رودس من أديلايد، والذي كان يحمل آنذاك رتبة عميد في الجيش البريطاني، وكان مسؤولاً عن المستشفى العسكري لإصابات الرأس في أكسفورد، وقد أحضر معه مخزوناً من ٤٠ مليون وحدة من البنسلين. ^{[ ١٥٦ ] [ ١٥٧ ]}

على مدى الشهرين التاليين، عالج فلوري وكيرنز أكثر من مئة حالة، وجمعا تقريرًا تجاوز مئة صفحة. كما وثّقا أنشطتهما بالفيديو. ألقى فلوري محاضرات عن البنسلين، وتضمن تقريره توصيات لتدريب الضباط الطبيين على استخدامه. انتهى القتال في شمال إفريقيا في مايو 1943، لذا فإن معظم الحالات التي رآها لم تكن لجنود جرحى حديثًا، بل لجنود يعانون من جروح قديمة لم تلتئم؛ إذ بدأت إصابات المعارك بالوصول مجددًا بعد غزو الحلفاء لصقلية في يوليو. ^{[ 158 ]}

رأى فلوري أن مصدر العدوى في كثير من الحالات هو المستشفى وليس ساحة المعركة، ودعا إلى تغييرات في طريقة علاج المرضى للاستفادة من خصائص البنسلين. وأكد على ضرورة تنظيف الجروح وإغلاقها فورًا. كانت هذه فكرة ثورية؛ ففي العادة، كان من شأن ذلك أن يؤدي إلى الغرغرينا الغازية، لكنه اقترح ترك ذلك للبنسلين. وقد تم العمل بتوصياته؛ إذ أنشأت وزارة الحرب دورة تدريبية لأخصائيي علم الأمراض والأطباء في مستشفى رويال هربرت ، والتي استخدمت أفلامًا صورها فلوري في شمال إفريقيا. ^{[ 158 ]}

على الرغم من أنه كان ينوي استخدام البنسلين لعلاج الجرحى المصابين بجروح خطيرة، إلا أن هناك أعدادًا كبيرة من حالات العدوى البكتيرية المنقولة جنسيًا ، والتي كان البنسلين فعالًا بشكل خاص ضدها، ومن وجهة نظر عسكرية، كان علاج السيلان في غضون 48 ساعة إنجازًا كبيرًا. تحسن وضع الإمدادات، ووُفر 20 مليون وحدة يوميًا لغزو الحلفاء لإيطاليا في سبتمبر. ^{[ 158 ] [ 159 ]} خلال الحملة في أوروبا الغربية في الفترة 1944-1945، استُخدم البنسلين على نطاق واسع لعلاج الجروح المصابة وكإجراء وقائي لمنع التهابها. كانت الغرغرينا الغازية قد أودت بحياة 150 من كل 1000 ضحية في الحرب العالمية الأولى ، ولكن اختفى هذا المرض الآن بشكل شبه كامل. بلغت نسبة الشفاء من الكسور المفتوحة أكثر من 94%، وبلغت نسبة الشفاء من الحروق التي تغطي خُمس الجسم أو أقل 100%. ^{[ 160 ]}

اقترح أبراهام التركيب الكيميائي للبنسلين لأول مرة عام 1942. [ 161 ^{] وفي عام} 1945، حددت دوروثي هودجكين التركيب الكيميائي الصحيح للبنسلين باستخدام تقنية حيود الأشعة السينية في أكسفورد. ^{[ 162 ] [ 163 ]} وفي العام نفسه، نشرت اللجنة الأمريكية للبحوث الطبية ومجلس البحوث الطبية البريطاني في مجلة ساينس تحليلات كيميائية أُجريت في جامعات وشركات أدوية وإدارات بحثية حكومية مختلفة. وأعلن التقرير عن وجود أشكال مختلفة من مركبات البنسلين، تشترك جميعها في نفس المكون البنيوي المسمى بيتا لاكتام . ^{[ 164 ]} وقد سُميت البنسلينات بالأرقام الرومانية في المملكة المتحدة (البنسلين الأول، والثاني، والثالث، والرابع) حسب ترتيب اكتشافها، بينما عُرفت بالأحرف (F، G، X، وK) التي تشير إلى أصولها أو مصادرها في الولايات المتحدة، كما يلي:

استندت الأسماء الكيميائية إلى السلاسل الجانبية للمركبات. وفي عام 1948، قدم تشين الأسماء الكيميائية كتسمية قياسية، مشيرًا إلى أن هذا من شأنه أن "يجعل التسمية واضحة قدر الإمكان". ^{[ 165 ]}

في كوندل ، تيرول ، النمسا، في عام 1952، طور هانز مارجريتر وإرنست براندل من شركة بيوكيمي أول بنسلين مستقر في الوسط الحمضي للإعطاء عن طريق الفم، وهو البنسلين الخامس . ^{[ 166 ]} أكمل الكيميائي الأمريكي جون سي. شيهان في معهد ماساتشوستس للتكنولوجيا (MIT) أول تركيب كيميائي للبنسلين الخامس في عام 1957. ^{[ 167 ] [ 168 ] [ 169 ]} كان شيهان قد بدأ دراساته في تركيب البنسلين في عام 1948، وخلال هذه الأبحاث طور طرقًا جديدة لتركيب الببتيدات ، بالإضافة إلى مجموعات حماية جديدة - وهي مجموعات تخفي تفاعلية بعض المجموعات الوظيفية. ^{[ 169 ] [ 170 ]} على الرغم من أن التركيب الأولي الذي طوره شيهان لم يكن مناسبًا للإنتاج الضخم للبنسلينات، إلا أن أحد المركبات الوسيطة في تركيب شيهان كان حمض 6-أمينوبنسيلانيك (6-APA)، وهو نواة البنسلين. ^{[ 171 ] [ 172 ]}

كان اكتشاف 6-APA نفسه تطورًا هامًا. ففي عام 1957، عزل باحثون في مختبرات بيتشام للأبحاث في مقاطعة سري 6-APA من وسط زراعة فطر البنسلين الذهبي ( P. chrysogenum ). ووجد أن 6-APA يشكل النواة الأساسية للبنسلين (والعديد من المضادات الحيوية من نوع بيتا لاكتام لاحقًا)، ويمكن تعديله كيميائيًا بسهولة عن طريق إضافة سلاسل جانبية من خلال تفاعلات كيميائية. ^{[ 173 ] [ 174 ]} نُشر هذا الاكتشاف في مجلة نيتشر عام 1959. ^{[ 175 ]} وقد مهد هذا الطريق لأدوية جديدة ومحسّنة، حيث تُنتج جميع أنواع البنسلين شبه الاصطناعية من خلال المعالجة الكيميائية لـ 6-APA. ^{[ 176 ]}

تم إدخال الميثيسيلين، وهو مضاد حيوي من الجيل الثاني من فئة بيتا لاكتام شبه الاصطناعي ، والمصمم لمكافحة البنسلينازات المقاومة للجيل الأول، إلى المملكة المتحدة عام 1959. ولوحظت أشكال المكورات العنقودية الذهبية المقاومة للميثيسيلين ( MRSA) لأول مرة في المملكة المتحدة عام 1960، أي بعد أقل من عام. ومن المرجح أن سلالات MRSA كانت موجودة بالفعل لسنوات عديدة قبل إدخال الميثيسيلين. وقد أظهر هذا أن الأدوية الجديدة المصممة للتغلب على آليات المقاومة المعروفة قد تفقد فعاليتها بسبب التكيفات البكتيرية الناتجة عن الاستخدام الواسع النطاق لمضادات حيوية أخرى. ^{[ 177 ]}

أصبحت براءات اختراع البنسلين مصدر قلق وخلاف. كان تشين يرغب في التقدم بطلب للحصول على براءة اختراع، لكن فلوري اعترض، بحجة أن البنسلين يجب أن يعود بالنفع على الجميع. ^{[ 36 ]} استشار فلوري السير هنري ديل ، رئيس مجلس إدارة مؤسسة ويلكوم ترست وعضو اللجنة الاستشارية العلمية لمجلس الوزراء البريطاني ، وجون ويليام تريفان، مدير مختبر أبحاث ويلكوم ترست. في 26 و27 مارس 1941، التقى ديل وتريفان في كلية السير ويليام دان لعلم الأمراض بجامعة أكسفورد لمناقشة المسألة. نصح ديل بأن تسجيل براءة اختراع البنسلين سيكون غير أخلاقي. لم يثنِ ذلك تشين، فتوجه إلى السير إدوارد ميلانبي ، سكرتير مجلس البحوث الطبية آنذاك، الذي اعترض هو الآخر لأسباب أخلاقية. وكما اعترف تشين لاحقًا، فقد خاض "نقاشات حادة" مع ميلانبي، ^{[ 178 ] [ 179 ]} لكن قرار ميلانبي اعتُبر نهائيًا. ^{[ 180 ]}

في عام 1945، حصل موير على براءة اختراع لطرق إنتاج وعزل البنسلين. ^{[ 181 ] [ 182 ]} لم يتمكن من الحصول على براءات اختراع في الولايات المتحدة بصفته موظفًا في مختبر أبحاث النظائر الوطني (NRRL)، لكنه تقدم بطلبات للحصول على براءات اختراع لدى مكتب براءات الاختراع البريطاني. منح الترخيص لشركة أمريكية، هي شركة كوميرشال سولفنتس . ^{[ 181 ]} عندما علم فليمنج ببراءات الاختراع الأمريكية المتعلقة بإنتاج البنسلين، استشاط غضبًا وعلق قائلًا:

لقد وجدت البنسلين وقدمته مجاناً لمنفعة البشرية. فلماذا يصبح احتكاراً ربحياً للمصنعين في بلد آخر؟ ^{[ 183 ]}

أدى حصول الشركات الأمريكية على براءات اختراع لتقنيات متعلقة بالبنسلين إلى ظهور خرافة في المملكة المتحدة مفادها أن العلماء البريطانيين هم من قاموا بالعمل، لكن الأمريكيين هم من حصدوا المكافآت. ^{[ 181 ]} عندما نشرت مؤسسة روكفلر تقريرها السنوي عام 1944، قارنت صحيفة "إيفنينغ نيوز" بين دعم المؤسسة السخي لعمل فريق أكسفورد ودعم مجلس البحوث الطبية البخيل. ^{[ 184 ] [ 185 ]} في أبريل 1945، وقّعت شركة جلاكسو البريطانية اتفاقيات مع شركتي سكويب وميرك، بموجبها دفعت 5% كعائدات على مبيعاتها من البنسلين لمدة خمس سنوات مقابل استخدام تقنيات التخمير بالغمر العميق الخاصة بهما. دفعت شركة جلاكسو ما يقارب 500 ألف جنيه إسترليني ( ما يعادل 10.8 مليون جنيه إسترليني في عام 2025 ) كرسوم امتياز بين عامي 1946 و1956. ^{[ 180 ] [ 181 ]} أدى الجدل الدائر حول براءات الاختراع إلى تأسيس المؤسسة الوطنية البريطانية لتطوير البحوث (NRDC) في يونيو 1948. وقد جمعت هذه المؤسسة براءات الاختراع الحكومية وفرضت عليها رسوم امتياز. ^{[ 186 ]}

بعد انتشار خبر الخصائص العلاجية للبنسلين في افتتاحية صحيفة التايمز بتاريخ 27 أغسطس 1942، ^{[ 187 ]} استمتع فليمنج بالدعاية، بينما لم يكن هوارد فلوري كذلك، إذ خشي أن يُؤدي ذلك إلى زيادة الطلب على البنسلين الذي لم يكن مُضطرًا لتلبيته بعد. ^{[ 188 ]} وعندما وصل الصحفيون إلى مدرسة السير ويليام دان، أمر سكرتيره بطردهم. ^{[ 189 ]} كما منع فريقه من التحدث إلى الصحافة. ^{​​[ 36 ]} ونتج عن ذلك ارتباكٌ بسبب تسمية كلٍّ من عصارة العفن والدواء المُستخلص منها بالبنسلين . ^{[ 188 ]} ونُشرت وبُثت روايات مُشوَّهة وغير دقيقة تُنسب الفضل في تطوير البنسلين إلى فليمنج، وهي روايات لم يبذل فليمنج ومستشفى سانت ماري أي جهد يُذكر لتصحيحها. ^{[ 189 ] [ 190 ]} كانت القصة التي أرادت وسائل الإعلام سردها هي القصة المألوفة للعالم الوحيد والاكتشاف المصادفة. كتب المؤرخ الطبي البريطاني بيل بينوم لاحقًا:

يُعدّ اكتشاف البنسلين وتطويره مثالاً بارزاً على الحداثة: التباين بين فردٍ مُنتبه (فليمنج) يُجري ملاحظةً مُنعزلة، وبين استغلال هذه الملاحظة من خلال العمل الجماعي والتقسيم العلمي للعمل (فلوري وفريقه). كان الاكتشاف علماً قديماً، لكن الدواء نفسه استلزم أساليب جديدة في البحث العلمي. ^{[ 191 ]}

في عام ١٩٤٣، تلقت لجنة نوبل ترشيحًا واحدًا لجائزة نوبل في الطب أو علم وظائف الأعضاء لفليمنج وفلوري من عالم الكيمياء الحيوية البريطاني رودولف بيترز . أجرى سكرتير لجنة نوبل، جوران ليليستراند ، تقييمًا لفليمنج وفلوري في العام نفسه، ولكن نظرًا لقلة المعلومات المتوفرة عن البنسلين في السويد آنذاك، خلص إلى ضرورة الحصول على مزيد من المعلومات. في العام التالي، قُدِّم ترشيح واحد لفليمنج وحده، وترشيح آخر لفليمنج وفلوري وتشين. درس ليليستراند ونانا سفارتز ، أستاذة الطب في معهد كارولينسكا ، أعمالهم، وبينما رأى كلاهما أن فليمنج وفلوري يستحقان جائزة نوبل على حد سواء، انقسمت لجنة نوبل، وقررت منح الجائزة في ذلك العام لجوزيف إرلانجر وهربرت إس. جاسر "لاكتشافاتهما المتعلقة بالوظائف شديدة التمايز للألياف العصبية المفردة". ^{[ ١٩٢ ] [ ١٩٣ ]}

في عام ١٩٤٥، قُدِّم عدد كبير من الترشيحات لفلوري وفليمنج أو كليهما، وترشيح واحد لتشين من ليليستراند، الذي رشّح الثلاثة جميعًا. ^{[ ١٩٤ ]} لاحظ ليليستراند أن ثلاثة عشر ترشيحًا من أصل ستة عشر ترشيحًا وردت ذكرت فليمنج، لكن ثلاثة ترشيحات فقط ذكرته وحده. ^{[ ١٩٥ ]} هذه المرة، أجرى ليليستراند وسفين هيلرستروم وأندرس كريستنسون التقييمات ، وأيدوا الثلاثة جميعًا. ^{[ ١٩٣ ]}

انتشرت شائعات بأن اللجنة ستمنح الجائزة لفليمنج وحده، أو نصفها لفليمنج وربعها لكل من فلوري وتشين. وقد ضغط فولتون وديل لمنح الجائزة لفلوري. ^{[ 195 ]} وقد نظرت جمعية نوبل في معهد كارولينسكا في منح نصف الجائزة لفليمنج وربعها لكل من فلوري وتشين، لكنها قررت في النهاية تقسيمها بالتساوي بين الثلاثة. ^{[ 193 ]} وفي 25 أكتوبر 1945، أعلنت الجمعية أن فليمنج وفلوري وتشين تقاسموا بالتساوي جائزة نوبل في الطب أو علم وظائف الأعضاء لعام 1945 "لاكتشافهم البنسلين وتأثيره العلاجي في العديد من الأمراض المعدية". ^{[ 196 ] [ 197 ]} وعندما أعلنت صحيفة نيويورك تايمز أن "فليمنج وزميلين له" قد فازوا بالجائزة، طالب فولتون - وحصل على - تصحيح في افتتاحية اليوم التالي. ^{[ 198 ] [ 199 ] [ 200 ]}

حصلت دوروثي هودجكين على جائزة نوبل في الكيمياء عام 1964 "لإسهاماتها في تحديد هياكل مواد كيميائية حيوية مهمة باستخدام تقنيات الأشعة السينية"، وأبرزها البنسلين وفيتامين ب ₁₂ . ^{[ 201 ]} وأصبحت ثالث امرأة تحصل على جائزة نوبل في الكيمياء، بعد ماري كوري عام 1911 وإيرين جوليو كوري عام 1935. ^{[ 202 ]}

أدى النطاق المحدود للأمراض التي يمكن علاجها، أو ما يُعرف بـ"طيف فعالية" البنسلينات، إلى جانب ضعف فعالية البنسلين الخامس المُعطى عن طريق الفم، إلى البحث عن مشتقات من البنسلين قادرة على علاج نطاق أوسع من العدوى. وقد أتاح عزل 6-أمينوبروبيل أسيتيل بروبانول (6-APA) ، وهو النواة الأساسية للبنسلين، تحضير بنسلينات شبه اصطناعية، مع تحسينات عديدة مقارنةً بالبنزيل بنسلين . طُوّر الأمبيسيلين في مختبرات بيتشام للأبحاث في لندن. وعند طرحه للاستخدام السريري عام 1961، كان أول بنسلين شبه اصطناعي يُؤخذ عن طريق الفم وفعال ضد كل من البكتيريا سالبة الغرام وموجبة الغرام ، ^{[ 203 ]} بينما كان البنسلين الأصلي فعالاً فقط ضد البكتيريا موجبة الغرام. ^{[ 203 ]}

أسفرت عمليات التطوير اللاحقة عن إنتاج بنسلينات مقاومة لإنزيم بيتا لاكتاماز ، بما في ذلك فلوكلوكساسيلين ، وديكلوكساسيلين ، وميثيسيلين . وقد تميزت هذه البنسلينات بفعاليتها ضد أنواع البكتيريا المنتجة لإنزيم بيتا لاكتاماز، ولكنها لم تكن فعالة ضد سلالات المكورات العنقودية الذهبية المقاومة للميثيسيلين (MRSA). ^{[ 204 ]}

ومن التطورات الأخرى في سلسلة البنسلينات، البنسلينات المضادة للزائفة، مثل الكاربنیسیلین والتيكارسیلین والبيبيراسيلین ، المفيدة لفعاليتها ضد البكتيريا سالبة الغرام. وكانت أهمية حلقة بيتا لاكتام كبيرة لدرجة أن المضادات الحيوية ذات الصلة، بما في ذلك الميسيلينام والكاربابينيمات ، والأهم من ذلك السيفالوسبورينات ، لا تزال تحتفظ بها في مركز تركيبها. ^{[ 174 ] [ 205 ]}

أصبحت البنسلينات من نوع بيتا لاكتام أكثر المضادات الحيوية استخدامًا في العالم. ^{[ 206 ]} وكان الأموكسيسيلين والأمبيسيلين، وهما بنسلينات شبه اصطناعية طورتها مختبرات بيتشام للأبحاث ، ^{[ 207 ] [ 208 ]} أكثر المضادات الحيوية شيوعًا في الرعاية الخارجية في الولايات المتحدة في نهاية القرن العشرين، ^{[ 209 ]} وكان الأموكسيسيلين يُستخدم على نطاق واسع في طب الخنازير. ^{[ 210 ]} في أوائل القرن الحادي والعشرين، اختلفت تفضيلات المضادات الحيوية من بلد إلى آخر: ففي أوروبا، كان الأموكسيسيلين يُستخدم على نطاق واسع في المملكة المتحدة وألمانيا؛ بينما فضّلت فرنسا وإيطاليا وإسبانيا تركيبات واسعة الطيف مثل كو-أموكسيكلاف ؛ واعتمدت الدول الاسكندنافية على البنسلين الخامس ضيق الطيف. ^{[ 211 ]}

في عام 1940، أبلغ إرنست تشين وإدوارد أبراهام عن أول مؤشر على مقاومة المضادات الحيوية للبنسلين، وذلك من خلال سلالة من بكتيريا الإشريكية القولونية تنتج إنزيم البنسليناز ، القادر على تحليل البنسلين وإبطال مفعوله المضاد للبكتيريا. ^{[ 212 ] [ 31 ] [ 213 ]} وقد حدد تشين وأبراهام التركيب الكيميائي للبنسليناز، ونشرا النتائج في مجلة Nature على النحو التالي:

يُستنتج أن المادة الفعالة هي إنزيم من حقيقة أنها تتلف بالتسخين عند 90 درجة مئوية لمدة 5 دقائق وبالحضانة مع البابايين المنشط بسيانيد البوتاسيوم عند درجة حموضة 6، وأنها غير قابلة للغسيل الكلوي عبر أغشية السيلوفان . ^{[ 214 ]}

في محاضرته عند استلام جائزة نوبل، حذر فليمنج من احتمالية ظهور مقاومة البنسلين في الحالات السريرية:

قد يأتي وقتٌ يُصبح فيه البنسلين متاحًا للجميع في المتاجر. وحينها يكمن خطر أن يُعرّض الشخص الجاهل نفسه لجرعة غير كافية، مما قد يُؤدي إلى مقاومة ميكروباته للدواء نتيجة تعريضها لكميات غير قاتلة منه. ^{[ 215 ]}

في ذلك الوقت، كانت السموم وحدها تتطلب وصفة طبية، وكان العلاج الذاتي خيارًا واردًا. صدر تشريع في المملكة المتحدة عام ١٩٤٧ يُلزم بوصفة طبية للمضادات الحيوية، وتبعتها الولايات المتحدة عام ١٩٥١. ^{[ ٢١٦ ]} وفي أماكن أخرى من العالم، انتشر تصدير الأدوية الغربية بوتيرة أسرع من انتشار المعرفة والممارسات الطبية الغربية، وكثيرًا ما كان يُصرف البنسلين من قِبل ممارسي الطب التقليدي. ^{[ ٢١٧ ]} وفي عام ١٩٩٩، وجدت دراسة في المملكة المتحدة أن ٣٩٪ من المشاركين اعتقدوا خطأً أن المضادات الحيوية تُعالج نزلات البرد والإنفلونزا، وأن ١٢٪ اعتقدوا أنها العلاج الأمثل لهما. ^{[ ٢١٨ ]} كان لهذا الاعتقاد الخاطئ بالمضادات الحيوية عواقب وخيمة، إذ حوّل مكانة الأطباء إلى مجرد مُزوّدين للأدوية. ولجأ عدد أكبر من الناس إلى الرعاية الطبية لأمراض كانوا يتجاهلونها سابقًا، وكثيرًا ما طالبوا بالمضادات الحيوية. من جانبهم، أصبح الأطباء المرهقون أكثر استعداداً لتقديمها حتى لو لم يُطلب منهم ذلك. ^{[ 219 ]}

بحلول عام ١٩٤٢، طورت بعض سلالات المكورات العنقودية الذهبية مقاومة شديدة للبنسلين، وأصبحت العديد من السلالات مقاومة له بحلول ستينيات القرن العشرين. ^{[ ٢٢٠ ]} في عام ١٩٤٦، بدأت عالمة البكتيريا ماري باربر دراسةً حول مقاومة البنسلين من خلال الانتقاء الطبيعي في مستشفى هامرسميث بلندن. ووجدت أنه في عام ١٩٤٦، كانت سبع من كل ثماني حالات عدوى بكتيرية حساسة للبنسلين، ولكن بعد عامين، انخفضت هذه النسبة إلى ثلاث فقط. تعرضت الممرضات للبكتيريا والبنسلين، مما أدى إلى إصابتهن بالعدوى البكتيرية ونقلها. ووجدت باربر أن ثلاثًا من كل عشر طالبات في مجال التوليد كنّ مصابات بالبكتيريا عند وصولهن، وبعد ثلاثة أشهر، ارتفعت النسبة إلى سبع من كل عشر. تكمن المشكلة في ممارسات النظافة غير الدقيقة من قبل العاملين في مجال الرعاية الصحية، والممارسات الطبية السيئة مثل الاستخدام الوقائي للمضادات الحيوية، والممارسات الإدارية غير المسؤولة، مثل نقل الأطفال من أمهاتهم إلى حضانات المستشفيات الكبيرة حيث يمكن أن ينتقل العدوى بينهم. ^{[ ٢٢١ ]}

تم الإبلاغ عن حالات عدوى مقاومة للمضادات الحيوية في أستراليا عام ١٩٥٢. ^{[ ٢٢١ ]} وخلال جائحة الإنفلونزا ١٩٥٧-١٩٥٨، سُجِّلت ١٦٠٠٠ حالة وفاة في المملكة المتحدة و٨٠٠٠٠ حالة وفاة في الولايات المتحدة نتيجة مضاعفات بكتيرية؛ وتوفي ٢٨٪ من المصابين بالالتهاب الرئوي. وقد انتقلت معظم حالات الالتهاب الرئوي إلى المستشفيات، وكان العديد منها من سلالات مقاومة للمضادات الحيوية نشأت هناك. ^{[ ٢٢٢ ]} وفي عام ١٩٦٥، تم الإبلاغ عن أول حالة مقاومة للبنسلين في بكتيريا المكورات الرئوية (Streptococcus pneumoniae) في بوسطن. ^{[ ٢٢٣ ] [ ٢٢٤ ]} ومنذ ذلك الحين، طوّرت سلالات وأنواع أخرى من البكتيريا مقاومةً للمضادات الحيوية. ^{[ ٢١٢ ]}

أظهرت الأبحاث التي أجرتها مختبرات شركة أمريكان سياناميد في أواخر الأربعينيات وأوائل الخمسينيات من القرن العشرين أن إضافة البنسلين إلى علف الكتاكيت تزيد من زيادة وزنها بنسبة 10%. وظلت أسباب ذلك محل نقاش حتى القرن الحادي والعشرين. وأشارت أبحاث لاحقة إلى أن إضافة البنسلين إلى علف الحيوانات تُحسّن أيضًا من كفاءة تحويل العلف ، وتُعزز نموًا أكثر انتظامًا، وتُسهّل مكافحة الأمراض. وبعد أن وافقت إدارة الغذاء والدواء الأمريكية (FDA) على استخدام البنسلين كمضاف علفي للدواجن والماشية عام 1951، كثّفت شركات الأدوية إنتاجها لتلبية الطلب. ^{[ 225 ]}

بحلول عام 1954، كانت الولايات المتحدة تنتج 910 أطنان ( مليوني رطل) من المضادات الحيوية سنويًا، منها 220 طنًا (490 ألف رطل) تُستخدم في علف الحيوانات. وفي تسعينيات القرن الماضي، ارتفع إنتاج الولايات المتحدة إلى 23 ألف طن (50 مليون رطل) من المضادات الحيوية سنويًا، نصفها يُستخدم في تغذية الماشية. وظلت صناعة الدواجن المستهلك الأكبر، حيث استهلكت 4800 طن (10.5 مليون رطل) من المضادات الحيوية سنويًا، مقارنةً بـ 4700 طن (10.3 مليون رطل) للخنازير و 1700 طن (3.7 مليون رطل) للأبقار. وقدّرت دراسة أجراها مجلس العلوم والتكنولوجيا الزراعية عام 1981 أن حظر استخدامها في علف الحيوانات قد يُكلّف المستهلكين الأمريكيين ما يصل إلى 3.5 مليار دولار سنويًا (ما يعادل 12.39 مليار دولار في عام 2025 ) نتيجة ارتفاع أسعار المواد الغذائية. ^{[ 225 ]} كان الوضع مماثلاً في المملكة المتحدة، حيث استهلكت الحيوانات 44 في المائة من إنتاج المضادات الحيوية بحلول عام 1963. ^{[ 226 ]}                  

بحلول منتصف خمسينيات القرن العشرين، وردت تقارير في الولايات المتحدة تفيد بأن الحليب لا يتخثر لصنع الجبن. ووجدت إدارة الغذاء والدواء الأمريكية أن الحليب ملوث بالبنسلين، الذي كان يقضي على البكتيريا اللازمة لصناعة الجبن . وفي عام 1963، أفادت منظمة الصحة العالمية بوجود مستويات عالية من البنسلين في الحليب على مستوى العالم. وأصبح بإمكان الأشخاص الذين يعانون من حساسية البنسلين أن يصابوا برد فعل تحسسي من شرب الحليب. ^{[ 227 ]} وفي عام 1960، شُكّلت لجنة برئاسة اللورد نيثرثورب في المملكة المتحدة للتحقيق في استخدام المضادات الحيوية في علف الحيوانات. وفي عام 1962، أوصت اللجنة بتخفيف القيود المفروضة على استخدام المضادات الحيوية في الحيوانات. وزعمت أن فوائدها كبيرة، وأنه حتى في حال ظهور مقاومة لدى البكتيريا، سيتم تطوير مضادات حيوية جديدة قريبًا، وأنه لا يوجد دليل على أن مقاومة البكتيريا في الحيوانات تؤثر على صحة الإنسان. ^{[ 228 ] [ 229 ]}

قوضت الأبحاث الجديدة استنتاجات لجنة نيثرثورب حتى قبل نشرها، واستُدعيت اللجنة لإعادة النظر في المسألة عام ١٩٦٥. أظهرت دراسات جديدة أن البكتيريا لا تقتصر قدرتها على وراثة جينات مقاومة المضادات الحيوية فحسب، بل يمكنها أيضًا نقلها فيما بينها. ^{[ ٢٣٠ ]} في عام ١٩٦٧، تسببت سلالة متعددة المقاومة من بكتيريا الإشريكية القولونية في وفاة خمسة عشر طفلاً في المملكة المتحدة. حُظر استخدام المضادات الحيوية في الحيوانات لأغراض غير علاجية هناك عام ١٩٧١، وسرعان ما حذت حذوها العديد من الدول الأوروبية الأخرى. ^{[ ٢٣١ ]}

عندما انضمت السويد إلى الاتحاد الأوروبي عام ١٩٩٥، كان حظر استخدام مُحفزات نمو المضادات الحيوية ساريًا فيها منذ عشر سنوات. وكان من المقرر أن يُستبدل هذا الحظر بقواعد أكثر مرونة من الاتحاد الأوروبي ما لم تُقدم السويد أدلة علمية تُؤيد الحظر. تصدى عالمان سويديان، أندرس فرانكلين وكريستينا غريكو، وعالمان دنماركيان، فرانك آريستروب وهنريك فيغينر ، لهذا التحدي. وبدا أن فرص نجاحهم ضئيلة، لكن ذلك تزامن مع تفشي مرض جنون البقر في المملكة المتحدة ، مما أدى إلى ضغوط سياسية شديدة. في ديسمبر ١٩٩٦، صوتت اللجنة الدائمة للصحة والرعاية الاجتماعية في البرلمان الأوروبي لصالح حظر استخدام مُحفزات نمو المضادات الحيوية. وذهب الاتحاد الأوروبي أبعد من ذلك، وأوصى بفرض قيود واسعة النطاق على استخدام المضادات الحيوية. ^{[ ٢٣٢ ] [ ٢٣٣ ]} تم اعتماد هذه اللوائح في عام ٢٠١٩ ودخلت حيز التنفيذ في عام ٢٠٢٢. ^{[ ٢٣٤ ] [ ٢٣٥ ]}